三偏磷酸盐介质中酸性正铁肌红蛋白离解的热力学研究△
作者：屈小英 谢音* 陈庆年*
单位：武汉冶金科技大学化工系 武汉430062
关键词：三偏磷酸盐；正铁肌红蛋白；有效电荷
数理医药学杂志990124
摘 要 测定了三偏磷酸盐介质中酸性正铁肌红蛋白(MMb)离解的经验离解常数ka和实际离解常数Ka以及△H和△S。由于三偏磷酸盐与MMb中Fe(Ⅲ)的成键作用，降低了Fe(Ⅲ)的有效电荷，从而提高了MMb的抗氧化能力。
多磷酸盐对于正铁肌红蛋白氧化的影响是复杂的。虽然人们早已发现在多磷酸盐介质中正铁肌红蛋白的抗氧化能力明显增加，但对其原因还不清楚[1]，有关这方面的研究也未见报导。为此，我们对三偏磷酸盐与正铁肌红蛋白的相互作用进行了热力学研究，以便提供有价值的信息。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 试剂
马心正铁肌红蛋白(MMb)和三偏磷酸三钠(Na3P3O9)均由美国Sigma公司提供，MMb溶于5m.mol.L-1等浓度H2PO-4/HPO2-4缓冲溶液中，并在Sephadex G50柱(2.5×50cm)上用上述缓冲溶液洗提提纯。其它试剂为分析纯。
1.2 实验
预热(25℃)的MMb纯化溶液与缓冲溶液(磷酸盐和硼酸)及三偏磷酸盐混合后得到一系列溶液，其中MMb的浓度为0.1mmol*L-1，溶液的离子强度用三偏磷酸盐调节在0.05～0.40范围内。在上述各条件下，使用三至七种具有不同pH值的缓冲溶液，对应于MMb的中和范围在0.2至0.8之间。测定其pH值和吸收光谱(450nm<λ<750nm)(HP8452 diode-array分光光度计)，对于每种三偏磷酸盐价质和离子强度，MMb的酸性和碱性形式的吸收光谱分别在pH6.2和pH 11.6处记录。
, 百拇医药
1.3 推求PKa
正铁肌红蛋白在pH 6.0～13.0范围内稳定，在pH 9.0附近有酸式及碱式可逆平衡：
因水分子在正铁肌红蛋白Fe(Ⅲ)八面体配合物中的配位位置，故上式也可写成：
其中Z为有效电荷。上述平衡的平衡常数为：
, 百拇医药
(1)
令
(2)
用分光光度法测定C(Fe(Ⅲ)OH2+2)/C(Fe(Ⅲ)OH(Z-1)+)[2]的值，可得PKa。由Debye-Huckel对活度系数的定义可得：
(3)
式中I为离子强度。以PKa对I/(1+I)作图，外推至零处则得PKa。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 三偏磷酸盐介质中MMb酸离解的PKa与Fe(Ⅲ)的有效电荷
在25℃，用三偏磷酸盐调节的不同离子强度下测定的PKa与图1所示，用外推法得PKa为8.88±0.03。
图1 25℃时，三偏磷酸盐介质中MMb配位水的KPa与离子强度的变化关系
图1中直线的斜率即为(3)式中的(1-2Z)，由此可得Fe(Ⅲ)的有效电荷Z=+0.46±0.04。在氯化钠介质中人们已测得MMb中Fe(Ⅲ)的有效电荷为+1.9±0.3[3]，可见在三偏磷酸盐介质中Fe(Ⅲ)的有效电荷明显降低。
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图2 三偏磷酸盐介质(离子强度为0.16)中MMb配位水的PKa对温度的依赖关系
2.2 三偏磷酸盐介质中MMb配位水酸离解的△H和△S
在三偏磷酸盐介质(离子强度为0.16)中，测定了MMb配位水在10.0、20.0、25.0、30.0℃下的PKa值，此PKa值与(1)/(T)的关系如图2所示。由直线的斜率和截距及PKa=2.303R((△H)/(T)-△S)可得出MMb配位水酸离解的△H为31±2KJ*mol-1，△S为64±6J*mol*k\+\{-1\}。在氯化钠介质中，MMb配位水酸离解的△H和△S分别为34KJ*mol\+\{-1\}和-54J*mol*k-1[3]，可见在三偏磷酸盐介质中，MMb配位水酸离解的△S显著增加。这说明负电荷较高的三偏磷酸根与血红蛋白空腔Fe(Ⅲ)中心有一种成键作用，中和了Fe(Ⅲ)的有效正电荷。由于肌红蛋白空腔中铁离子的正电荷越高，肌红蛋白越容易被氧化[4]，故可认为在三偏磷酸盐介质中，由于MMb中Fe(Ⅲ)的有效电荷的降低，增强了MMb的抗氧化能力。
, 百拇医药
△ 该文主体部分在丹麦完成
* 湖北医科大学基础医学院
参考文献
[1]Ang CYW, Young LL, J.Food.Sci,1984,54,1151.
[2]George P, Hanania G, Biochem J, 1952,52,517.
[3]Andersen H, Bertelsen G, et al. Acta Chem Scand Ser, 1988,A42,226.
[4]Anni Mikkelsen and Leif H.skibsted, Kinetics of enzymatic reduction of metmyoglobin in relation to oxygen activation in meat products, Z Lebensm Unters Forsch,1992,194,9～16.
收稿日期：1998-09-19, http://www.100md.com(屈小英 谢音* 陈庆年*)
单位：武汉冶金科技大学化工系 武汉430062
关键词：三偏磷酸盐；正铁肌红蛋白；有效电荷
数理医药学杂志990124
摘 要 测定了三偏磷酸盐介质中酸性正铁肌红蛋白(MMb)离解的经验离解常数ka和实际离解常数Ka以及△H和△S。由于三偏磷酸盐与MMb中Fe(Ⅲ)的成键作用，降低了Fe(Ⅲ)的有效电荷，从而提高了MMb的抗氧化能力。
多磷酸盐对于正铁肌红蛋白氧化的影响是复杂的。虽然人们早已发现在多磷酸盐介质中正铁肌红蛋白的抗氧化能力明显增加，但对其原因还不清楚[1]，有关这方面的研究也未见报导。为此，我们对三偏磷酸盐与正铁肌红蛋白的相互作用进行了热力学研究，以便提供有价值的信息。
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1 材料与方法
1.1 试剂
马心正铁肌红蛋白(MMb)和三偏磷酸三钠(Na3P3O9)均由美国Sigma公司提供，MMb溶于5m.mol.L-1等浓度H2PO-4/HPO2-4缓冲溶液中，并在Sephadex G50柱(2.5×50cm)上用上述缓冲溶液洗提提纯。其它试剂为分析纯。
1.2 实验
预热(25℃)的MMb纯化溶液与缓冲溶液(磷酸盐和硼酸)及三偏磷酸盐混合后得到一系列溶液，其中MMb的浓度为0.1mmol*L-1，溶液的离子强度用三偏磷酸盐调节在0.05～0.40范围内。在上述各条件下，使用三至七种具有不同pH值的缓冲溶液，对应于MMb的中和范围在0.2至0.8之间。测定其pH值和吸收光谱(450nm<λ<750nm)(HP8452 diode-array分光光度计)，对于每种三偏磷酸盐价质和离子强度，MMb的酸性和碱性形式的吸收光谱分别在pH6.2和pH 11.6处记录。
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1.3 推求PKa
正铁肌红蛋白在pH 6.0～13.0范围内稳定，在pH 9.0附近有酸式及碱式可逆平衡：
因水分子在正铁肌红蛋白Fe(Ⅲ)八面体配合物中的配位位置，故上式也可写成：
其中Z为有效电荷。上述平衡的平衡常数为：
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(1)
令
(2)
用分光光度法测定C(Fe(Ⅲ)OH2+2)/C(Fe(Ⅲ)OH(Z-1)+)[2]的值，可得PKa。由Debye-Huckel对活度系数的定义可得：
(3)
式中I为离子强度。以PKa对I/(1+I)作图，外推至零处则得PKa。
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2 结果与讨论
2.1 三偏磷酸盐介质中MMb酸离解的PKa与Fe(Ⅲ)的有效电荷
在25℃，用三偏磷酸盐调节的不同离子强度下测定的PKa与图1所示，用外推法得PKa为8.88±0.03。
图1 25℃时，三偏磷酸盐介质中MMb配位水的KPa与离子强度的变化关系
图1中直线的斜率即为(3)式中的(1-2Z)，由此可得Fe(Ⅲ)的有效电荷Z=+0.46±0.04。在氯化钠介质中人们已测得MMb中Fe(Ⅲ)的有效电荷为+1.9±0.3[3]，可见在三偏磷酸盐介质中Fe(Ⅲ)的有效电荷明显降低。
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图2 三偏磷酸盐介质(离子强度为0.16)中MMb配位水的PKa对温度的依赖关系
2.2 三偏磷酸盐介质中MMb配位水酸离解的△H和△S
在三偏磷酸盐介质(离子强度为0.16)中，测定了MMb配位水在10.0、20.0、25.0、30.0℃下的PKa值，此PKa值与(1)/(T)的关系如图2所示。由直线的斜率和截距及PKa=2.303R((△H)/(T)-△S)可得出MMb配位水酸离解的△H为31±2KJ*mol-1，△S为64±6J*mol*k\+\{-1\}。在氯化钠介质中，MMb配位水酸离解的△H和△S分别为34KJ*mol\+\{-1\}和-54J*mol*k-1[3]，可见在三偏磷酸盐介质中，MMb配位水酸离解的△S显著增加。这说明负电荷较高的三偏磷酸根与血红蛋白空腔Fe(Ⅲ)中心有一种成键作用，中和了Fe(Ⅲ)的有效正电荷。由于肌红蛋白空腔中铁离子的正电荷越高，肌红蛋白越容易被氧化[4]，故可认为在三偏磷酸盐介质中，由于MMb中Fe(Ⅲ)的有效电荷的降低，增强了MMb的抗氧化能力。
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△ 该文主体部分在丹麦完成
* 湖北医科大学基础医学院
参考文献
[1]Ang CYW, Young LL, J.Food.Sci,1984,54,1151.
[2]George P, Hanania G, Biochem J, 1952,52,517.
[3]Andersen H, Bertelsen G, et al. Acta Chem Scand Ser, 1988,A42,226.
[4]Anni Mikkelsen and Leif H.skibsted, Kinetics of enzymatic reduction of metmyoglobin in relation to oxygen activation in meat products, Z Lebensm Unters Forsch,1992,194,9～16.
收稿日期：1998-09-19, http://www.100md.com(屈小英 谢音* 陈庆年*)