如何搞好凝血酶原测定的质量控制
作者：顾洪璋
单位：顾洪璋(江苏省中医院 南京210029)
关键词：凝血酶原；敏感指数；国际标准化比值
990356
摘 要 凝血酶原测定是外源性凝血系统很重要的一个过筛试验，但PT测定受许多因素影响，说明方法亟待规范化和标准化。我科多年逐步建立的规范化和标准化的做法提高了PT测定的正确性与可靠性。
1 凝血酶原测定
1.1 原理 在受检者的血浆中加入过量的凝血活酶和钙离子使凝血活酶转变为凝血酶再使纤维旦原转变为纤维蛋白以观察血浆凝固所需的时间。
1.2 试剂 凝血活酶试剂为卫生部临检中心认可；0.025mol/L氯化钙溶液；109mmol/L枸橼酸钠溶液。
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1.3 方法
1.3.1 用硅化试管或塑料试管内加枸橼酸钠抗凝剂0.2ml加患者血1.8ml充分混合后以2000～2500Xg/min离心10min取上层无血小板血浆备用。
1.3.2 取试管一支加入血浆和凝血活酶各0.1ml混合孵育30s然后加氯化钙0.1ml立即开动秒表不断轻轻倾斜试管记录液体停止流动所需的时间，重复二次取平均值。
1.3.3 用同样方法测定正常人血浆为对照。
1.4 报告
以秒报告，正常参考值为12±1s；以PT比值(PTR)正常参考值为1.00±0.05,PTR=患者测定时间/正常人测定时间；以国际标准化比值(INI)正常参考值因ISI而异，INI=PTR。表1为卫生部临检中心在94年对我国部分实验室进行PT测定的调查结果。
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表1 94年我国部分实验室的PT测定调查结果
X
S
CV%
最高值
(S)
最低值
(S)
各室日常用凝血活酶和正常血浆
13.3
2.01
15
18.8
, 百拇医药
9.25
各室日常用凝血活酶和参比血浆
14.6
2.88
19.3
25.45
8.4
卫生部凝血活酶和正常血浆
15.6
3.06
19.78
25.3
10.0
, 百拇医药
卫生部凝血活酶和参比血浆
16.51
3.69
22.3
26.1
10.1
从表1中可以看到，所测的结果最高值和最低值相差2倍至3倍，用相同的试剂和相同的参比血浆可相差2.5倍，说明方法亟待规范化和标准化。为此，我国有关血液方面的专家多次开会研究，就如何才能解决凝血酶原测定的质量问题做了很多的工作，使我国在凝血酶原的质量方面提高了一步。但直到现在还没有一个规范化和标准化的方法，严重影响PT测定在临床上的应用。为此，把我科如何做好PT测定的一些做法介绍给同道，希能在PT测定的质量方面有所帮助。
2 标本采集标准化
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2.1 采血所用的注射器用硅化或塑料注射器。
2.2 选用109mmol/L枸橼酶钠和血的比例为1∶9。
2.3 取血时针头不得小于21号，拉针栓的速度慢而均匀使血平稳地进入到注射器内防止气泡的产生(可导致纤维旦原和因子V，V11变性)。一旦取血完成，取下针头将针筒头贴靠在试管壁慢慢注入到试管内(要用塑料有刻度带塞的试管)颠倒混合10次，不能用力振摇。
2.4 在一小时内分离出血浆，离心的转速为2000～2500Xg/min。
2.5 尽量缩短采血至实验前标本放置的时间。
2.6 采做凝血实验的标本不能和其它实验一起采集，否则在分装时，血液停留在针筒内时间过长致使凝血因子损失。
, http://www.100md.com 2.7 不能从输液管内取血，因为这样标本内常含小凝块和污染组织液，有时还可混有输液中的药物(如肝素)，导致凝血时间不应有的延长。
2.8 血液的压积要按公式调整抗凝剂的用量：抗凝剂量(ml)=(100-HCT)×血液量ml×0.00185[1]。
3 测定时条件标准化
3.1 温度控制在36.5～38℃。
3.2 在实验时加入血浆，凝血活酶孵育时间不超过30S。
3.3 所有的试剂必须预温但时间不能超过30min。
3.4 每份标本需重复2次求其平均值。
3.5 血浆加入全部试剂混合后PH必须在7.2～7.4。
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3.6 所有的试剂必须用正常和异常参比血浆进行试验。
4 质量控制
4.1 每次工作开始时，要用质控物进行核对，可避免实验室操作所造成的误差。
4.2 正常人血浆(作正常对照用)，取20个以上健康人的血(采血方法、容器、抗凝剂等均和取患者血相同)分离出血浆混合后分装在小瓶内，置-75℃冰箱内备用。
4.3 可用临床化学法室内质控图，每次将上述质控物所测的结果点在质控图上，并用短线连接各点，这样对质量的好坏一目了然。
4.4 重复试验的变异系数，同份标本测定二次，其差值大小可用来评价分析系统的批内精密度，其CV不得>5%。
4.5 试剂质量是获得可靠性结果的先决条件，最好购买卫生部认可的或已形成规模的厂家，试剂稳定性、重复性好，同时有国际敏感指数(SIS)。
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4.6 标准化是质量控制的重要组成部分，由于设备条件方面的限制，为了使结果在同一实验室不同时期具有可比性，就要使用参比血浆。
4.7 必须积极参加临检中心组织的室间质评活动，以便及时了解本单位PT测定的准确性。
5 造成结果不准确的原因
5.1 血液注入到抗凝管内的血过多或不足(血和抗凝剂的比例不对)。
5.2 红细胞压积<20%、>55%时未校正抗凝剂的用量。
5.3 用了不适合的抗凝剂或抗凝剂浓度不正确。
用枸橼酸钠抗凝剂和草酸钠抗凝剂在PT测定中，我们也做了对比结果如下：
在门诊健康体检时取10人的血，分别用草酸钠抗凝剂(1.34g溶解在100ml水中)0.2ml加血1.8ml。另一管加枸橼酸钠0.2ml加血1.8ml在同等条件下分别在一小时和三小时做PT测定，见表2。
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表2 枸橼酸钠、草酸钠抗凝剂的PT测定试验
一小时
X±SD
三小时
X±SD
枸橼酸钠抗凝剂
12.1±1.0
12.2±1.2
草酸钠抗凝剂
12.2±0.8
14.4±1.0
上述实验证明，枸橼酸钠抗凝剂优于草酸钠抗凝剂。一小时的结果无明显差异，在三小时的结果枸橼酸钠和一小时的结果无明显差异，但草酸钠抗凝剂和一小时、三小时枸橼酸钠抗凝剂的结果相比延长2～3S。
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5.4 用已凝固(有时肉眼看不到的微小凝块)或溶血的标本。
5.5 凝血活酶复溶后超过规定的时间或试剂已过有效期。
5.6 凝血活酶复溶时稀释剂加的量不准确。
5.7 在实验中由于孵育时间温度加的量不正确。
5.8 血浆混浊黄疸高血症可影响结果。
5.9 急性炎症可使纤维蛋白原升高，PT测定的结果缩短。
5.10 取血后未在一小时内分离出血浆，实验未在二小时内做完(特别是在夏天)，从而影响PT的结果。
参考文献
1 丛玉隆等主编.今日临床检验学.第一版.北京：中国科学技术出版社，1997，124～133.
收稿日期：1998-10-12, 百拇医药
单位：顾洪璋(江苏省中医院 南京210029)
关键词：凝血酶原；敏感指数；国际标准化比值
990356
摘 要 凝血酶原测定是外源性凝血系统很重要的一个过筛试验，但PT测定受许多因素影响，说明方法亟待规范化和标准化。我科多年逐步建立的规范化和标准化的做法提高了PT测定的正确性与可靠性。
1 凝血酶原测定
1.1 原理 在受检者的血浆中加入过量的凝血活酶和钙离子使凝血活酶转变为凝血酶再使纤维旦原转变为纤维蛋白以观察血浆凝固所需的时间。
1.2 试剂 凝血活酶试剂为卫生部临检中心认可；0.025mol/L氯化钙溶液；109mmol/L枸橼酸钠溶液。
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1.3 方法
1.3.1 用硅化试管或塑料试管内加枸橼酸钠抗凝剂0.2ml加患者血1.8ml充分混合后以2000～2500Xg/min离心10min取上层无血小板血浆备用。
1.3.2 取试管一支加入血浆和凝血活酶各0.1ml混合孵育30s然后加氯化钙0.1ml立即开动秒表不断轻轻倾斜试管记录液体停止流动所需的时间，重复二次取平均值。
1.3.3 用同样方法测定正常人血浆为对照。
1.4 报告
以秒报告，正常参考值为12±1s；以PT比值(PTR)正常参考值为1.00±0.05,PTR=患者测定时间/正常人测定时间；以国际标准化比值(INI)正常参考值因ISI而异，INI=PTR。表1为卫生部临检中心在94年对我国部分实验室进行PT测定的调查结果。
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表1 94年我国部分实验室的PT测定调查结果
X
S
CV%
最高值
(S)
最低值
(S)
各室日常用凝血活酶和正常血浆
13.3
2.01
15
18.8
, 百拇医药
9.25
各室日常用凝血活酶和参比血浆
14.6
2.88
19.3
25.45
8.4
卫生部凝血活酶和正常血浆
15.6
3.06
19.78
25.3
10.0
, 百拇医药
卫生部凝血活酶和参比血浆
16.51
3.69
22.3
26.1
10.1
从表1中可以看到，所测的结果最高值和最低值相差2倍至3倍，用相同的试剂和相同的参比血浆可相差2.5倍，说明方法亟待规范化和标准化。为此，我国有关血液方面的专家多次开会研究，就如何才能解决凝血酶原测定的质量问题做了很多的工作，使我国在凝血酶原的质量方面提高了一步。但直到现在还没有一个规范化和标准化的方法，严重影响PT测定在临床上的应用。为此，把我科如何做好PT测定的一些做法介绍给同道，希能在PT测定的质量方面有所帮助。
2 标本采集标准化
, 百拇医药
2.1 采血所用的注射器用硅化或塑料注射器。
2.2 选用109mmol/L枸橼酶钠和血的比例为1∶9。
2.3 取血时针头不得小于21号，拉针栓的速度慢而均匀使血平稳地进入到注射器内防止气泡的产生(可导致纤维旦原和因子V，V11变性)。一旦取血完成，取下针头将针筒头贴靠在试管壁慢慢注入到试管内(要用塑料有刻度带塞的试管)颠倒混合10次，不能用力振摇。
2.4 在一小时内分离出血浆，离心的转速为2000～2500Xg/min。
2.5 尽量缩短采血至实验前标本放置的时间。
2.6 采做凝血实验的标本不能和其它实验一起采集，否则在分装时，血液停留在针筒内时间过长致使凝血因子损失。
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2.8 血液的压积要按公式调整抗凝剂的用量：抗凝剂量(ml)=(100-HCT)×血液量ml×0.00185[1]。
3 测定时条件标准化
3.1 温度控制在36.5～38℃。
3.2 在实验时加入血浆，凝血活酶孵育时间不超过30S。
3.3 所有的试剂必须预温但时间不能超过30min。
3.4 每份标本需重复2次求其平均值。
3.5 血浆加入全部试剂混合后PH必须在7.2～7.4。
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3.6 所有的试剂必须用正常和异常参比血浆进行试验。
4 质量控制
4.1 每次工作开始时，要用质控物进行核对，可避免实验室操作所造成的误差。
4.2 正常人血浆(作正常对照用)，取20个以上健康人的血(采血方法、容器、抗凝剂等均和取患者血相同)分离出血浆混合后分装在小瓶内，置-75℃冰箱内备用。
4.3 可用临床化学法室内质控图，每次将上述质控物所测的结果点在质控图上，并用短线连接各点，这样对质量的好坏一目了然。
4.4 重复试验的变异系数，同份标本测定二次，其差值大小可用来评价分析系统的批内精密度，其CV不得>5%。
4.5 试剂质量是获得可靠性结果的先决条件，最好购买卫生部认可的或已形成规模的厂家，试剂稳定性、重复性好，同时有国际敏感指数(SIS)。
, http://www.100md.com
4.6 标准化是质量控制的重要组成部分，由于设备条件方面的限制，为了使结果在同一实验室不同时期具有可比性，就要使用参比血浆。
4.7 必须积极参加临检中心组织的室间质评活动，以便及时了解本单位PT测定的准确性。
5 造成结果不准确的原因
5.1 血液注入到抗凝管内的血过多或不足(血和抗凝剂的比例不对)。
5.2 红细胞压积<20%、>55%时未校正抗凝剂的用量。
5.3 用了不适合的抗凝剂或抗凝剂浓度不正确。
用枸橼酸钠抗凝剂和草酸钠抗凝剂在PT测定中，我们也做了对比结果如下：
在门诊健康体检时取10人的血，分别用草酸钠抗凝剂(1.34g溶解在100ml水中)0.2ml加血1.8ml。另一管加枸橼酸钠0.2ml加血1.8ml在同等条件下分别在一小时和三小时做PT测定，见表2。
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表2 枸橼酸钠、草酸钠抗凝剂的PT测定试验
一小时
X±SD
三小时
X±SD
枸橼酸钠抗凝剂
12.1±1.0
12.2±1.2
草酸钠抗凝剂
12.2±0.8
14.4±1.0
上述实验证明，枸橼酸钠抗凝剂优于草酸钠抗凝剂。一小时的结果无明显差异，在三小时的结果枸橼酸钠和一小时的结果无明显差异，但草酸钠抗凝剂和一小时、三小时枸橼酸钠抗凝剂的结果相比延长2～3S。
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5.4 用已凝固(有时肉眼看不到的微小凝块)或溶血的标本。
5.5 凝血活酶复溶后超过规定的时间或试剂已过有效期。
5.6 凝血活酶复溶时稀释剂加的量不准确。
5.7 在实验中由于孵育时间温度加的量不正确。
5.8 血浆混浊黄疸高血症可影响结果。
5.9 急性炎症可使纤维蛋白原升高，PT测定的结果缩短。
5.10 取血后未在一小时内分离出血浆，实验未在二小时内做完(特别是在夏天)，从而影响PT的结果。
参考文献
1 丛玉隆等主编.今日临床检验学.第一版.北京：中国科学技术出版社，1997，124～133.
收稿日期：1998-10-12, 百拇医药