血小板表面相关抗体测定及临床意义
作者：顾洪璋
单位：顾洪璋(江苏省中医院 南京210029)
关键词：
数理医药学杂志000318
中图分类号：R 558+.2 文献标识码：B
文章编号：1004-4337(2000)03-0220-02
我科开展了血小板表面相关抗体的测定已多年，最近对40例健康成人和48例原发性血小板产减少性紫癜(ITP)患者测定了血小板表面相抗体，作了统计学处理，ITP患者血小板表面相关抗体值明显高于健康人P<0.01，对ITP的诊断有着极为重要的意义，值得推广和使用。
1 原理
, http://www.100md.com
先将抗体血清包被在微量反应板上，再加入病人的血小板溶解液，如果被检样品血小板表面有IgG、IgA、IgM和C3则会和包被上的抗体形成抗原抗体复合物，再加入酶联抗血清进行固相放大，最后在底物还原下显色，其颜色的深浅与血小板表面的相关抗体量成正比，测定其显色的值，以测定所得之值再查标准曲线表，可得测定标本中血小板表面相关的抗体的含量。
2 材料和方法
2.1 材料 5% EDTANa2水溶液；pH7.2 EDTA-Tris缓冲液；1%草酸铵溶液；0.1mol/L pH7.4 PBS缓冲液；pH7.4 tris-吐温缓冲液；pH9.6碳酸盐缓冲液；11% Triton水溶液；1% 牛血清白蛋白水溶液；显色剂(临用前配制)：0.1mol/L 枸橡酸48ml,0.2mol/L Na2HPO4 51.4ml，邻苯二胺10mg,3%H2O2 10微升；终止液：2mol/L H2SO4；抗体血清；酶联抗体；标准血清。
, 百拇医药
2.2 方法
2.2.1 血小板制备 ① 于塑料试管内加入5% EDTA 0.5ml，静脉取血4.5ml混合；②800转/分离心10分钟，吸取富血小板血浆(PRP)于另一支塑料试管内(尽量避免将红细胞吸入)；3000转/分离心10分钟丢弃上层血浆，下层为血小板，先加1～2滴1%草酸铵用小塑棒轻轻将沉淀物研散，再加1%草酸铵约2ml，静止5分钟(使红细胞溶解)，3000转/分离心10分钟，倒尽溶液；③用血小板洗涤液(pH7.4 EDTA-Tris缓冲液)4～5ml洗血小板，3000转/分离心10钟，倒尽溶液，重复四次，最后一次将试管倒置在滤纸上吸干液体；④洗涤后的血小板加1ml含有1%BSA的pH7.4 PBS稀释，计数血小板(万/ul)，通常在5～50万/ul(血小板数超过50万/ul，不用进一步稀释)；血小板数太少，可用0.5ml稀释液；⑤在1ml血小板悬液内，加入0.1ml 11% Triton；⑥置4℃冰箱内10分钟，使血小板彻底溶解成澄清溶液，以4000转/分离心10分钟；⑦吸上清液置另一试内待测。
, 百拇医药
2.2.2 包被 将纯化抗体以pH9.6碳酸盐缓冲液稀释到工作浓度，加入到反应板，每孔0.1ml，放37℃3小时，再放置4℃过夜，第二天弃去孔内液体，以Tris-吐温缓冲液洗三次，立即测定(或干燥后密封在塑料袋内，低温保存可用半年)。
2.2.3 加样 在已包被的微孔中加入0.1ml血小板溶解液，放37℃ 1.5小时，再用Tris-吐温洗三次。
2.2.4 加酶联抗体 每孔加入工作浓度酶联抗体0.1ml(用含1%BSA的pH7.4 PBS稀释)放37℃1小时，以Tris-吐温洗三次。
2.2.5 加显色剂 每孔加新鲜配制显色剂0.1ml，放避光室温反应20分钟。
2.2.6 加终止液 每孔加0.1ml 2mol/L H2SO4。
, 百拇医药
2.2.7 比色 用酶标仪比色，波长492nm，以显色剂0.1ml，终止液0.1ml为空白调零，测定每孔的光密度。
标准曲线的制备，用同样的方法测定不同稀释倍数已知标准血清中各含量的光密。以不同浓度的标准含量为横座标，以相对测定的光密度为纵座标，在半对数纸上画出标准曲线，然后根据待测标本的光密度(OD)值求出其含量。
3 40例正常人血小板表面相关抗体测定
3.1 对象 健康成人40例，年龄20～52岁，其中女性15例，男性25例，血小板数在100～250×109/L。
3.2 条件 ①所用的注射器、试管、器具均为塑料制品；②严格按操作规程进行，每个标本做双孔，求平均值；③每次测定均同时做标准对照。
表1 40例正常人血小板表面相关抗体测定结果 性别
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例数
抗体
测定结果(ng/107PLT)
±SD
IgG
0.3～29.9
5.43±7.04
IgA
4.3～18.5
9.91±4.78
男
25
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IgM
0.4～13.4
6.67±4.23
C3
3.8～41.2
15.25±8.5
IgG
0.3～28.1
5.21±5.87
IgA
2.6～18.5
7.99±6.06
, 百拇医药
女
15
IgM
1.0～13.4
7.50±3.87
C3
2.2～38.5
17.4±10.5
从表1可以看出血小板表面抗体含量男女之间基本无差异(P>0.05)。4 48例ITP血小板表面相关抗体测定
4.1 病例选择 慢性ITP48例，其中男16例，女34例，年龄11～52岁，ITP诊断符合下列标准：有出血症状伴外围血小板减少，骨髓巨核细胞数增多或正常伴有成熟障碍，无明显脾肿大，无结缔组织及其它继发性血小板减少症。
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表2 48例ITP患者血小板表面相关抗体测定结果
项 目
男
女
例
数
百分率
结果
(ng/107PLT)
例
数
百分率
结果
, http://www.100md.com
(ng/107PLT)
PIgG
11
68.7
55～181
21
65.7
31.3～46.1
PIgA
5
31.2
23～77.7
, 百拇医药 7
21.0
19.9～151
PIgM
3
18
17～303
6
16.0
18～168.5
PIgG、A、M
1
6.3
, 百拇医药
1
3.1
PIgG、A
1
6.3
1
3.1
PIgG、M
1
6.3
1
3.1
C3
, 百拇医药
0
2
6.2
127～374
总数
16
32
5 结果
我们测定了48例ITP的血小板表面相抗体，阳性率89%，其数值明显高于正常，P<0.01，故血小板表面相关抗体测定对ITP的诊断，有着重要的价值。
5.1 从我室对48例ITP测定血小板表面相关抗体的结果来看，阳性率的频度PIgG>PIgA>PIgM>C3。
, 百拇医药
5.2 从我室对48例ITP患者测定血小板表面相关抗体，可见PIgG+PIgA+PIgM或PIgG+PIgA或PIgG+PIgM同时增高的混合型。
5.3 从我室对48例ITP患者测定血小板表面相关抗体来看，PIgG增高的约占70%左右，其它增高的(PIgA，PIgM，C3)约占30%，故测定血小板表面相关抗体时宜PIgG、PIgA、PIgM、C3同时测定以免漏诊。
6 讨论
血小板免疫抗体可分两类，即同种免疫抗体和自身免疫抗体[1]。
同种免疫抗体是由血小板血型不合的输血，母子血小板血型不合的妊娠及组织移植产生的，这种抗体主要存在于病人的血清中，一般采用测定血清中的抗体。自体抗体是针对自身血小板的抗体，是由于不同原因使肌体免疫功能紊乱而产生的自身抗体，主要见于ITP血小板抗体主要是PIgG，少数是PIgA、PIgM，有时还可见PIgG+PIgA+PIgM和PIgG+PIgA或PIgG+PIgM的混合型。
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自身免疫抗体大多结合在血小板表面，一般采用酶联双抗体夹心试验来测定血小板表面的相关抗体，我们体会本法比较灵敏可靠的，多数学者认为血小板抗体是病理性免疫反应所产生的特异性血小板抗体，这种抗体结合在血小板表面，结合了抗体的血小板在单核-吞噬系统破坏加速，从而导致血小板减少[2]。
测定血小板表面相关抗体，不但有助于ITP的诊断，指导临床治疗，还可鉴别其它血小板减少症，对ITP患者的诊断有一定的帮助。
参考文献
1，王鸿利等.血液病的临床检验.上海科技出版社，1984，6.
2，徐静山等.江苏省血液病学.1984，4.
收稿日期：1999-09-01, http://www.100md.com
单位：顾洪璋(江苏省中医院 南京210029)
关键词：
数理医药学杂志000318
中图分类号：R 558+.2 文献标识码：B
文章编号：1004-4337(2000)03-0220-02
我科开展了血小板表面相关抗体的测定已多年，最近对40例健康成人和48例原发性血小板产减少性紫癜(ITP)患者测定了血小板表面相抗体，作了统计学处理，ITP患者血小板表面相关抗体值明显高于健康人P<0.01，对ITP的诊断有着极为重要的意义，值得推广和使用。
1 原理
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先将抗体血清包被在微量反应板上，再加入病人的血小板溶解液，如果被检样品血小板表面有IgG、IgA、IgM和C3则会和包被上的抗体形成抗原抗体复合物，再加入酶联抗血清进行固相放大，最后在底物还原下显色，其颜色的深浅与血小板表面的相关抗体量成正比，测定其显色的值，以测定所得之值再查标准曲线表，可得测定标本中血小板表面相关的抗体的含量。
2 材料和方法
2.1 材料 5% EDTANa2水溶液；pH7.2 EDTA-Tris缓冲液；1%草酸铵溶液；0.1mol/L pH7.4 PBS缓冲液；pH7.4 tris-吐温缓冲液；pH9.6碳酸盐缓冲液；11% Triton水溶液；1% 牛血清白蛋白水溶液；显色剂(临用前配制)：0.1mol/L 枸橡酸48ml,0.2mol/L Na2HPO4 51.4ml，邻苯二胺10mg,3%H2O2 10微升；终止液：2mol/L H2SO4；抗体血清；酶联抗体；标准血清。
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2.2 方法
2.2.1 血小板制备 ① 于塑料试管内加入5% EDTA 0.5ml，静脉取血4.5ml混合；②800转/分离心10分钟，吸取富血小板血浆(PRP)于另一支塑料试管内(尽量避免将红细胞吸入)；3000转/分离心10分钟丢弃上层血浆，下层为血小板，先加1～2滴1%草酸铵用小塑棒轻轻将沉淀物研散，再加1%草酸铵约2ml，静止5分钟(使红细胞溶解)，3000转/分离心10分钟，倒尽溶液；③用血小板洗涤液(pH7.4 EDTA-Tris缓冲液)4～5ml洗血小板，3000转/分离心10钟，倒尽溶液，重复四次，最后一次将试管倒置在滤纸上吸干液体；④洗涤后的血小板加1ml含有1%BSA的pH7.4 PBS稀释，计数血小板(万/ul)，通常在5～50万/ul(血小板数超过50万/ul，不用进一步稀释)；血小板数太少，可用0.5ml稀释液；⑤在1ml血小板悬液内，加入0.1ml 11% Triton；⑥置4℃冰箱内10分钟，使血小板彻底溶解成澄清溶液，以4000转/分离心10分钟；⑦吸上清液置另一试内待测。
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2.2.2 包被 将纯化抗体以pH9.6碳酸盐缓冲液稀释到工作浓度，加入到反应板，每孔0.1ml，放37℃3小时，再放置4℃过夜，第二天弃去孔内液体，以Tris-吐温缓冲液洗三次，立即测定(或干燥后密封在塑料袋内，低温保存可用半年)。
2.2.3 加样 在已包被的微孔中加入0.1ml血小板溶解液，放37℃ 1.5小时，再用Tris-吐温洗三次。
2.2.4 加酶联抗体 每孔加入工作浓度酶联抗体0.1ml(用含1%BSA的pH7.4 PBS稀释)放37℃1小时，以Tris-吐温洗三次。
2.2.5 加显色剂 每孔加新鲜配制显色剂0.1ml，放避光室温反应20分钟。
2.2.6 加终止液 每孔加0.1ml 2mol/L H2SO4。
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2.2.7 比色 用酶标仪比色，波长492nm，以显色剂0.1ml，终止液0.1ml为空白调零，测定每孔的光密度。
标准曲线的制备，用同样的方法测定不同稀释倍数已知标准血清中各含量的光密。以不同浓度的标准含量为横座标，以相对测定的光密度为纵座标，在半对数纸上画出标准曲线，然后根据待测标本的光密度(OD)值求出其含量。
3 40例正常人血小板表面相关抗体测定
3.1 对象 健康成人40例，年龄20～52岁，其中女性15例，男性25例，血小板数在100～250×109/L。
3.2 条件 ①所用的注射器、试管、器具均为塑料制品；②严格按操作规程进行，每个标本做双孔，求平均值；③每次测定均同时做标准对照。
表1 40例正常人血小板表面相关抗体测定结果 性别
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例数
抗体
测定结果(ng/107PLT)
±SDIgG
0.3～29.9
5.43±7.04
IgA
4.3～18.5
9.91±4.78
男
25
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IgM
0.4～13.4
6.67±4.23
C3
3.8～41.2
15.25±8.5
IgG
0.3～28.1
5.21±5.87
IgA
2.6～18.5
7.99±6.06
, 百拇医药
女
15
IgM
1.0～13.4
7.50±3.87
C3
2.2～38.5
17.4±10.5
从表1可以看出血小板表面抗体含量男女之间基本无差异(P>0.05)。4 48例ITP血小板表面相关抗体测定
4.1 病例选择 慢性ITP48例，其中男16例，女34例，年龄11～52岁，ITP诊断符合下列标准：有出血症状伴外围血小板减少，骨髓巨核细胞数增多或正常伴有成熟障碍，无明显脾肿大，无结缔组织及其它继发性血小板减少症。
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表2 48例ITP患者血小板表面相关抗体测定结果
项 目
男
女
例
数
百分率
结果
(ng/107PLT)
例
数
百分率
结果
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(ng/107PLT)
PIgG
11
68.7
55～181
21
65.7
31.3～46.1
PIgA
5
31.2
23～77.7
, 百拇医药 7
21.0
19.9～151
PIgM
3
18
17～303
6
16.0
18～168.5
PIgG、A、M
1
6.3
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1
3.1
PIgG、A
1
6.3
1
3.1
PIgG、M
1
6.3
1
3.1
C3
, 百拇医药
0
2
6.2
127～374
总数
16
32
5 结果
我们测定了48例ITP的血小板表面相抗体，阳性率89%，其数值明显高于正常，P<0.01，故血小板表面相关抗体测定对ITP的诊断，有着重要的价值。
5.1 从我室对48例ITP测定血小板表面相关抗体的结果来看，阳性率的频度PIgG>PIgA>PIgM>C3。
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5.2 从我室对48例ITP患者测定血小板表面相关抗体，可见PIgG+PIgA+PIgM或PIgG+PIgA或PIgG+PIgM同时增高的混合型。
5.3 从我室对48例ITP患者测定血小板表面相关抗体来看，PIgG增高的约占70%左右，其它增高的(PIgA，PIgM，C3)约占30%，故测定血小板表面相关抗体时宜PIgG、PIgA、PIgM、C3同时测定以免漏诊。
6 讨论
血小板免疫抗体可分两类，即同种免疫抗体和自身免疫抗体[1]。
同种免疫抗体是由血小板血型不合的输血，母子血小板血型不合的妊娠及组织移植产生的，这种抗体主要存在于病人的血清中，一般采用测定血清中的抗体。自体抗体是针对自身血小板的抗体，是由于不同原因使肌体免疫功能紊乱而产生的自身抗体，主要见于ITP血小板抗体主要是PIgG，少数是PIgA、PIgM，有时还可见PIgG+PIgA+PIgM和PIgG+PIgA或PIgG+PIgM的混合型。
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自身免疫抗体大多结合在血小板表面，一般采用酶联双抗体夹心试验来测定血小板表面的相关抗体，我们体会本法比较灵敏可靠的，多数学者认为血小板抗体是病理性免疫反应所产生的特异性血小板抗体，这种抗体结合在血小板表面，结合了抗体的血小板在单核-吞噬系统破坏加速，从而导致血小板减少[2]。
测定血小板表面相关抗体，不但有助于ITP的诊断，指导临床治疗，还可鉴别其它血小板减少症，对ITP患者的诊断有一定的帮助。
参考文献
1，王鸿利等.血液病的临床检验.上海科技出版社，1984，6.
2，徐静山等.江苏省血液病学.1984，4.
收稿日期：1999-09-01, http://www.100md.com