国产氯沙坦钾片的生物等效性研究
作者：韦阳 黄慧芳 邵庆翔 张美云 孙东升 王恪申 郝转业 陈建新 桑国卫
单位：韦阳 邵庆翔 张美云 王恪申 郝转业 桑国卫(浙江省医学科学院，杭州 310013)；黄慧芳 孙东升(浙江省人民医院，杭州，310014)；陈建新(杭州默沙东制药股份有限公司，杭州，310006)
关键词：氯沙坦钾；E-3174
中国临床药理学杂志000208摘 要 18名健康男性志愿者交叉单剂量口服杭州默沙东产50mg氯沙坦钾片和英国默克产50mg氯沙坦钾片，以HPLC-UV法测定血浆中氯沙坦钾及其活性代谢产物E-3174的浓度，并对两种制剂进行生物等效性评价。试验结果表明：口服杭州产及默克产氯沙坦钾，氯沙坦钾Cmax分别为352.20± 196.09和291.20± 124.41m g.L-1， Tmax分别为0.91± 0.38和1.33± 0.69h，AUC0-∞分别为547.44± 226.77和499.52± 157.31 m g.h.L-1，t1/2分别为1.89± 0.49和1.80± 0.51h；E-3174 Cmax分别为545.07± 150.49和534.02± 142.88m g.L-1， Tmax分别为3.15± 1.07和3.37± 0.66h，AUC0-¥ 分别为3641.57± 637.17和3631.72± 687.94 m g.h.L-1，t1/2分别为8.33± 2.05和7.74± 1.22h。统计分析表明，两制剂间氯沙坦钾的Cmax、Tmax有显著差异，而氯沙坦钾的AUC0-∞、E-3174的Cmax、Tmax 和AUC0-∞ 无显著差异。
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RELATIVE BIOAVAILABILITY OF LOSARTAN TABLET IN HEALTHY VOLUNTEERS
WEI Yang, SHAO Qing-Xiang, ZHANG Mei-Yun,WANG Ke-Sheng, HAO Zhuan-Ye, SANG Guo-Wei
(Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013)
HUANG Hui-Fang，SUN Dong-Sheng
(The People’s Hospital of Zhejiang Province)
CHEN Jian-Xin2
, 百拇医药
(Hangzhou MSD Pharmaceutical Co., Ltd.)
Abstract This is an open randomized, two-period crossover study in 18 healthy male volunteers. Subjects receive a single oral dose of 50mg losartan tablet produced by Hangzhou–MSD and by U.K-MERCK .The plasma concentrations of unchanged losartan and its active metabolite, E-3174 are determined by using HPLC method. The main pharmacokinetic parameters are as follows: Cmax of losartan (Hangzhou-MSD) and losartan (U.K.-MERCK) are 352.20± 196.09 and 291.20 ± 124.41mg.L-1, Tmax are 0.91± 0.38 and 1.33± 0.69h, AUC0-∞ are 547.44± 226.77 and 499.52± 157.31 m g.h.L-1, t1/2 are 1.89± 0.49 and 1.80± 0.51h, respectively；Cmax of E-3174 (Hangzhou-MSD) and E-3174(U.K.-MERCK) are 545.07± 150.49 and 534.02 ± 142.88mg.L-1, Tmax are 3.15± 1.07 and 3.37± 0.66h，AUC0-∞are 3641.57± 637.17 and 3631.72± 687.94 mg.h.L-1，t1/2 are 8.33± 2.05 and 7.74± 1.22h,respectively. According to statistic study , the differences of two parameters,Cmax and Tmax of unchanged losartan between two formulations are significant,but AUC0-∞of unchanged losartan and three parameters,Cmax,Tmaxand AUC0-∞of E-3174 show no significant difference between two formulations.
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Key words losartan; E-3174; metabolite
氯沙坦钾，2 -丁基 - 4 - 氯-1-[[2'-(1H - 四唑-5-基)[1,1'-联苯] -4- 基]甲基]-1H-咪唑-5-甲醇单钾盐，是一种口服有效的非多肽类血管紧张素Ⅱ受体(AT1亚型受体)拮抗剂，为一类新型抗高血压药物。本研究采用标准双周期交叉研究评价单次口服杭州默沙东产氯沙坦钾片和英国默克产氯沙坦钾片后母体化合物氯沙坦钾及其活性代谢产物2 -丁基 - 4 - 氯-1-[[2'-(1H - 四唑-5-基)[1,1'-联苯] -4- 基]甲基]-1H-咪唑-5-羧酸(E-3174)的生物等效性。
材料与方法
1. 药品与试剂
受试制剂氯沙坦钾片，杭州默沙东产，规格每片50mg，批号8442-002；对照制剂氯沙坦钾片，英国默克公司产，每片50mg，批号9810770。
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氯沙坦钾标准品，批号005H069，纯度99.7%；E-3174标准品，批号002X008，纯度99.1%；内标L-158,854标准品，批号000F004，均由杭州默沙东制药有限公司提供。
乙腈、甲醇、甲基-叔-丁基醚，HPLC级；双重蒸馏水，自制；磷酸二氢钠、氢氧化钠、柠檬酸钠、柠檬酸、正己烷、异丙醇、磷酸(85%)，AR级。
2. 仪器
HPLC系统：岛津LC -10A双泵、 SPD-10A检测器、CTO-10A柱温箱、DGA -10A脱气仪；7125手动进样阀；MN公司Nuclesil 100-5CN柱(250×4.6mm)；杭州英谱公司HS色谱数据工作站(3.5版)。
3. 受试对象
本研究对象为18名健康男性志愿者，平均年龄20.9± 1.6岁，体重为62.6± 6.1kg。所有受试者在试验前签署了知情同意书，并经浙江省医学科学院医学伦理委员会批准进入本试验。
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4. 试验方案
本研究为一随机、开放、双周期交叉研究。所有参试对象按随机表分别先后口服两种片剂，每次50mg，两次服药的间隔洗净期为14 d。
每次服药前12h至服药后36h受试对象在心血管内科病房住院观察，进食统一标准餐；服药前8h至服药后3h禁食。受试对象在上午8:00左右以250ml温开水送服氯沙坦钾1片。给药前及给药后0.33，0.67，1，1.33，1.67，2，3，4，5，6，8，10，12，18，24，36h分别于上肢静脉取血7ml，离心后得血浆约3ml，-20oC保存待分析。
服药前1h内及服药后1，2，4，6，8，12，24，36h记录一次坐位心率/血压。在整个研究过程中对各种不良反应与事件进行监测。
5. 分析方法
5.1 色谱条件
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检测波长：254nm; 柱温:40oC；灵敏度: 0.001 AUFS；流动相：磷酸盐缓冲溶液(pH=2.9):乙腈(74:26, v/v)，流速:1.0ml.min-1。
5.2 血浆样品的预处理方法
15ml圆底试管编号并加入内标工作液100m l(1.0 mg.L-1)，用氮气将甲醇吹干。冷冻血浆在室温下融化，涡旋20s后于3000r.min-1离心5min，取1.0ml上层血浆至上述试管中，涡旋30s使内标溶解，在各试管中加125m l 1.0M H3PO4，涡旋20s，再加甲基-叔-丁基醚(MTBE)8ml，涡旋2min，3000r.min-1条件下离心10min，将试管置于-70oC低温冰箱中10min使水层冻结。将有机层倾入预先加有200m l 0.05mol.L-1NaOH的15 ml聚丙烯尖底试管中，涡旋2min，3000r·min-1条件下离心5min，将试管于-70oC放置 7min使水层冻结，弃去有机相，将残余MTBE用氮气吹干，在尖底试管中加入75m l 0.5M pH=4.3的柠檬酸缓冲溶液，涡旋混匀；加入6ml正己烷，涡旋2min，3000r.min-1条件下离心5min，将试管置于-70oC 7min使水层冻结，弃去正己烷，残余正己烷用氮气吹干。加入20 μl 1.0 mol.L-1H3PO4和50m l异丙醇，涡旋混匀，取100m l进样。
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5.3 标准曲线的绘制
配制氯沙坦钾与E-3174浓度均为1000，700，300，100，70，30，10和5m g.L-1的系列标准血浆溶液，按血浆处理方法处理测定，以样品的色谱峰面积为定量依据，以待测样品峰面积与内标峰面积的比值(Y)对样品浓度(X)进行线性回归得标准曲线方程。
6. 数据处理
取可检测到药物的最后3个时间点浓度C的自然对数值lnC对相应时间t进行线性回归分别求得氯沙坦钾和E-3174在人体内的末端相消除速率常数l ； 用梯形法求算药时曲线下面积AUC0-t值；计算AUC0-¥ =AUC0-t+l /tn。血浆峰浓度Cmax和达峰时间Tmax取观测值。
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AUC和Cmax分别作对数转换，Tmax不作转换。采用适用于标准2´ 2交叉试验的方差分析方法分析lnAUC、lnCmax和Tmax。根据方差分析得出的均方差，参照t-分布计算均值比率或差的90%可信区间，用方差分析求得均方误差后按Schuirmann标准双单侧检验程序进行评价，统计软件SAS。
结 果
1. 血药浓度测定方法的评价
在选定的分析条件下，氯沙坦钾和E-3174的线性范围均为5～1000m g.L-1，氯沙坦钾的工作曲线为Y= 0.0078X-0.0084 (r2=0.9992)，E-3174的工作曲线为Y = 0.0146X + 0.0033 (r2=0.9996)。
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在线性范围内，测定各浓度氯沙坦钾和E-3174的回收率均接近100%，天内变异系数均<5%(表1)。对高(800m g.L-1)、中(200m g.L-1)、低(30m g.L-1)三种浓度的血浆样品在不同日期共进行12次测定，氯沙坦钾和E-3174的回收率均接近100%，天间变异系数均<5%(表2)。
Table 1. Intra-day precision and recovery of plasma standard curves(n=6)
Nominal
concentration (m g.L-1)
Losartan
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E-3174
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
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5
4.82± 0.22
96.40
4.58
5.54± 0.18
110.80
3.23
10
9.47± 0.39
94.70
4.16
10.57± 0.44
, 百拇医药 105.70
4.15
30
28.72± 0.89
95.73
3.10
30.25± 1.58
100.83
5.22
70
69.93± 1.32
99.00
1.88
, 百拇医药
71.40± 2.03
102.00
2.84
100
97.10± 0.96
97.10
0.99
103.69± 4.66
103.69
4.49
300
305.75± 9.92
, 百拇医药
101.92
3.24
294.37± 4.76
98.12
1.62
700
713.98± 17.61
102.00
2.47
696.72± 15.78
99.53
2.26
, 百拇医药
1000
998.09± 18.43
99.81
1.85
1006.21± 9.90
100.62
0.98
Table 2. Inter-day precision and recovery of qualify control samples (n=12)
Nominal
Concentration (mg.L-1)
, 百拇医药
Losartan
E-3174
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
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(%)
30
28.83± 0.85
96.09
2.95
29.69± 1.32
98.98
4.45
200
195.88± 4.40
97.94
2.25
, http://www.100md.com 196.11± 7.99
98.06
4.07
800
826.93± 37.20
103.37
4.50
811.11± 34.15
101.39
4.20
在线性范围内比较各浓度经提取过程和未经提取过程的样品峰面积，可得各浓度氯沙坦钾和E-3174的绝对提取回收率分别为96.21%和98.82%。本文所建立的方法对氯沙坦钾和E-3174的最低检测限均为5m g.L-1。
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血浆中杂质对测定无明显干扰， 标准血浆样品的色谱图见图1。
Fig 1. Representative chromatograms of 1 (internal standard), 2 (losartan) and 3 (E-3174).
A: Blank plasma; B: Control plasma spiked with 100ng losartan and E-3174
C: 1h sample from a subject given a single dose of 50mg losartan.
2. 药代动力学参数
18名受试对象单剂量口服杭州默沙东产氯沙坦钾片和英国默克产氯沙坦钾片后平均药物浓度-时间曲线见图2、3。氯沙坦钾和E-3174在人体内的药代动力学过程均较好地符合二室模型、一级
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吸收过程。
Fig 2. Mean plasma concentration of losartan following oral administration of 50mg losartan tablet
(t :Hangzhou tablet · : Merck tablet)
Fig 3. Mean plasma concentration of E-3174 following oral administration of
50mg losartan tablet
, 百拇医药
(t :Hangzhou tablet · : Merck tablet)
口服两种50 mg氯沙坦钾片剂后氯沙坦钾和E-3174的Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-¥ 、l 和t1/2等参数列于表3。
Table 3. Pharmacokinetic parameters of losartan and E-3174 following
oral administation of losartan tablet(n=18)
Losartan
E-3174
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Parameters
Hangzhou tablet
Merk tablet
Hangzhou tablet
Merk tablet
Cmax(mg.L-1)(mg.L-1)
352.20± 196.09
291.33± 124.41
545.07± 150.49
, 百拇医药
534.02± 142.88
Tmax(h)(h)
0.91± 0.38
1.33± 0.69
3.15± 1.07
3.37± 0.66
AUC0-t(m g.h.L -1)(m g.h.L -1)
, 百拇医药 533.44± 226.10
484.09± 155.38
3566.12± 627.45
3561.93± 688.19
AUC0-∞(mg.h.L -1)(mg.h.L -1)
547.44± 226.77
499.52± 157.31
, 百拇医药
3641.57± 637.17
3631.72± 687.94
l (h-1)
0.39± 0.10
0.41± 0.11
0.09± 0.03
0.09± 0.02
t1/2(h)(h)
1.89± 0.49
1.80± 0.51
8.33± 2.05
, 百拇医药
7.74± 1.22
3. 生物等效性分析
3.1 母体化合物氯沙坦钾
单剂量口服两种制剂后，氯沙坦钾AUC0-¥ 的几何均值分别为505.2和477.5m g.h.L-1，比率为1.06，90%可信限为(0.97，1.15)在0.8-1.25范围内，表明两者的生物利用度相仿。Cmax的几何均值分别为298.6和264.5 m g.L-1，比率为1.13，90%可信限为(0.89，1.42)，表明受试片的Cmax高于对照片。Tmax分别为0.91和1.33 h，差值-0.42h，差值的90%可信限为(-0.69，-0.16)，表示口服受试片后峰值出现较早。
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3.2 代谢物E-3174
单剂量口服两种制剂后，氯沙坦钾代谢产物E-3174 AUC0-¥ 几何均值分别为3587.5和3570.6 m g.h.L -1，比率为1.00，90%可信限为(0.96，1.06)；Cmax的几何均值分别为527.9和516.3m g·L-1，比率为1.02，90%可信限为(0.94，1.12)。Tmax分别为3.15和3.37 h，差值为-0.22 h，90%可信限为(-0.62，0.18)。双单侧检验表明，口服两种制剂后， E-3174的AUC、Cmax和Tmax均具有生物等效性。
Table 4. Bioequivalence Evaluation
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Compound
Parameter
N
Geometric Mean
Geometric
Mean Ratio
MSE
90%
Confidence
Interval
Two One-sided Test
Hangzhou Tablet
, 百拇医药
Merck Tablet
t1
t2
Losartan
AUC0-∞
(mg.h.L-1)
(mg.h.L-1)
18
, http://www.100md.com
505.2
477.5
1.06
0.0212
(0.97, 1.15)
5.762
3.438
Cmax
(mg.L-1)
(mg.L-1)
, 百拇医药
18
298.6
264.5
1.13
0.1576
(0.89, 1.42)
2.602
0.770
E-3174
AUC0-∞
(m g.h.L -1) (m g.h.L -1)
, http://www.100md.com
18
3587.5
3570.6
1.00
0.0048
(0.96, 1.05)
9.867
9.462
Cmax
(mg.L-1)
18
, http://www.100md.com
527.9
516.3
1.02
0.0228
(0.94, 1.12)
4.874
3.992
Compound
Parameter
N
Arithmetic Mean
Arithmetic
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Mean
difference
MSE
90%
Confidence
Interval
Two One-sided Test
Hangzhou Tablet
Merck Tablet
t1
t2
, 百拇医药
Losartan
Tmax(h)(h)
18
0.91
1.33
-0.42
0.2128
(-0.69,-0.16)
1.028
4.498
E-3174
Tmax(h)(h)
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18
3.15
3.37
-0.22
0.4722
(-0.62,0.18)
1.973
3.913
4. 安全性
所有参加试验的18名志愿者均列入安全性评价范围，但没有一位志愿者主诉感觉不适。其它安全性测试，包括生命体征、体检和心电图没有发现有临床意义的异常。
讨 论
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氯沙坦钾是一种血管紧张素II受体拮抗剂，是一类新型抗高血压药物系列的首创药物。治疗高血压的起始和维持剂量对一般病人为50mg，每天服药一次。
根据以前进行的氯沙坦钾生物等效性研究中资料，氯沙坦钾AUC的几何均值之比为0.97，均方误差(MSE)为0.0188。据此估算，招募18例对象可足以有90%的把握及90%的概率观测到两种产品的AUC几何均值比率落在等效区间(0.8，1.25)以内。
本研究结果表明，氯沙坦钾片剂的血药浓度时间过程有很大的个体差异。以默沙东50mg片剂为例，母体药物氯沙坦钾的Cmax的范围为127.35 - 733.92 m g.L-1，Tmax从20min到约2h，AUC0-¥ ?范围为238.11 - 1136.39 m g.h.L -1。
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多项研究报道表明，口服氯沙坦钾后的羧基化代谢产物E-3174对血管紧张素Ⅱ受体的抑制作用比氯沙坦钾强得多[1-3]。E-3174在很大程度上决定了氯沙坦钾片对人体的抗高血压作用，它使后者的药效一直持续至服药后24h之后[3]。本研究表明，氯沙坦钾血浆浓度达到峰值后，下降很快，10h内降至检测限以下；E-3174血浆浓度在氯沙坦钾之后2h左右达到峰值，其高浓度状态持续时间较长，消除较慢。
本研究结果显示，单剂量口服杭州默沙东产50 mg氯沙坦钾片剂后，氯沙坦钾的平均Tmax较小，平均Cmax较高，推测可能与两种制剂的崩解时速差异有关。但作为生物等效的主要判断指标AUC0-¥ ?几何均值比率的90%可信限为(0.97，1.15)，落在0.80-1.25的等效范围内。 重要的是其强效活性代谢产物E-3174的AUC0-¥ 、Cmax和Tmax在两种制剂之间均无明显差异。因此，根据本研究结果，可以认为口服杭州默沙东产50mg氯沙坦钾片剂与英国默克产50mg氯沙坦钾片剂的吸收程度为生物等效。
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据研究[4]，氯沙坦钾在人体内约有14%转化为E-3174，虽然如此，E-3174在血浆中的浓度较氯沙坦钾高，这是由于E-3174在清除率比氯沙坦钾的清除率要低得多，而且E-3174的消除不受氯沙坦钾转化为E-3174的速率所限制，从而掩盖了由制剂间氯沙坦钾吸收速率的差异对E-3174的Tmax、Cmax所造成的影响。
参考文献
1. Sachinidis A, Ko Y, Weisser P, et al. EXP3174, a metabolite of losartan (MK 954, DuP 753) is more potent than losartan in blocking the angiotensin Ⅱ-induced responses in vascular smooth muscle cell. J Hypertens, 1993; 11:155~162.
, http://www.100md.com
2. Stearns RA, Chakravarty PK, Chen R, et al. Biotransformation of losartan to its active carboxylic acid metabolite in human liver microsomes. Role of cytochrome P4502C and 3A subfamily members. Drug Metab Dispos, 1995; 23: 207~215.
3. Alain M, Yves C, Jurg N, et al. Drug concentration response relationship in normal volunteers after oral administration of losartan, an angiotensin ii receptor antagonist. Clin Pharmacol Ther, 1992; 51:513~521.
4. Man-Wai Lo, Michael R.G, Jacqueline B.M, et al. Pharmacokinetics of losartan, an angitensin II receptor antagnist, and its active metabolite EXP3174 in humane. Clin Pharmacol Ther, 1995;58:641~649 .
19999-11-06
2000-01-20, http://www.100md.com
单位：韦阳 邵庆翔 张美云 王恪申 郝转业 桑国卫(浙江省医学科学院，杭州 310013)；黄慧芳 孙东升(浙江省人民医院，杭州，310014)；陈建新(杭州默沙东制药股份有限公司，杭州，310006)
关键词：氯沙坦钾；E-3174
中国临床药理学杂志000208摘 要 18名健康男性志愿者交叉单剂量口服杭州默沙东产50mg氯沙坦钾片和英国默克产50mg氯沙坦钾片，以HPLC-UV法测定血浆中氯沙坦钾及其活性代谢产物E-3174的浓度，并对两种制剂进行生物等效性评价。试验结果表明：口服杭州产及默克产氯沙坦钾，氯沙坦钾Cmax分别为352.20± 196.09和291.20± 124.41m g.L-1， Tmax分别为0.91± 0.38和1.33± 0.69h，AUC0-∞分别为547.44± 226.77和499.52± 157.31 m g.h.L-1，t1/2分别为1.89± 0.49和1.80± 0.51h；E-3174 Cmax分别为545.07± 150.49和534.02± 142.88m g.L-1， Tmax分别为3.15± 1.07和3.37± 0.66h，AUC0-¥ 分别为3641.57± 637.17和3631.72± 687.94 m g.h.L-1，t1/2分别为8.33± 2.05和7.74± 1.22h。统计分析表明，两制剂间氯沙坦钾的Cmax、Tmax有显著差异，而氯沙坦钾的AUC0-∞、E-3174的Cmax、Tmax 和AUC0-∞ 无显著差异。
, 百拇医药
RELATIVE BIOAVAILABILITY OF LOSARTAN TABLET IN HEALTHY VOLUNTEERS
WEI Yang, SHAO Qing-Xiang, ZHANG Mei-Yun,WANG Ke-Sheng, HAO Zhuan-Ye, SANG Guo-Wei
(Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013)
HUANG Hui-Fang，SUN Dong-Sheng
(The People’s Hospital of Zhejiang Province)
CHEN Jian-Xin2
, 百拇医药
(Hangzhou MSD Pharmaceutical Co., Ltd.)
Abstract This is an open randomized, two-period crossover study in 18 healthy male volunteers. Subjects receive a single oral dose of 50mg losartan tablet produced by Hangzhou–MSD and by U.K-MERCK .The plasma concentrations of unchanged losartan and its active metabolite, E-3174 are determined by using HPLC method. The main pharmacokinetic parameters are as follows: Cmax of losartan (Hangzhou-MSD) and losartan (U.K.-MERCK) are 352.20± 196.09 and 291.20 ± 124.41mg.L-1, Tmax are 0.91± 0.38 and 1.33± 0.69h, AUC0-∞ are 547.44± 226.77 and 499.52± 157.31 m g.h.L-1, t1/2 are 1.89± 0.49 and 1.80± 0.51h, respectively；Cmax of E-3174 (Hangzhou-MSD) and E-3174(U.K.-MERCK) are 545.07± 150.49 and 534.02 ± 142.88mg.L-1, Tmax are 3.15± 1.07 and 3.37± 0.66h，AUC0-∞are 3641.57± 637.17 and 3631.72± 687.94 mg.h.L-1，t1/2 are 8.33± 2.05 and 7.74± 1.22h,respectively. According to statistic study , the differences of two parameters,Cmax and Tmax of unchanged losartan between two formulations are significant,but AUC0-∞of unchanged losartan and three parameters,Cmax,Tmaxand AUC0-∞of E-3174 show no significant difference between two formulations.
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Key words losartan; E-3174; metabolite
氯沙坦钾，2 -丁基 - 4 - 氯-1-[[2'-(1H - 四唑-5-基)[1,1'-联苯] -4- 基]甲基]-1H-咪唑-5-甲醇单钾盐，是一种口服有效的非多肽类血管紧张素Ⅱ受体(AT1亚型受体)拮抗剂，为一类新型抗高血压药物。本研究采用标准双周期交叉研究评价单次口服杭州默沙东产氯沙坦钾片和英国默克产氯沙坦钾片后母体化合物氯沙坦钾及其活性代谢产物2 -丁基 - 4 - 氯-1-[[2'-(1H - 四唑-5-基)[1,1'-联苯] -4- 基]甲基]-1H-咪唑-5-羧酸(E-3174)的生物等效性。
材料与方法
1. 药品与试剂
受试制剂氯沙坦钾片，杭州默沙东产，规格每片50mg，批号8442-002；对照制剂氯沙坦钾片，英国默克公司产，每片50mg，批号9810770。
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氯沙坦钾标准品，批号005H069，纯度99.7%；E-3174标准品，批号002X008，纯度99.1%；内标L-158,854标准品，批号000F004，均由杭州默沙东制药有限公司提供。
乙腈、甲醇、甲基-叔-丁基醚，HPLC级；双重蒸馏水，自制；磷酸二氢钠、氢氧化钠、柠檬酸钠、柠檬酸、正己烷、异丙醇、磷酸(85%)，AR级。
2. 仪器
HPLC系统：岛津LC -10A双泵、 SPD-10A检测器、CTO-10A柱温箱、DGA -10A脱气仪；7125手动进样阀；MN公司Nuclesil 100-5CN柱(250×4.6mm)；杭州英谱公司HS色谱数据工作站(3.5版)。
3. 受试对象
本研究对象为18名健康男性志愿者，平均年龄20.9± 1.6岁，体重为62.6± 6.1kg。所有受试者在试验前签署了知情同意书，并经浙江省医学科学院医学伦理委员会批准进入本试验。
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4. 试验方案
本研究为一随机、开放、双周期交叉研究。所有参试对象按随机表分别先后口服两种片剂，每次50mg，两次服药的间隔洗净期为14 d。
每次服药前12h至服药后36h受试对象在心血管内科病房住院观察，进食统一标准餐；服药前8h至服药后3h禁食。受试对象在上午8:00左右以250ml温开水送服氯沙坦钾1片。给药前及给药后0.33，0.67，1，1.33，1.67，2，3，4，5，6，8，10，12，18，24，36h分别于上肢静脉取血7ml，离心后得血浆约3ml，-20oC保存待分析。
服药前1h内及服药后1，2，4，6，8，12，24，36h记录一次坐位心率/血压。在整个研究过程中对各种不良反应与事件进行监测。
5. 分析方法
5.1 色谱条件
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检测波长：254nm; 柱温:40oC；灵敏度: 0.001 AUFS；流动相：磷酸盐缓冲溶液(pH=2.9):乙腈(74:26, v/v)，流速:1.0ml.min-1。
5.2 血浆样品的预处理方法
15ml圆底试管编号并加入内标工作液100m l(1.0 mg.L-1)，用氮气将甲醇吹干。冷冻血浆在室温下融化，涡旋20s后于3000r.min-1离心5min，取1.0ml上层血浆至上述试管中，涡旋30s使内标溶解，在各试管中加125m l 1.0M H3PO4，涡旋20s，再加甲基-叔-丁基醚(MTBE)8ml，涡旋2min，3000r.min-1条件下离心10min，将试管置于-70oC低温冰箱中10min使水层冻结。将有机层倾入预先加有200m l 0.05mol.L-1NaOH的15 ml聚丙烯尖底试管中，涡旋2min，3000r·min-1条件下离心5min，将试管于-70oC放置 7min使水层冻结，弃去有机相，将残余MTBE用氮气吹干，在尖底试管中加入75m l 0.5M pH=4.3的柠檬酸缓冲溶液，涡旋混匀；加入6ml正己烷，涡旋2min，3000r.min-1条件下离心5min，将试管置于-70oC 7min使水层冻结，弃去正己烷，残余正己烷用氮气吹干。加入20 μl 1.0 mol.L-1H3PO4和50m l异丙醇，涡旋混匀，取100m l进样。
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5.3 标准曲线的绘制
配制氯沙坦钾与E-3174浓度均为1000，700，300，100，70，30，10和5m g.L-1的系列标准血浆溶液，按血浆处理方法处理测定，以样品的色谱峰面积为定量依据，以待测样品峰面积与内标峰面积的比值(Y)对样品浓度(X)进行线性回归得标准曲线方程。
6. 数据处理
取可检测到药物的最后3个时间点浓度C的自然对数值lnC对相应时间t进行线性回归分别求得氯沙坦钾和E-3174在人体内的末端相消除速率常数l ； 用梯形法求算药时曲线下面积AUC0-t值；计算AUC0-¥ =AUC0-t+l /tn。血浆峰浓度Cmax和达峰时间Tmax取观测值。
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AUC和Cmax分别作对数转换，Tmax不作转换。采用适用于标准2´ 2交叉试验的方差分析方法分析lnAUC、lnCmax和Tmax。根据方差分析得出的均方差，参照t-分布计算均值比率或差的90%可信区间，用方差分析求得均方误差后按Schuirmann标准双单侧检验程序进行评价，统计软件SAS。
结 果
1. 血药浓度测定方法的评价
在选定的分析条件下，氯沙坦钾和E-3174的线性范围均为5～1000m g.L-1，氯沙坦钾的工作曲线为Y= 0.0078X-0.0084 (r2=0.9992)，E-3174的工作曲线为Y = 0.0146X + 0.0033 (r2=0.9996)。
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在线性范围内，测定各浓度氯沙坦钾和E-3174的回收率均接近100%，天内变异系数均<5%(表1)。对高(800m g.L-1)、中(200m g.L-1)、低(30m g.L-1)三种浓度的血浆样品在不同日期共进行12次测定，氯沙坦钾和E-3174的回收率均接近100%，天间变异系数均<5%(表2)。
Table 1. Intra-day precision and recovery of plasma standard curves(n=6)
Nominal
concentration (m g.L-1)
Losartan
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E-3174
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
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5
4.82± 0.22
96.40
4.58
5.54± 0.18
110.80
3.23
10
9.47± 0.39
94.70
4.16
10.57± 0.44
, 百拇医药 105.70
4.15
30
28.72± 0.89
95.73
3.10
30.25± 1.58
100.83
5.22
70
69.93± 1.32
99.00
1.88
, 百拇医药
71.40± 2.03
102.00
2.84
100
97.10± 0.96
97.10
0.99
103.69± 4.66
103.69
4.49
300
305.75± 9.92
, 百拇医药
101.92
3.24
294.37± 4.76
98.12
1.62
700
713.98± 17.61
102.00
2.47
696.72± 15.78
99.53
2.26
, 百拇医药
1000
998.09± 18.43
99.81
1.85
1006.21± 9.90
100.62
0.98
Table 2. Inter-day precision and recovery of qualify control samples (n=12)
Nominal
Concentration (mg.L-1)
, 百拇医药
Losartan
E-3174
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
, http://www.100md.com
(%)
30
28.83± 0.85
96.09
2.95
29.69± 1.32
98.98
4.45
200
195.88± 4.40
97.94
2.25
, http://www.100md.com 196.11± 7.99
98.06
4.07
800
826.93± 37.20
103.37
4.50
811.11± 34.15
101.39
4.20
在线性范围内比较各浓度经提取过程和未经提取过程的样品峰面积，可得各浓度氯沙坦钾和E-3174的绝对提取回收率分别为96.21%和98.82%。本文所建立的方法对氯沙坦钾和E-3174的最低检测限均为5m g.L-1。
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血浆中杂质对测定无明显干扰， 标准血浆样品的色谱图见图1。
Fig 1. Representative chromatograms of 1 (internal standard), 2 (losartan) and 3 (E-3174).
A: Blank plasma; B: Control plasma spiked with 100ng losartan and E-3174
C: 1h sample from a subject given a single dose of 50mg losartan.
2. 药代动力学参数
18名受试对象单剂量口服杭州默沙东产氯沙坦钾片和英国默克产氯沙坦钾片后平均药物浓度-时间曲线见图2、3。氯沙坦钾和E-3174在人体内的药代动力学过程均较好地符合二室模型、一级
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吸收过程。
Fig 2. Mean plasma concentration of losartan following oral administration of 50mg losartan tablet
(t :Hangzhou tablet · : Merck tablet)
Fig 3. Mean plasma concentration of E-3174 following oral administration of
50mg losartan tablet
, 百拇医药
(t :Hangzhou tablet · : Merck tablet)
口服两种50 mg氯沙坦钾片剂后氯沙坦钾和E-3174的Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-¥ 、l 和t1/2等参数列于表3。
Table 3. Pharmacokinetic parameters of losartan and E-3174 following
oral administation of losartan tablet(n=18)
Losartan
E-3174
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Parameters
Hangzhou tablet
Merk tablet
Hangzhou tablet
Merk tablet
Cmax(mg.L-1)(mg.L-1)
352.20± 196.09
291.33± 124.41
545.07± 150.49
, 百拇医药
534.02± 142.88
Tmax(h)(h)
0.91± 0.38
1.33± 0.69
3.15± 1.07
3.37± 0.66
AUC0-t(m g.h.L -1)(m g.h.L -1)
, 百拇医药 533.44± 226.10
484.09± 155.38
3566.12± 627.45
3561.93± 688.19
AUC0-∞(mg.h.L -1)(mg.h.L -1)
547.44± 226.77
499.52± 157.31
, 百拇医药
3641.57± 637.17
3631.72± 687.94
l (h-1)
0.39± 0.10
0.41± 0.11
0.09± 0.03
0.09± 0.02
t1/2(h)(h)
1.89± 0.49
1.80± 0.51
8.33± 2.05
, 百拇医药
7.74± 1.22
3. 生物等效性分析
3.1 母体化合物氯沙坦钾
单剂量口服两种制剂后，氯沙坦钾AUC0-¥ 的几何均值分别为505.2和477.5m g.h.L-1，比率为1.06，90%可信限为(0.97，1.15)在0.8-1.25范围内，表明两者的生物利用度相仿。Cmax的几何均值分别为298.6和264.5 m g.L-1，比率为1.13，90%可信限为(0.89，1.42)，表明受试片的Cmax高于对照片。Tmax分别为0.91和1.33 h，差值-0.42h，差值的90%可信限为(-0.69，-0.16)，表示口服受试片后峰值出现较早。
, 百拇医药
3.2 代谢物E-3174
单剂量口服两种制剂后，氯沙坦钾代谢产物E-3174 AUC0-¥ 几何均值分别为3587.5和3570.6 m g.h.L -1，比率为1.00，90%可信限为(0.96，1.06)；Cmax的几何均值分别为527.9和516.3m g·L-1，比率为1.02，90%可信限为(0.94，1.12)。Tmax分别为3.15和3.37 h，差值为-0.22 h，90%可信限为(-0.62，0.18)。双单侧检验表明，口服两种制剂后， E-3174的AUC、Cmax和Tmax均具有生物等效性。
Table 4. Bioequivalence Evaluation
, 百拇医药
Compound
Parameter
N
Geometric Mean
Geometric
Mean Ratio
MSE
90%
Confidence
Interval
Two One-sided Test
Hangzhou Tablet
, 百拇医药
Merck Tablet
t1
t2
Losartan
AUC0-∞
(mg.h.L-1)
(mg.h.L-1)
18
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505.2
477.5
1.06
0.0212
(0.97, 1.15)
5.762
3.438
Cmax
(mg.L-1)
(mg.L-1)
, 百拇医药
18
298.6
264.5
1.13
0.1576
(0.89, 1.42)
2.602
0.770
E-3174
AUC0-∞
(m g.h.L -1) (m g.h.L -1)
, http://www.100md.com
18
3587.5
3570.6
1.00
0.0048
(0.96, 1.05)
9.867
9.462
Cmax
(mg.L-1)
18
, http://www.100md.com
527.9
516.3
1.02
0.0228
(0.94, 1.12)
4.874
3.992
Compound
Parameter
N
Arithmetic Mean
Arithmetic
, 百拇医药
Mean
difference
MSE
90%
Confidence
Interval
Two One-sided Test
Hangzhou Tablet
Merck Tablet
t1
t2
, 百拇医药
Losartan
Tmax(h)(h)
18
0.91
1.33
-0.42
0.2128
(-0.69,-0.16)
1.028
4.498
E-3174
Tmax(h)(h)
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18
3.15
3.37
-0.22
0.4722
(-0.62,0.18)
1.973
3.913
4. 安全性
所有参加试验的18名志愿者均列入安全性评价范围，但没有一位志愿者主诉感觉不适。其它安全性测试，包括生命体征、体检和心电图没有发现有临床意义的异常。
讨 论
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氯沙坦钾是一种血管紧张素II受体拮抗剂，是一类新型抗高血压药物系列的首创药物。治疗高血压的起始和维持剂量对一般病人为50mg，每天服药一次。
根据以前进行的氯沙坦钾生物等效性研究中资料，氯沙坦钾AUC的几何均值之比为0.97，均方误差(MSE)为0.0188。据此估算，招募18例对象可足以有90%的把握及90%的概率观测到两种产品的AUC几何均值比率落在等效区间(0.8，1.25)以内。
本研究结果表明，氯沙坦钾片剂的血药浓度时间过程有很大的个体差异。以默沙东50mg片剂为例，母体药物氯沙坦钾的Cmax的范围为127.35 - 733.92 m g.L-1，Tmax从20min到约2h，AUC0-¥ ?范围为238.11 - 1136.39 m g.h.L -1。
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多项研究报道表明，口服氯沙坦钾后的羧基化代谢产物E-3174对血管紧张素Ⅱ受体的抑制作用比氯沙坦钾强得多[1-3]。E-3174在很大程度上决定了氯沙坦钾片对人体的抗高血压作用，它使后者的药效一直持续至服药后24h之后[3]。本研究表明，氯沙坦钾血浆浓度达到峰值后，下降很快，10h内降至检测限以下；E-3174血浆浓度在氯沙坦钾之后2h左右达到峰值，其高浓度状态持续时间较长，消除较慢。
本研究结果显示，单剂量口服杭州默沙东产50 mg氯沙坦钾片剂后，氯沙坦钾的平均Tmax较小，平均Cmax较高，推测可能与两种制剂的崩解时速差异有关。但作为生物等效的主要判断指标AUC0-¥ ?几何均值比率的90%可信限为(0.97，1.15)，落在0.80-1.25的等效范围内。 重要的是其强效活性代谢产物E-3174的AUC0-¥ 、Cmax和Tmax在两种制剂之间均无明显差异。因此，根据本研究结果，可以认为口服杭州默沙东产50mg氯沙坦钾片剂与英国默克产50mg氯沙坦钾片剂的吸收程度为生物等效。
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据研究[4]，氯沙坦钾在人体内约有14%转化为E-3174，虽然如此，E-3174在血浆中的浓度较氯沙坦钾高，这是由于E-3174在清除率比氯沙坦钾的清除率要低得多，而且E-3174的消除不受氯沙坦钾转化为E-3174的速率所限制，从而掩盖了由制剂间氯沙坦钾吸收速率的差异对E-3174的Tmax、Cmax所造成的影响。
参考文献
1. Sachinidis A, Ko Y, Weisser P, et al. EXP3174, a metabolite of losartan (MK 954, DuP 753) is more potent than losartan in blocking the angiotensin Ⅱ-induced responses in vascular smooth muscle cell. J Hypertens, 1993; 11:155~162.
, http://www.100md.com
2. Stearns RA, Chakravarty PK, Chen R, et al. Biotransformation of losartan to its active carboxylic acid metabolite in human liver microsomes. Role of cytochrome P4502C and 3A subfamily members. Drug Metab Dispos, 1995; 23: 207~215.
3. Alain M, Yves C, Jurg N, et al. Drug concentration response relationship in normal volunteers after oral administration of losartan, an angiotensin ii receptor antagonist. Clin Pharmacol Ther, 1992; 51:513~521.
4. Man-Wai Lo, Michael R.G, Jacqueline B.M, et al. Pharmacokinetics of losartan, an angitensin II receptor antagnist, and its active metabolite EXP3174 in humane. Clin Pharmacol Ther, 1995;58:641~649 .
19999-11-06
2000-01-20, http://www.100md.com