鼻咽癌DNA含量及交联度测定
作者：王瑾 许峰 黄建鸣 文浩 董玉林 刘阳
单位：王瑾、许峰、文浩、刘阳(610041 成都，四川省肿瘤医院放射治疗科)；黄建鸣、董玉林(四川省肿瘤研究所生化室)
关键词：
中华放射肿瘤学杂志990224
1996年我院报道了用溴化乙锭(EB)荧光法测定肿瘤细胞DNA含量及交联度研究细胞增殖活性的可行性研究结果，作者用此法测定了1994年6月～1994年12月收治的30例鼻咽癌患者的新鲜肿瘤组织的DNA含量和氯氨顺铂(CDDP)交联度(CT%)，现将测量结果作一报道。
1 材料和方法：
1.1病例选择：30例均经病理证实为低分化鳞癌，男性25例，女性5例，年龄范围25～61岁。临床分期按1979年长沙标准，Ⅲ期13例，Ⅳ期17例。30例均接受根治性外照射。超分割方式照射120cGy，每天2次，鼻咽部DT70～76Gy，颈部DT68～74Gy。随访时间均超过3年。
, 百拇医药
1.2 标本制备：均于放射治疗前从鼻咽癌灶处钳取新鲜肿瘤组织，1块用于检测，1块送病理检查。30例中20例于放射治疗2～3周后复取肿瘤组织检测。用机械法分离肿瘤组织，经200目滤网过滤,悬浮于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中。
1.3 DNA交联度测定：将肿瘤细胞与含100μmol/LCDDP的RPMI-1640液在5%CO2，37℃下培养4小时，用PBS离心洗2次，取细胞悬液40μL(3×105细胞)于200μL细胞溶解液中，37℃水浴16小时，加25μL肝素继续水浴20分钟加入EB液，混匀后于100℃水浴变性5分钟后，立即冷却至室温，用RF-5000型荧光光度计(日本岛津)在Ex525nm，Em600nm处分别测定变性和未变性DNA的荧光强度，并按下式计算交联度，CT%=[(变性DNA荧光强度-空白荧光强度)/(未变性DNA荧光强度-空白荧光强度)]×100%。
1.4 DNA含量测定：采用上述方法测定1×106个肿瘤细胞荧光强度。采用同时所测定该病人正常外周血淋巴细胞的DNA含量为正常二倍体DNA含量，计算DNA指数(DNA index,DI)，DI=肿瘤细胞DNA含量/二倍体细胞DNA含量。根据AUER分类法分为：Ⅰ型(二或近二倍体，DI≤1.25)；Ⅱ型(近四倍体，1.9≤DI≤2.25)；Ⅲ型(非整倍体，1.252.25)。Ⅱ ，Ⅲ型为异倍体。
, 百拇医药
1.5 统计方法：测量结果以均数加标准差表示并用t检验，率的统计用χ2检验。
2 结果
2.1 DNA倍型：30例中二倍体9例(Ⅰ型)，异倍体21例(Ⅱ型4例，Ⅲ型17例)。二倍体与异倍体肿瘤放射治疗前CT%值分别为(46.09±8.23)%和(59.4±8.04)%,P<0.05。
2.2 放射治疗前与放射治疗后CT% 与DI变化见表1。
表1 20例鼻咽癌放射治疗前后肿瘤CT%与DI结果 组别
CT(%)
DI
放射治疗前
, 百拇医药
54.22± 8.80
2.14±0.91
放射治疗后
37.77±14.22
1.84±0.68
P值
<0.05
>0.05
2.3 DNA倍型与疗效的关系见表2。
表2 DNA倍型与疗效 DNA
倍型
消退率
, 百拇医药
(%)
复发率
(%)
3年
生存率
(%)
二倍体
77.8(7/9)
55.6(5/9)
77.8(7/9)
异倍体
81.0(17/21)
14.3(3/21)
, 百拇医药
71.4(15/21)
P值
>0.05
<0.05
>0.05
3 讨论
CDDP是G1期双链DNA交联剂，交联度可以反映细胞增殖活性的差别，细胞DNA含量与其增殖活性以及增殖性细胞群体中各时相细胞的比例不同有关。本组结果显示放射治疗前异倍体肿瘤细胞与CDDP的交联度大于二倍体，可解释异倍体肿瘤对CDDP化疗较敏感的现象,表明异倍体肿瘤细胞容易被化疗药物选择性杀伤。本组20例病人肿瘤细胞CDDP交联度在放射治疗开始后3周低于放射治疗前水平，提示在安排放射治疗与CDDP化疗顺序时，不宜将CDDP放在放射治疗后。该组病人放射治疗后DI降低, 可能和细胞周期移行有关,但和放射治疗前差异无显著性。
, 百拇医药
一般认为异倍体肿瘤的细胞增殖活性比二倍体强,异倍体肿瘤成份对CDDP反应明显，二倍体肿瘤则较抗拒，故晚期对CDDP不敏感的头颈部鳞癌多为二倍体。本组病例临床均为晚期(Ⅲ～Ⅳ)，异倍体率明显高于二倍体(7∶3)，与文献报道晚期头颈部鳞癌异倍体率增高一致。 DNA含量与放射治疗反应性的关系目前尚不清楚。Nervi的研究显示对放射治疗抗拒的头颈部鳞癌具有较低的有丝分裂标记率和DNA非整倍体率。Ensley报道DNA为非整倍体的头颈部鳞癌患者放射治疗后生存期与完全缓解率高于二倍体肿瘤，而复发性肿瘤具有低的非整倍体率和DNA指数。本组患者二倍体与异倍体肿瘤放射治疗后肿瘤完全消退率分别为77.8%和81.0%，二者差异无显著性。但二倍体肿瘤局部复发率显著高于异倍体(55.6%比14.3%)，二倍体与异倍体的3年生存率分别为77.8%和71.4%，差异无显著性 (收稿：1998-08-21 修回：1999-01-08), 百拇医药
单位：王瑾、许峰、文浩、刘阳(610041 成都，四川省肿瘤医院放射治疗科)；黄建鸣、董玉林(四川省肿瘤研究所生化室)
关键词：
中华放射肿瘤学杂志990224
1996年我院报道了用溴化乙锭(EB)荧光法测定肿瘤细胞DNA含量及交联度研究细胞增殖活性的可行性研究结果，作者用此法测定了1994年6月～1994年12月收治的30例鼻咽癌患者的新鲜肿瘤组织的DNA含量和氯氨顺铂(CDDP)交联度(CT%)，现将测量结果作一报道。
1 材料和方法：
1.1病例选择：30例均经病理证实为低分化鳞癌，男性25例，女性5例，年龄范围25～61岁。临床分期按1979年长沙标准，Ⅲ期13例，Ⅳ期17例。30例均接受根治性外照射。超分割方式照射120cGy，每天2次，鼻咽部DT70～76Gy，颈部DT68～74Gy。随访时间均超过3年。
, 百拇医药
1.2 标本制备：均于放射治疗前从鼻咽癌灶处钳取新鲜肿瘤组织，1块用于检测，1块送病理检查。30例中20例于放射治疗2～3周后复取肿瘤组织检测。用机械法分离肿瘤组织，经200目滤网过滤,悬浮于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中。
1.3 DNA交联度测定：将肿瘤细胞与含100μmol/LCDDP的RPMI-1640液在5%CO2，37℃下培养4小时，用PBS离心洗2次，取细胞悬液40μL(3×105细胞)于200μL细胞溶解液中，37℃水浴16小时，加25μL肝素继续水浴20分钟加入EB液，混匀后于100℃水浴变性5分钟后，立即冷却至室温，用RF-5000型荧光光度计(日本岛津)在Ex525nm，Em600nm处分别测定变性和未变性DNA的荧光强度，并按下式计算交联度，CT%=[(变性DNA荧光强度-空白荧光强度)/(未变性DNA荧光强度-空白荧光强度)]×100%。
1.4 DNA含量测定：采用上述方法测定1×106个肿瘤细胞荧光强度。采用同时所测定该病人正常外周血淋巴细胞的DNA含量为正常二倍体DNA含量，计算DNA指数(DNA index,DI)，DI=肿瘤细胞DNA含量/二倍体细胞DNA含量。根据AUER分类法分为：Ⅰ型(二或近二倍体，DI≤1.25)；Ⅱ型(近四倍体，1.9≤DI≤2.25)；Ⅲ型(非整倍体，1.25
, 百拇医药
1.5 统计方法：测量结果以均数加标准差表示并用t检验，率的统计用χ2检验。
2 结果
2.1 DNA倍型：30例中二倍体9例(Ⅰ型)，异倍体21例(Ⅱ型4例，Ⅲ型17例)。二倍体与异倍体肿瘤放射治疗前CT%值分别为(46.09±8.23)%和(59.4±8.04)%,P<0.05。
2.2 放射治疗前与放射治疗后CT% 与DI变化见表1。
表1 20例鼻咽癌放射治疗前后肿瘤CT%与DI结果 组别
CT(%)
DI
放射治疗前
, 百拇医药
54.22± 8.80
2.14±0.91
放射治疗后
37.77±14.22
1.84±0.68
P值
<0.05
>0.05
2.3 DNA倍型与疗效的关系见表2。
表2 DNA倍型与疗效 DNA
倍型
消退率
, 百拇医药
(%)
复发率
(%)
3年
生存率
(%)
二倍体
77.8(7/9)
55.6(5/9)
77.8(7/9)
异倍体
81.0(17/21)
14.3(3/21)
, 百拇医药
71.4(15/21)
P值
>0.05
<0.05
>0.05
3 讨论
CDDP是G1期双链DNA交联剂，交联度可以反映细胞增殖活性的差别，细胞DNA含量与其增殖活性以及增殖性细胞群体中各时相细胞的比例不同有关。本组结果显示放射治疗前异倍体肿瘤细胞与CDDP的交联度大于二倍体，可解释异倍体肿瘤对CDDP化疗较敏感的现象,表明异倍体肿瘤细胞容易被化疗药物选择性杀伤。本组20例病人肿瘤细胞CDDP交联度在放射治疗开始后3周低于放射治疗前水平，提示在安排放射治疗与CDDP化疗顺序时，不宜将CDDP放在放射治疗后。该组病人放射治疗后DI降低, 可能和细胞周期移行有关,但和放射治疗前差异无显著性。
, 百拇医药
一般认为异倍体肿瘤的细胞增殖活性比二倍体强,异倍体肿瘤成份对CDDP反应明显，二倍体肿瘤则较抗拒，故晚期对CDDP不敏感的头颈部鳞癌多为二倍体。本组病例临床均为晚期(Ⅲ～Ⅳ)，异倍体率明显高于二倍体(7∶3)，与文献报道晚期头颈部鳞癌异倍体率增高一致。 DNA含量与放射治疗反应性的关系目前尚不清楚。Nervi的研究显示对放射治疗抗拒的头颈部鳞癌具有较低的有丝分裂标记率和DNA非整倍体率。Ensley报道DNA为非整倍体的头颈部鳞癌患者放射治疗后生存期与完全缓解率高于二倍体肿瘤，而复发性肿瘤具有低的非整倍体率和DNA指数。本组患者二倍体与异倍体肿瘤放射治疗后肿瘤完全消退率分别为77.8%和81.0%，二者差异无显著性。但二倍体肿瘤局部复发率显著高于异倍体(55.6%比14.3%)，二倍体与异倍体的3年生存率分别为77.8%和71.4%，差异无显著性 (收稿：1998-08-21 修回：1999-01-08), 百拇医药