谷胱甘肽S转移酶-血管生成抑制素融合蛋白表达载体的构建
作者：陈广南1 罗进贤2 梁希若1
单位：1广州医学院微生物学与免疫学教研室(510182)；2中山大学生命科学学院(510275)
关键词：血管生成抑制素；融合基因载体；基因重组
广东医学990202 【摘要】 目的 构建谷胱甘肽S转移酶-血管生成抑制素(GST-Angiostatin)融合蛋白表达载体。方法 把血管生成抑制素(Angiostatin)基因插入融合基因表达载体pGEX-2T的多克隆位点上，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，限制性内切酶消化DNA，琼脂糖凝胶电泳。结果 经限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Pst Ⅰ酶切质粒DNA，电泳结果证明Angiostatin基因已插入到pGEX-2T中。结论 成功构建GST-Angiostatin融合蛋白表达载体，为获得较大量的基因工程Angiostatin产品，为肿瘤治疗研究作必要准备。
, 百拇医药
Construction of expression vector of GST-Angiostatin fusion protein Chen Guangnan,Luo Jinxian,Liang Xiruo.Department of Microbiology and Immunology,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182
【Abstract】 Objective Construction of expression vector of GST-Angiostatin fusion protein.Methods The Angiostatin gene was inserted into the MCS of a fusion gene vector pGEX-2T,the recombinant vector was transformed into E.coli DH5α,extract plasmid DNA,digest plasmid DNA with restriction endonuclease and electrophoresis.Results The recombinant plasmid DNA was digested with restriction endonuclease EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ and Pst Ⅰ,the result demonstrates that the Angiostatin gene was successfully inserted into pGEX-2T.Conclusion Successfully constructing expression vector of GST-Angiostatin fusion protein,can provide an essential preparation for obtaining a larger quantity of recombinant human Angiostatin to study it's anti-tumor effects.
, 百拇医药
【Key words】 Angiostatin Fusion gene vector Gene recombination
血管生成抑制素(Angiostatin)是1994年10月由美国学者O’Reilly等[1]发现的血管生成抑制因子，它通过抑制血管内皮细胞的增殖而抑制新血管的形成。携瘤小鼠试验显示，Angiostatin可抑制血管形成、抑制肿瘤原发灶及转移灶的生长[2，3]。这些发现表明，Angiostatin对于肿瘤转移机理及治疗的研究都有重要意义，有希望发展成为一种新的抗癌药物[4]。我国研究Angiostatin的工作刚刚起步，本研究旨在构建GST-Angiostation融合蛋白原核表达载体，为获得Angiostatin基因工程产品进行肿瘤治疗研究作必要的准备。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 质粒和菌株 PCR2.1A，含Angiostatin全长基因，由中山大学提供；pGEX-2T，是一种融合基因载体，购自安法玛西亚公司；大肠杆菌DH5α，由本室保存。
1.1.2 酶和试剂 实验用限制性内切酶(美国New England Biolabs公司、华美生物工程公司提供)，核糖核酸酶(天象人生物工程公司提供)，低融点琼脂糖(美国BRL公司提供)，胰蛋白胨、酵母浸出物(英国Oxoid公司提供)。其它试剂为国产分析纯试剂。
1.2 重组质粒的构建 参照分子克隆常规方法[5]进行。
2 结果
PCR2.1A含Angiostatin全基因片段，用限制性内切酶EcoR Ⅰ消化PCR2.1A，获得1.0 kb的Angiostatin全基因片段；同样用EcoR Ⅰ消化pGEX-2T，获得4.9 kb的pGEX-2T线性载体片段，把以上两个片段连接起来，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，快提质粒，分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Pst Ⅰ对重组子DNA进行鉴定，筛选出了具有Angiostatin全基因正向插入片段且Angiostatin与GST之间读码框架正确的重组质粒pGEX-2TA。
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3 讨论
虽然肿瘤原发灶的存在可抑制其转移灶生长的现象已被发现多年，但一直都没有找到满意的机制对其进行解释。直到最近，美国学者O'Reilly等在携Lewis肺癌的小鼠尿及血清中分离纯化到一种蛋白—Angiostatin,其分子量分38 kD，相当于人纤维蛋白溶酶原(plasminogen)内的第98～440位氨基酸残基[1]。Angiostatin在体外可抑制bFGF刺激的血管内皮细胞生长、在体内可抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管形成、携瘤小鼠的肿瘤原发灶及转移灶生长以及角膜血管的生成。Angiostatin的发现，对于肿瘤发生、转移机理，特别是肿瘤治疗的研究，都具有重要的意义。以往，肿瘤的治疗手段主要是手术切除、化疗和放疗，如今用Angiostatin进行肿瘤的抗血管生成治疗，减少肿瘤血液供应，切断其营养供给，已成为一种新的肿瘤治疗方向[6，7]。如要用Angiostatin进行肿瘤治疗研究，需要较大剂量的Angiostatin，单纯从携瘤小鼠尿及血清中进行分离费时、费力、成本高，而且获得的量非常少，国外学者已通过基因工程的方法进行基因表达而获得较大量的纯品Angiostatin[8]。
, 百拇医药
pGEX-2T是一种融合基因原核表达载体，它的组成元件基本上与其它表达载体相似，含有强启动子tac及Lac操纵基因、SD序列、Lac Ⅰ阻遏蛋白基因等。此载体与其它载体不同之处是SD序列下游就是GST(谷胱甘肽S-转移酶)基因，GST基因下游的多克隆位点上有编码凝血酶(thrombin)识别位点的序列，外源基因在此插入，高效表达的融合蛋白可用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化，用凝血酶水解回收外源蛋白。实验结果证明了我们在载体设计上的合理性，通过酶切鉴定表明，Angiostatin基因已正向插入载体中，并且Angiostatin与GST之间的读码框架正确。
我们构建的GST-Angiostatin融合蛋白表达载体pGEX-2TA，为高效表达此融合蛋白并获得一定数量的Angiostatin纯品用于肿瘤治疗研究打下基础。
4 参考文献
1 O'Reilly MS,Holmgren L,Shing Y,et al.Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell,1994,79(2):315
, http://www.100md.com
2 O'Reilly MS,Holmgren L, Shing Y,et al. Angiostatin: a circulating endothelial cell inhibitor that supresses angiogenesis and tumor growth.Cold Spring Harb Symp Quant Biol,1994,59:471
3 O'Reilly MS,Holmgren L,Chen C, et al.Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Natl Med,1996,2(6):689
4 Folkman J. Fighting cancer by attacking its blood supply.Sci Am,1996,275(3):150
, http://www.100md.com
5 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning, a laboratory manual.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,1989.16～324
6 Rowe PM.Starve the tumor,save the patient. Lancet,1997,349(9045):108
7 Wu Z,O'Reilly MS,Folkman J,et al.Suppression of tumor growth with recombinant murine angiostatin.Biochem Biophys Res Commun,1997,236(3):651
8 Sim Bk,O'Reilly MS,Liang H,et al.A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer. Cancer Res,1997,57(7):1329, http://www.100md.com(陈广南1 罗进贤2 梁希若1)
单位：1广州医学院微生物学与免疫学教研室(510182)；2中山大学生命科学学院(510275)
关键词：血管生成抑制素；融合基因载体；基因重组
广东医学990202 【摘要】 目的 构建谷胱甘肽S转移酶-血管生成抑制素(GST-Angiostatin)融合蛋白表达载体。方法 把血管生成抑制素(Angiostatin)基因插入融合基因表达载体pGEX-2T的多克隆位点上，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，限制性内切酶消化DNA，琼脂糖凝胶电泳。结果 经限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Pst Ⅰ酶切质粒DNA，电泳结果证明Angiostatin基因已插入到pGEX-2T中。结论 成功构建GST-Angiostatin融合蛋白表达载体，为获得较大量的基因工程Angiostatin产品，为肿瘤治疗研究作必要准备。
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Construction of expression vector of GST-Angiostatin fusion protein Chen Guangnan,Luo Jinxian,Liang Xiruo.Department of Microbiology and Immunology,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182
【Abstract】 Objective Construction of expression vector of GST-Angiostatin fusion protein.Methods The Angiostatin gene was inserted into the MCS of a fusion gene vector pGEX-2T,the recombinant vector was transformed into E.coli DH5α,extract plasmid DNA,digest plasmid DNA with restriction endonuclease and electrophoresis.Results The recombinant plasmid DNA was digested with restriction endonuclease EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ and Pst Ⅰ,the result demonstrates that the Angiostatin gene was successfully inserted into pGEX-2T.Conclusion Successfully constructing expression vector of GST-Angiostatin fusion protein,can provide an essential preparation for obtaining a larger quantity of recombinant human Angiostatin to study it's anti-tumor effects.
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【Key words】 Angiostatin Fusion gene vector Gene recombination
血管生成抑制素(Angiostatin)是1994年10月由美国学者O’Reilly等[1]发现的血管生成抑制因子，它通过抑制血管内皮细胞的增殖而抑制新血管的形成。携瘤小鼠试验显示，Angiostatin可抑制血管形成、抑制肿瘤原发灶及转移灶的生长[2，3]。这些发现表明，Angiostatin对于肿瘤转移机理及治疗的研究都有重要意义，有希望发展成为一种新的抗癌药物[4]。我国研究Angiostatin的工作刚刚起步，本研究旨在构建GST-Angiostation融合蛋白原核表达载体，为获得Angiostatin基因工程产品进行肿瘤治疗研究作必要的准备。
1 材料与方法
1.1 材料
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1.1.1 质粒和菌株 PCR2.1A，含Angiostatin全长基因，由中山大学提供；pGEX-2T，是一种融合基因载体，购自安法玛西亚公司；大肠杆菌DH5α，由本室保存。
1.1.2 酶和试剂 实验用限制性内切酶(美国New England Biolabs公司、华美生物工程公司提供)，核糖核酸酶(天象人生物工程公司提供)，低融点琼脂糖(美国BRL公司提供)，胰蛋白胨、酵母浸出物(英国Oxoid公司提供)。其它试剂为国产分析纯试剂。
1.2 重组质粒的构建 参照分子克隆常规方法[5]进行。
2 结果
PCR2.1A含Angiostatin全基因片段，用限制性内切酶EcoR Ⅰ消化PCR2.1A，获得1.0 kb的Angiostatin全基因片段；同样用EcoR Ⅰ消化pGEX-2T，获得4.9 kb的pGEX-2T线性载体片段，把以上两个片段连接起来，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，快提质粒，分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Pst Ⅰ对重组子DNA进行鉴定，筛选出了具有Angiostatin全基因正向插入片段且Angiostatin与GST之间读码框架正确的重组质粒pGEX-2TA。
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3 讨论
虽然肿瘤原发灶的存在可抑制其转移灶生长的现象已被发现多年，但一直都没有找到满意的机制对其进行解释。直到最近，美国学者O'Reilly等在携Lewis肺癌的小鼠尿及血清中分离纯化到一种蛋白—Angiostatin,其分子量分38 kD，相当于人纤维蛋白溶酶原(plasminogen)内的第98～440位氨基酸残基[1]。Angiostatin在体外可抑制bFGF刺激的血管内皮细胞生长、在体内可抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管形成、携瘤小鼠的肿瘤原发灶及转移灶生长以及角膜血管的生成。Angiostatin的发现，对于肿瘤发生、转移机理，特别是肿瘤治疗的研究，都具有重要的意义。以往，肿瘤的治疗手段主要是手术切除、化疗和放疗，如今用Angiostatin进行肿瘤的抗血管生成治疗，减少肿瘤血液供应，切断其营养供给，已成为一种新的肿瘤治疗方向[6，7]。如要用Angiostatin进行肿瘤治疗研究，需要较大剂量的Angiostatin，单纯从携瘤小鼠尿及血清中进行分离费时、费力、成本高，而且获得的量非常少，国外学者已通过基因工程的方法进行基因表达而获得较大量的纯品Angiostatin[8]。
, 百拇医药
pGEX-2T是一种融合基因原核表达载体，它的组成元件基本上与其它表达载体相似，含有强启动子tac及Lac操纵基因、SD序列、Lac Ⅰ阻遏蛋白基因等。此载体与其它载体不同之处是SD序列下游就是GST(谷胱甘肽S-转移酶)基因，GST基因下游的多克隆位点上有编码凝血酶(thrombin)识别位点的序列，外源基因在此插入，高效表达的融合蛋白可用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化，用凝血酶水解回收外源蛋白。实验结果证明了我们在载体设计上的合理性，通过酶切鉴定表明，Angiostatin基因已正向插入载体中，并且Angiostatin与GST之间的读码框架正确。
我们构建的GST-Angiostatin融合蛋白表达载体pGEX-2TA，为高效表达此融合蛋白并获得一定数量的Angiostatin纯品用于肿瘤治疗研究打下基础。
4 参考文献
1 O'Reilly MS,Holmgren L,Shing Y,et al.Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell,1994,79(2):315
, http://www.100md.com
2 O'Reilly MS,Holmgren L, Shing Y,et al. Angiostatin: a circulating endothelial cell inhibitor that supresses angiogenesis and tumor growth.Cold Spring Harb Symp Quant Biol,1994,59:471
3 O'Reilly MS,Holmgren L,Chen C, et al.Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Natl Med,1996,2(6):689
4 Folkman J. Fighting cancer by attacking its blood supply.Sci Am,1996,275(3):150
, http://www.100md.com
5 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning, a laboratory manual.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,1989.16～324
6 Rowe PM.Starve the tumor,save the patient. Lancet,1997,349(9045):108
7 Wu Z,O'Reilly MS,Folkman J,et al.Suppression of tumor growth with recombinant murine angiostatin.Biochem Biophys Res Commun,1997,236(3):651
8 Sim Bk,O'Reilly MS,Liang H,et al.A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer. Cancer Res,1997,57(7):1329, http://www.100md.com(陈广南1 罗进贤2 梁希若1)