9-蒽羧酸对豚鼠心室肌动作电位和L型Ca电流的影响
作者：周士胜 王跃民 董玲 臧益民
单位：第四军医大学生理学教研室，西安 710032
关键词：9-蒽羧酸；异丙肾上腺素；动作电位；Ca电流
中国应用生理学杂志000106摘要 目的：研究9-蒽羧酸(9-AC)对豚鼠心室肌动作电位(AP)和L型Ca电流(IC a)的影响。方法：电流钳配合制霉菌素膜穿孔方法记录心室肌动作电位， 用全细胞式膜片钳(Whole-cell recording)技术记录ICa。结果：在 低Cl-状态下，β肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素(ISO)可使动作电位时程(APD)明 显延长。9-AC单独使用时对AP无作用，但在ISO的作用下，蛋白磷酸酶抑制剂9-AC可使APD 进一步延长，ISO和9-AC的作用可被Ca2+通道阻断剂硝苯地平(3 μmol/L)所反转。 电压箝实验发现，在β-肾上腺素能受体激动剂ISO激发下，9-AC使ICa的幅度进一 步增加。结论：9-AC与ISO有协同作用。本文结果提示9-AC敏感性蛋白磷酸酶 参与Ca2+通道的调控过程。
, http://www.100md.com
中图分类号： R337.5文献标识码：A 文章编 号：1000-6834(2000)01-0022-04
EFFECTS OF ANTHRACENE-9-CARBOXYLIC ACID ON CARDIAC VENTRICULAR ACTION POTENTIAL DURATION AND L-TYPE Ca2+ CHANNEL IN GUINEA PIG
ZHOU Shi-sheng, WANG Yue-min, DONG Ling, ZANG Yi-min
(Department of Physiology, The Fourth Military Medical Univer sity, Xian 710032)
ABSTRACT
, 百拇医药
Aim and methods: The effects of anthracene-9-carboxylic acid (9-AC) o n guinea pig cardiac ventricular action potential (AP) and L-type Ca2+ cu rrent (ICa) were investigated using the perforated patch recordings and t he whole-cell patch clamp technique, respectively. Results: Under l ow Cl- condition (1.8 mmol/L [Cl-]0/2.5 mmol/L [Cl-]i), isoprote renol (ISO), a B-adrenoceptor agonist, induced a significant increase in the ac tion potential duration (APD), especialty in APD50. 9-AC alone did not sh ow any influence on AP, however, in the presence of ISO, extracellular applicati on of 9-AC made the APD further prolonged. The effects of both ISO and 9-AC w ere reversed completely by a Ca2+ channel blocker, nifedipine (3 μmol/L ). 9-AC was found to increase cardiac L-type Ca2+current (ICa) aft er the channels were first activated by ISO. Conclusion: The present results indicated that there is a synergistic effect of 9-AC and ISO on IC a, suggesting that 9-AC-sensitive phosphatase is responsible not only for th e dephosphorylation of CFTR Cl- channels, but also for that of L-type Ca2 + channels.
, 百拇医药
KEY WORDS: anthracene-9-carboxylic acid; isoprot erenol; action potential; Ca current
最近，我们发现9-蒽羧酸(9-AC)能特异地抑制豚鼠心室肌内某种蛋白磷酸酶(9-AC敏 感性蛋白磷酸酶)，使CFTR(Cystic fibrosis transmemrane conductance regulator)Cl -通道的脱磷化过程明显减慢，因而具有增强异丙肾上腺素(ISO)激发的CFTR Cl-电流 的作用[1]。鉴于上述发现，进一步观察9-AC对其它心肌离子通道的影响，不仅有 助于阐明9-AC的作用机制，而且有助于了解蛋白磷酸酶的作用及其活性调节。由于心室肌L 型Ca2+通道的调控途径与CFTR Cl-通道相似[2]，二者都能被β肾上腺素 能受体激活、细胞内的信号转导都是通过cAMP蛋白激酶A(PKA)-磷酸化途径、通道的关闭 有赖于蛋白磷酸酶的活性等。因此，本文观察了9-AC对L型Ca2+通道的作用，以探讨 9-AC敏感性蛋白磷酸酶与L型Ca2+通道的关系。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 分离单个心室肌细胞
分离单个心室肌细胞所用方法及液体同文献报道[1]，简要步骤如下：雌性豚 鼠 (100～150 g)，苯巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，人工呼吸下行主动脉插管，摘除心 脏，依次用36～37℃台氏液(2～3 min)、无钙台氏液(2～3 min)、含0.1 mg/ml胶原酶(Ya kult)和0.7 mg/ml BSA无钙台氏液(6 min)、KB液(5 min)逆性灌流心脏，之后，剪除心 脏其它组织，将心室部分放入适量KB液中，用剪刀轻轻剪成碎块并过滤，含心肌的KB液室温 下保存备用。
1.2 实验所用液体(mmol/L)
1.2.1 用于电流钳实验的液体 (1)灌流液Na-gluconate 143,K-glu conate 5.4,NaH2PO4 0.3,CaCl2 1.8,MgSO4 0.5,glucose 5.5,HEPES 5(pH用NaOH 调至7.4)。(2)电极液K-aspartate 128.5,KCl 1.5,EGTA 5,MgCl2 0.5,Na2-creat inephosphate 5,Mg-ATP 5,HEPES 5(pH用KOH调至7.35)。
, 百拇医药
1.2.2 记录L型Ca2+电流的液体 (1)灌流液NaCl 104,mannito l 90,MgCl2 0.5,CaCl2 1.8,glncose 5.5,HEPES 5(pH用NaOH调至7.4)。(2)电极液CsC l 85,MgCl2 0.5,EGTA 10,TEA-Cl 20,Na2-Creatinephosphate 5,MgATP 10,glucos e 5.5,HEPES 10(pH用CsOH调至7.35)。
1.3 药品
9-AC、ISO和硝苯地平(Nifedipine)均为Sigma公司产品。9-AC和硝苯地平分别溶于二甲基 亚砜，制成0.5 mol/L和10 mmol/L的母液，经分装后，保存于-20℃冰箱备用。二甲基亚砜 的终浓度<0.2%。
1.4 电生理实验
, 百拇医药
实验选用Φ1.5 mm硅硼玻璃电极毛坯，经拉制后，使充灌后的电极尖端电阻为2.0～ 2.5 MΩ。取100 μl细胞悬液加入灌流槽内，静息5 min使心室肌细胞充分贴壁。在吸破细 胞后，让电极内液与细胞内液平衡5 min，然后再开始正式记录。全细胞记录的膜电流经膜 片钳放大器(Axopatch 200 A)放大，通过Bessel型滤波器(2 kHz)及A/D转换器(PCM 501 ES ，Sony)后，由计算机(PC9801 DX，NEC)采样、分析及处理。方波脉冲由电子刺激器(SEN 3301，Nihon Kohden)产生。记录Ca2+电流时，保持电位为-40 mV，使Na+通道处于 失活状态，同时，细胞内外均采用无K+液，并在电极内液加用TEA,以消除Na+和K+电 流的干扰。
电流钳配合膜穿孔方法记录动作电位：本文采用了Yawo和Chuhma(1993)介绍的改良制霉 菌素穿孔方法[3]。通常在高阻封接形成后，膜电位即进行性降低，膜电位在10 min左右达到静息电位水平。
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实验在室温(23～25°C)下进行。
1.5 统计学处理
文中数据以均数±标准差(
±s)表示，用配对t检验作统计学显著性分 析。 
Fig.1 Effects of anthracene-9- carboxylic acid on cardiac ventricular action potential duration(n=4)
Action potentials were elicited by applying current pulse (1 ms，3 nA) every 10 second.A)1. Control; 2.After 2 min application of ISO (1 μmol/L)；3.ISO+9 -AC(0.5 mmol/L)；4.After washout of 9-AC.B) 1.Control；2.After 2 min applica tion of ISO (1 μmol/L)；3.ISO+9-AC (0.5 mmol/L)；4.After 2 min application o f nifedipine (3 μmol/L)
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2 结果
2.1 9-AC对豚鼠心室肌动作电位时程(APD)的影响
由于β肾上腺素能受体兴奋时，既能激活L型Ca2+通道，又能激活CFTR Cl-通 道，为了尽量减小CFTR Cl-电流对实验结果的干扰，实验中用低Cl-液([Cl-]。 /[Cl-]i＝1.8 mmol/L/2.5 mmol/L)。低Cl-状态下记录的APD基本与文献 报道一致，表明低Cl-对基础动作电位影响不大(表1)。当灌流液中加入ISO(1 μmol/ L)后，APD显著延长，从动作电位起点到复极化完成50%所需的时间(APD50)延长最 明显(表1)，同时平台抬高明显。在ISO作用的基础上，9-AC可使ISO的效应进一步加强(图1 )，而单独使用9-AC(0.5 mmol/L)时，对AP无作用(n＝4，结果未显示)。ISO和9-AC 的作用可被Ca2+通道阻断剂硝苯地平(3 μm)完全反转(图1B,n=4)。ISO和9-AC对 动作电位的幅度无明显影响，提示9-AC延长APD可能与ICa增加有关。
, 百拇医药
2.2 9-AC对豚鼠心室肌L-型Ca电流的影响
在记录ICa时，ISO和9-AC同样会影响到CFTR Cl-通道。根据在等Cl-梯度下 CFTR Cl-电流的反转电位为0 mV这一特性[1]，本文选用等Cl-梯度液体，以降 低CFTR Cl-电流的干扰。实验发现，在ISO作用的基础上，9-AC使ICa幅度进一步 增加(图2，表2)，单用9-AC并不能使ICa幅度增加(n＝4，结果未显示)，表明9 -AC是ISO的协同剂。
Tab.1 Effects of 9-AC on APD(ms)in lower Cl-gradient condition(±s，n＝8) Group
, http://www.100md.com
APD50
APD90
Control
275±52
304±56
ISO(1μmol/L)
2250±325* *
2345±333* *
ISO+9-AC(0.5mmol/L)
2510±340# #
, 百拇医药
2610±348##
* * P<0.01，vs control，## P<0 .01，vs ISO group
3 讨论
众所周知，β肾上腺素能受体兴奋时，可以通过增强ICa，而影响心肌APD。但是 ，长期以来，ISO是延长还是缩短豚鼠心室肌动作电位，历来报道各异，直到近年来CFTR Cl -。通道的发现，争议才得以平息，原因是ISO对ICa和CFTR Cl-电流都有促进作 用[2]。在ISO作用下，APD表现为延长还是缩短，关键在于ICa与CFTR Cl- 电流增强时何者占主导地位。由于CFTR Cl-通道只有在受到β肾上腺素能受体兴奋后才能 被激活，因此，当降低细胞内外Cl-浓度后，APD并无明显改变，但在ISO激发的情况下， 由于CFTR Cl-电流的成分减少，ISO对ICa的增强作用使得APD明显延长，9-AC对IS O的这一效应起到加强作用，并被Ca2+通道阻断剂硝苯地平反转，提示这些变化可能 与L型Ca2+通道有关。研究进一步发现，9-AC对ISO激发下的ICa有增强作用 ，表明9-AC与ISO有协同作用，而且9-AC的作用建立在ISO激发的基础之上，在此方面，9 -AC的作用在性质上与我们前文观察到的9-AC增强ISO激发的CFTR Cl-电流十分相似 [1]，提示9-AC的作用可能与9-AC敏感性蛋白磷酸酶有关，也就是说，9-AC敏感性 蛋白磷酸酶也参与了豚鼠心室肌L-型Ca2+通道的调控。
, 百拇医药
Fig.2 Effects of anthracene-9 -carboxylic acid on cardiac ventricular L-type Ca2+ current in guinea p ig
A) L-type Ca2+ currents were obtained by depolarizing pulse applied every 10 second from holding potential -40 mV to 0 mV with a aduration of 200 ms.B)T ime course of ISO and 9-AC induced changes in the peak inward Ca2+ curre nts.The currents shown in A were obtained at the time indicated by small letter s in B.a.Control， b.After application of ISO(1 μmol/L)， c.ISO(1 μmol/L)+9 -AC(0.5 mmol/L)，d.After washout of 9-AC
, 百拇医药
心肌CFTR Cl-通道和Ca2+通道都受自主神经调控，并参与心肌动作电位的形成 ，有人认为CFTR Cl-电流可能与心律失常有关[4,5]。因此，研究心肌9-AC敏感 性磷酸酶有助于阐明心律失常的发生机制。
Tab.2 Effects of 9-AC on cardiac ventricu alr ICa(±s,n=11) Group
Current Density (nA/nF)
Control
3.26±2.88
ISO(1 μmol/L)
, 百拇医药
12.95±3.47**
ISO+9-AC(0.5mmol/L)
17.14±2.61##
* * P<0.01,vs control, # # P <0.01,vs ISO group
值得指出的是，9-AC有诱发肌僵直作用[6]，并伴有明显的心血管系统反应 [7]。关于该药物的作用机制，长期以来一直存在着争议，有人认为9-AC的作用与抑 制Cl-通道有关[8]，也有人对此持否定观点[9]。根据我们目前的研究 结果，9-AC引起的心血管方面反应可能是9-AC敏感性蛋白磷酸酶受到抑制的结果。
, 百拇医药
综上所述，除了豚鼠心室肌CFTR Cl-通道外，本文发现9-AC敏感性磷酸酶也参与Ca 2+通道的脱磷酸化过程，提示该酶不仅可能有较广泛的底物，而且可能是心肌离子通道 磷酸化调控过程中的重要蛋白磷酸酶之一。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770281)
作者简介：周士胜(1958-)，男，河南武陟县人，副教授，博士， 第四军医大生理学教研室主任，从事心血管生理和细胞信号转导研究
参考文献
[1] Zhou S S, Takai A, Tominaga M， et al. Phosphatase-mediated enh ancement of cardiac cAMP-activated Cl- conductance by a Cl- channel block er, anthracene-9-carboxylate[J].Circ Res,1997，81:219-228.
, 百拇医药
[2] Hume J R, Harvey R D. Chloride conductance pathways in heart.Am J Physio l， 1991，261:C399-412.
[3] Yawo H, Chuhma N. An improved method for perforate patch recordings using nystatin-fluorescein mixture[J]. Jpn J Physiol,1993，43:267-273.
[4] Harvey R D, Clark C D, Hume J R. Chloride current in the mammalian.cardia c myocytes. Novel mechanism for the autonomic regulation of action potential dur ation and resting membrane potential[J].J Gen Physiol,1990，95:1077-1102 .
, 百拇医药
[5] Yamawake N, Hirano Y, Sawanobori T, et al. Arrhythmnogenic effects of isoproterenol activated Cl- current in guinea pig ventricular myocytes[J]. J Mol Cell Cardiol,1992，24:1047-1058.
[6] Brown G L, Harvey A M. Congenital myotonia in the goat[J]. Brain，19 39，62:341-363.
[7] Eddy N B. Studies of phenanthrene derivatives. I. A comparison of p-henan threne and some 2,3 and 9-monosubstitution products[J]. J Pharmacol Exp T her，1933;48:183-198.
, 百拇医药
[8] Bryant S H, Morales Aguilera A. Chloride conductance in normal and myotoni c muscle fibres and the action of monocarboxylic aromatic acids[J]. J Physio l(Lond) ，1971，219:367-383.
[9] Villegas-Navarro A, Bustos E, Gonzalez A, et al. Effect of myotonia i nduced by anthracene-9-carboxylic acid on mitochondrial calcium, plasma creati nine-phosphokinase and aldolase activity in the rat[J].Exp Toxicol Pathol ， 1992，44:34-39.
收稿时间：1998年3月27日；修回时间：1999年 10月22日, http://www.100md.com
单位：第四军医大学生理学教研室，西安 710032
关键词：9-蒽羧酸；异丙肾上腺素；动作电位；Ca电流
中国应用生理学杂志000106摘要 目的：研究9-蒽羧酸(9-AC)对豚鼠心室肌动作电位(AP)和L型Ca电流(IC a)的影响。方法：电流钳配合制霉菌素膜穿孔方法记录心室肌动作电位， 用全细胞式膜片钳(Whole-cell recording)技术记录ICa。结果：在 低Cl-状态下，β肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素(ISO)可使动作电位时程(APD)明 显延长。9-AC单独使用时对AP无作用，但在ISO的作用下，蛋白磷酸酶抑制剂9-AC可使APD 进一步延长，ISO和9-AC的作用可被Ca2+通道阻断剂硝苯地平(3 μmol/L)所反转。 电压箝实验发现，在β-肾上腺素能受体激动剂ISO激发下，9-AC使ICa的幅度进一 步增加。结论：9-AC与ISO有协同作用。本文结果提示9-AC敏感性蛋白磷酸酶 参与Ca2+通道的调控过程。
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中图分类号： R337.5文献标识码：A 文章编 号：1000-6834(2000)01-0022-04
EFFECTS OF ANTHRACENE-9-CARBOXYLIC ACID ON CARDIAC VENTRICULAR ACTION POTENTIAL DURATION AND L-TYPE Ca2+ CHANNEL IN GUINEA PIG
ZHOU Shi-sheng, WANG Yue-min, DONG Ling, ZANG Yi-min
(Department of Physiology, The Fourth Military Medical Univer sity, Xian 710032)
ABSTRACT
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Aim and methods: The effects of anthracene-9-carboxylic acid (9-AC) o n guinea pig cardiac ventricular action potential (AP) and L-type Ca2+ cu rrent (ICa) were investigated using the perforated patch recordings and t he whole-cell patch clamp technique, respectively. Results: Under l ow Cl- condition (1.8 mmol/L [Cl-]0/2.5 mmol/L [Cl-]i), isoprote renol (ISO), a B-adrenoceptor agonist, induced a significant increase in the ac tion potential duration (APD), especialty in APD50. 9-AC alone did not sh ow any influence on AP, however, in the presence of ISO, extracellular applicati on of 9-AC made the APD further prolonged. The effects of both ISO and 9-AC w ere reversed completely by a Ca2+ channel blocker, nifedipine (3 μmol/L ). 9-AC was found to increase cardiac L-type Ca2+current (ICa) aft er the channels were first activated by ISO. Conclusion: The present results indicated that there is a synergistic effect of 9-AC and ISO on IC a, suggesting that 9-AC-sensitive phosphatase is responsible not only for th e dephosphorylation of CFTR Cl- channels, but also for that of L-type Ca2 + channels.
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KEY WORDS: anthracene-9-carboxylic acid; isoprot erenol; action potential; Ca current
最近，我们发现9-蒽羧酸(9-AC)能特异地抑制豚鼠心室肌内某种蛋白磷酸酶(9-AC敏 感性蛋白磷酸酶)，使CFTR(Cystic fibrosis transmemrane conductance regulator)Cl -通道的脱磷化过程明显减慢，因而具有增强异丙肾上腺素(ISO)激发的CFTR Cl-电流 的作用[1]。鉴于上述发现，进一步观察9-AC对其它心肌离子通道的影响，不仅有 助于阐明9-AC的作用机制，而且有助于了解蛋白磷酸酶的作用及其活性调节。由于心室肌L 型Ca2+通道的调控途径与CFTR Cl-通道相似[2]，二者都能被β肾上腺素 能受体激活、细胞内的信号转导都是通过cAMP蛋白激酶A(PKA)-磷酸化途径、通道的关闭 有赖于蛋白磷酸酶的活性等。因此，本文观察了9-AC对L型Ca2+通道的作用，以探讨 9-AC敏感性蛋白磷酸酶与L型Ca2+通道的关系。
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1 材料和方法
1.1 分离单个心室肌细胞
分离单个心室肌细胞所用方法及液体同文献报道[1]，简要步骤如下：雌性豚 鼠 (100～150 g)，苯巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，人工呼吸下行主动脉插管，摘除心 脏，依次用36～37℃台氏液(2～3 min)、无钙台氏液(2～3 min)、含0.1 mg/ml胶原酶(Ya kult)和0.7 mg/ml BSA无钙台氏液(6 min)、KB液(5 min)逆性灌流心脏，之后，剪除心 脏其它组织，将心室部分放入适量KB液中，用剪刀轻轻剪成碎块并过滤，含心肌的KB液室温 下保存备用。
1.2 实验所用液体(mmol/L)
1.2.1 用于电流钳实验的液体 (1)灌流液Na-gluconate 143,K-glu conate 5.4,NaH2PO4 0.3,CaCl2 1.8,MgSO4 0.5,glucose 5.5,HEPES 5(pH用NaOH 调至7.4)。(2)电极液K-aspartate 128.5,KCl 1.5,EGTA 5,MgCl2 0.5,Na2-creat inephosphate 5,Mg-ATP 5,HEPES 5(pH用KOH调至7.35)。
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1.2.2 记录L型Ca2+电流的液体 (1)灌流液NaCl 104,mannito l 90,MgCl2 0.5,CaCl2 1.8,glncose 5.5,HEPES 5(pH用NaOH调至7.4)。(2)电极液CsC l 85,MgCl2 0.5,EGTA 10,TEA-Cl 20,Na2-Creatinephosphate 5,MgATP 10,glucos e 5.5,HEPES 10(pH用CsOH调至7.35)。
1.3 药品
9-AC、ISO和硝苯地平(Nifedipine)均为Sigma公司产品。9-AC和硝苯地平分别溶于二甲基 亚砜，制成0.5 mol/L和10 mmol/L的母液，经分装后，保存于-20℃冰箱备用。二甲基亚砜 的终浓度<0.2%。
1.4 电生理实验
, 百拇医药
实验选用Φ1.5 mm硅硼玻璃电极毛坯，经拉制后，使充灌后的电极尖端电阻为2.0～ 2.5 MΩ。取100 μl细胞悬液加入灌流槽内，静息5 min使心室肌细胞充分贴壁。在吸破细 胞后，让电极内液与细胞内液平衡5 min，然后再开始正式记录。全细胞记录的膜电流经膜 片钳放大器(Axopatch 200 A)放大，通过Bessel型滤波器(2 kHz)及A/D转换器(PCM 501 ES ，Sony)后，由计算机(PC9801 DX，NEC)采样、分析及处理。方波脉冲由电子刺激器(SEN 3301，Nihon Kohden)产生。记录Ca2+电流时，保持电位为-40 mV，使Na+通道处于 失活状态，同时，细胞内外均采用无K+液，并在电极内液加用TEA,以消除Na+和K+电 流的干扰。
电流钳配合膜穿孔方法记录动作电位：本文采用了Yawo和Chuhma(1993)介绍的改良制霉 菌素穿孔方法[3]。通常在高阻封接形成后，膜电位即进行性降低，膜电位在10 min左右达到静息电位水平。
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实验在室温(23～25°C)下进行。
1.5 统计学处理
文中数据以均数±标准差(
±s)表示，用配对t检验作统计学显著性分 析。 Fig.1 Effects of anthracene-9- carboxylic acid on cardiac ventricular action potential duration(n=4)
Action potentials were elicited by applying current pulse (1 ms，3 nA) every 10 second.A)1. Control; 2.After 2 min application of ISO (1 μmol/L)；3.ISO+9 -AC(0.5 mmol/L)；4.After washout of 9-AC.B) 1.Control；2.After 2 min applica tion of ISO (1 μmol/L)；3.ISO+9-AC (0.5 mmol/L)；4.After 2 min application o f nifedipine (3 μmol/L)
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2 结果
2.1 9-AC对豚鼠心室肌动作电位时程(APD)的影响
由于β肾上腺素能受体兴奋时，既能激活L型Ca2+通道，又能激活CFTR Cl-通 道，为了尽量减小CFTR Cl-电流对实验结果的干扰，实验中用低Cl-液([Cl-]。 /[Cl-]i＝1.8 mmol/L/2.5 mmol/L)。低Cl-状态下记录的APD基本与文献 报道一致，表明低Cl-对基础动作电位影响不大(表1)。当灌流液中加入ISO(1 μmol/ L)后，APD显著延长，从动作电位起点到复极化完成50%所需的时间(APD50)延长最 明显(表1)，同时平台抬高明显。在ISO作用的基础上，9-AC可使ISO的效应进一步加强(图1 )，而单独使用9-AC(0.5 mmol/L)时，对AP无作用(n＝4，结果未显示)。ISO和9-AC 的作用可被Ca2+通道阻断剂硝苯地平(3 μm)完全反转(图1B,n=4)。ISO和9-AC对 动作电位的幅度无明显影响，提示9-AC延长APD可能与ICa增加有关。
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2.2 9-AC对豚鼠心室肌L-型Ca电流的影响
在记录ICa时，ISO和9-AC同样会影响到CFTR Cl-通道。根据在等Cl-梯度下 CFTR Cl-电流的反转电位为0 mV这一特性[1]，本文选用等Cl-梯度液体，以降 低CFTR Cl-电流的干扰。实验发现，在ISO作用的基础上，9-AC使ICa幅度进一步 增加(图2，表2)，单用9-AC并不能使ICa幅度增加(n＝4，结果未显示)，表明9 -AC是ISO的协同剂。
Tab.1 Effects of 9-AC on APD(ms)in lower Cl-gradient condition(
±s，n＝8) Group, http://www.100md.com
APD50
APD90
Control
275±52
304±56
ISO(1μmol/L)
2250±325* *
2345±333* *
ISO+9-AC(0.5mmol/L)
2510±340# #
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2610±348##
* * P<0.01，vs control，## P<0 .01，vs ISO group
3 讨论
众所周知，β肾上腺素能受体兴奋时，可以通过增强ICa，而影响心肌APD。但是 ，长期以来，ISO是延长还是缩短豚鼠心室肌动作电位，历来报道各异，直到近年来CFTR Cl -。通道的发现，争议才得以平息，原因是ISO对ICa和CFTR Cl-电流都有促进作 用[2]。在ISO作用下，APD表现为延长还是缩短，关键在于ICa与CFTR Cl- 电流增强时何者占主导地位。由于CFTR Cl-通道只有在受到β肾上腺素能受体兴奋后才能 被激活，因此，当降低细胞内外Cl-浓度后，APD并无明显改变，但在ISO激发的情况下， 由于CFTR Cl-电流的成分减少，ISO对ICa的增强作用使得APD明显延长，9-AC对IS O的这一效应起到加强作用，并被Ca2+通道阻断剂硝苯地平反转，提示这些变化可能 与L型Ca2+通道有关。研究进一步发现，9-AC对ISO激发下的ICa有增强作用 ，表明9-AC与ISO有协同作用，而且9-AC的作用建立在ISO激发的基础之上，在此方面，9 -AC的作用在性质上与我们前文观察到的9-AC增强ISO激发的CFTR Cl-电流十分相似 [1]，提示9-AC的作用可能与9-AC敏感性蛋白磷酸酶有关，也就是说，9-AC敏感性 蛋白磷酸酶也参与了豚鼠心室肌L-型Ca2+通道的调控。
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Fig.2 Effects of anthracene-9 -carboxylic acid on cardiac ventricular L-type Ca2+ current in guinea p ig
A) L-type Ca2+ currents were obtained by depolarizing pulse applied every 10 second from holding potential -40 mV to 0 mV with a aduration of 200 ms.B)T ime course of ISO and 9-AC induced changes in the peak inward Ca2+ curre nts.The currents shown in A were obtained at the time indicated by small letter s in B.a.Control， b.After application of ISO(1 μmol/L)， c.ISO(1 μmol/L)+9 -AC(0.5 mmol/L)，d.After washout of 9-AC
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心肌CFTR Cl-通道和Ca2+通道都受自主神经调控，并参与心肌动作电位的形成 ，有人认为CFTR Cl-电流可能与心律失常有关[4,5]。因此，研究心肌9-AC敏感 性磷酸酶有助于阐明心律失常的发生机制。
Tab.2 Effects of 9-AC on cardiac ventricu alr ICa(
±s,n=11) GroupCurrent Density (nA/nF)
Control
3.26±2.88
ISO(1 μmol/L)
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12.95±3.47**
ISO+9-AC(0.5mmol/L)
17.14±2.61##
* * P<0.01,vs control, # # P <0.01,vs ISO group
值得指出的是，9-AC有诱发肌僵直作用[6]，并伴有明显的心血管系统反应 [7]。关于该药物的作用机制，长期以来一直存在着争议，有人认为9-AC的作用与抑 制Cl-通道有关[8]，也有人对此持否定观点[9]。根据我们目前的研究 结果，9-AC引起的心血管方面反应可能是9-AC敏感性蛋白磷酸酶受到抑制的结果。
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综上所述，除了豚鼠心室肌CFTR Cl-通道外，本文发现9-AC敏感性磷酸酶也参与Ca 2+通道的脱磷酸化过程，提示该酶不仅可能有较广泛的底物，而且可能是心肌离子通道 磷酸化调控过程中的重要蛋白磷酸酶之一。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770281)
作者简介：周士胜(1958-)，男，河南武陟县人，副教授，博士， 第四军医大生理学教研室主任，从事心血管生理和细胞信号转导研究
参考文献
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收稿时间：1998年3月27日；修回时间：1999年 10月22日, http://www.100md.com