IGF-I对ISP损伤大鼠心肌ATP、ADP、AMP变化影响的实验研究
作者：李耀平 柳延春 尹新华 万汇娟 迟月明 于维汉
单位：李耀平(哈尔滨医科大学，第一临床医学院,黑龙江，哈尔滨，150001)；柳延春(哈尔滨市铁路中心医院，黑龙江，哈尔滨，150001)；尹新华(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；万汇娟(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；迟月明(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；于维汉(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)
关键词：生长因子；异丙肾上腺素；高能磷酸化合物
中国地方病学杂志000112 摘 要：目的 研究胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对异丙基肾上腺素(ISP)损伤大鼠心肌ATP、ADP、AMP的影响。方法 采用大鼠ISP心肌损伤动物模型，以IGF-1作保护因素，用高效液相色谱法测定大鼠心肌组织中高能磷酸化合物含量。结果 与正常对照组相比，ISP损伤组ATP水平明显下降，而IGF-I保护组与ISP损伤组相比ATP水平明显升高。结论 IGF-I可抑制ISP所致心肌能量代谢障碍，具有一定的心肌保护作用。
, 百拇医药
中图分类号：R977 文献标识码：A
文章编号：1000-4955(2000)01-0032-02
The study of the effect of IGF-I on content change of
ATP,ADP,AMP of rat myocardium injured by ISP
LI Yao-ping,LIU Yan-chun,YIN Xin-hua,et al
(The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin,150001,China)
Abstract：Objective To study the effect of IGF-I on content change of ATP,ADP and AMP of rat myocardium injured by ISP.Methods Energy-rich phosphate concentrations were delermined by HPLC in myocardium of Wistar rats which were used as animal model of inducing myocardial injury and which were protected by IGF-I.Results The study showed that as compared with control group ATP levels were significantly decreased in ISP group but increase significantly in IGF-I group.Conclusions IGF-I can inhibit the obstacle of energy metabolism induced by ISP and posseses good protection on injured myocardium by ISP,so IGF-I has a definite protective action to myocarddial injury induced by ISP.
, 百拇医药
Key words：IGF-I;ISP;Energy-rich;Phosphate▲
异丙基肾上腺素(Isoproterenol,ISP)是造成心肌损伤的经典动物模型。多年来学者们一直在寻找预防和治疗缺血性心脏病的因素。胰岛素样生长因子-I(Insulin-like Growth Fator-I,IGF-I)是一类具有细胞分化和增殖功能并具有胰岛素样代谢作用的多肽，是属于细胞因子中多肽类生长因子与分化因子的一种[1]。目前分子生物学技术可以提供大量的基因重组IGF-I，并已应用于临床研究。IGF-I的临床用途正在引起广泛重视并已进入临床诊断及治疗疾病的新阶段[2]。IGF-I在缺血性心脏病方面的研究是一个新领域，其对ISP损伤大鼠心肌能量代谢影响的研究尚未见文献报导。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 实验动物：采用健康纯系雄性Wistar大鼠(由白求恩医科大学实验动物学部提供)，体重225±10g，随机分组。
1.1.2 仪器：日本岛津Lc-6A型高效液相色谱仪，SPD-6AV紫外检测器，C-RIB型数据处理机。
1.1.3 ODS柱(250×4.6id 5μm)，流动相是0.05mmol/L磷酸盐缓冲液(KH2PO4/K2HPO4,内含1mmol/L EDTA pH6.0)与甲醇(97.5/2.5v/v)，柱温为室温(20℃～25℃)，流速1.0ml/min，UV 254nm,ATT-3,吸收率0.02，纸速0.5cm/min,进样量5μl。
1.1.4 试剂：rhIGF-I,Promega公司产品，ISP，美国Sigma公司产品，5′-ATP钠盐，5′-ADP钠盐，上海生化所产品，5′-AMP钠盐，美国Sigma公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 动物分组及预处理：将动物随机分为3组，ISP损伤组：腹腔注射ISP 10mg/kg;IGF-I+ISP组：腹腔注射，每只IGF-I 4μg。1小时后，腹腔注射ISP 10mg/kg;对照组：腹腔注射与ISP等体积的生物盐水。末次注射药物24小时后处死动物，按实验要求取材。每组动物7只。
1.2.2 测定方法：采用高效液相色谱测定心肌组织ATP、ADP、AMP的含量[3]。
2 实验结果
大鼠心肌组织腺苷酸含量 采用APT/ADP、ADP/ATP、AMP/ATP分别表示ATP、ADP、AMP。ISP组与IGF-I+ISP组ATP均显著低于对照组(P<0.01)，IGF-I+ISP组ATP明显高于ISP组(P<0.01)；ISP组和IGF-I+ISP组ADP均显著高于对照组(P<0.01,P<0.05)，ISP组ADP明显高于IGF-I+ISP组(P<0.05)；ISP组和IGF-I+ISP组AMP均显著高于对照组(P<0.01)，ISP组AMP明显高于IGF-I+ISP组(P<0.01)，见附表。
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附表 大鼠心肌组织腺苷酸含量(
±s比值) 分组
n
ATP
ADP
AMP
1.对照组
2.ISP
3.IGF-I+ISP
7
7
7
, http://www.100md.com 4.80±3.46
1.60±0.52
2.46±0.43
0.29±0.13
0.69±0.23
0.42±0.09
0.38±0.17
3.32±2.28
1.28±0.82
注：q检验P值，2∶1 P<0.01 2∶1 P<0.01 2∶1 P<0.01；
3∶1 P<0.01 3∶1 P<0.05 3∶1 P<0.01；
, http://www.100md.com
3∶2 P<0.01 3∶2 P<0.05 3∶2 P<0.01
3 讨论
本实验结果显示，ISP损伤心肌细胞时，ATP合成相对减少，而ADP、AMP明显升高，心肌内总腺苷酸池(TAN)即(ATP+ADP+AMP)含量增高。TAN增加102.5%，ADP+AMP增加598.5%,提示：ISP损伤心肌细胞时除了促进ATP的降解外，还有可能抑制ATP的合成，使其前体ADP、AMP蓄积细胞内而不能合成ATP，造成心肌能量代谢障碍。ISP致心肌能量代谢障碍的确切机制还不很清楚。可能的机制如下：①ISP致心肌缺血缺氧，心肌细胞线粒体内呼吸链因电子受体缺乏，电子传递减慢，有氧氧化受抑制,ATP生成下降；②心肌缺氧时心肌细胞及线粒体结构受损，氧化磷酸化障碍，ATP合成减少。推测线粒体的“膜缺陷”将引起线粒体能量的拆偶联作用，同时激发呼吸链的旁路反应，促进超氧自由基的生成，它们的增加又势必进一步加深心肌线粒体的膜损伤，形成恶性循环。再有由于线粒体膜受损致ADP摄入率下降。在线粒体内膜有特异性催化ADP-ATP交换反应的腺苷转移酶，将线粒体内ATP运到胞质，而将胞质的ADP运到线粒体。心肌缺血时，此酶活性下降，促使ATP合成减少；③由于心肌缺血，心肌细胞钙超载，线粒体内Ca2+聚集[4]，Ca2+与磷酸根形成磷酸钙沉淀，干扰氧化磷酸化功能，使ATP合成减少。综上所述，ISP致心肌缺血缺氧，能量消耗增加，而合成减少，终致能量耗竭，引发心肌细胞死亡[5]。
, http://www.100md.com
本实验结果证明，IGF-I保护组ATP含量明显高于ISP损伤组，而ADP、AMP则较ISP损伤组为低，提示IGF-I具有促进ATP生成同时抑制ATP降解的作用。心肌细胞是全身耗能最大的细胞之一，其能量代谢发生障碍，必然会引起其功能障碍，甚至结构破坏。IGF-I在细胞水平的这种遏制ISP导致能量代谢障碍，促进ATP生成的生物效应，无疑对保护心肌细胞起到一个积极的作用。能量代谢障碍是心肌细胞损伤的始动环节。因此，心肌细胞保护的首要问题是阻止损伤因素导致的能量代谢障碍，从而避免继发氧自由基、钙超载等的发生，使其不能形成恶性循环圈，减轻心肌损伤。因此可以推测IGF-I对缺血性心肌损伤(包括克山病的心肌损伤)，可有一定的保护作用。■
作者简介：李耀平，男，1964年生，主治医师，博士
参考文献：
[1]彭葆坤，周 宁.IGF-I临床应用探讨[J].天津医药，1996，24(8)：506.
, http://www.100md.com
[2]李郑芳.胰岛素样生长因子-I与骨重建[J].国外医学内分泌学分册，1994，14(4)：186.
[3]孟宪清，李群伟，朱大岭，等.高效液相色谱测定组织中ATP、ADP、AMP含量的方法[J].哈尔滨医科大学学报，1995，29(6)：490.
[4]Page E.Quantitative utrastructural analysis in cardiac membrane physiology[J].Am J physiol,1978,235(5):C147.
[5]Ohta H,Azuma J,Awata N,Hamaguchi T,et al.Mechanism of the protective action of taurine against isoprenaline induced myocardial damage[J].Cordiovasc Res,1988,22(6):407.
收稿日期：1999-10-15, 百拇医药
单位：李耀平(哈尔滨医科大学，第一临床医学院,黑龙江，哈尔滨，150001)；柳延春(哈尔滨市铁路中心医院，黑龙江，哈尔滨，150001)；尹新华(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；万汇娟(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；迟月明(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；于维汉(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)
关键词：生长因子；异丙肾上腺素；高能磷酸化合物
中国地方病学杂志000112 摘 要：目的 研究胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对异丙基肾上腺素(ISP)损伤大鼠心肌ATP、ADP、AMP的影响。方法 采用大鼠ISP心肌损伤动物模型，以IGF-1作保护因素，用高效液相色谱法测定大鼠心肌组织中高能磷酸化合物含量。结果 与正常对照组相比，ISP损伤组ATP水平明显下降，而IGF-I保护组与ISP损伤组相比ATP水平明显升高。结论 IGF-I可抑制ISP所致心肌能量代谢障碍，具有一定的心肌保护作用。
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中图分类号：R977 文献标识码：A
文章编号：1000-4955(2000)01-0032-02
The study of the effect of IGF-I on content change of
ATP,ADP,AMP of rat myocardium injured by ISP
LI Yao-ping,LIU Yan-chun,YIN Xin-hua,et al
(The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin,150001,China)
Abstract：Objective To study the effect of IGF-I on content change of ATP,ADP and AMP of rat myocardium injured by ISP.Methods Energy-rich phosphate concentrations were delermined by HPLC in myocardium of Wistar rats which were used as animal model of inducing myocardial injury and which were protected by IGF-I.Results The study showed that as compared with control group ATP levels were significantly decreased in ISP group but increase significantly in IGF-I group.Conclusions IGF-I can inhibit the obstacle of energy metabolism induced by ISP and posseses good protection on injured myocardium by ISP,so IGF-I has a definite protective action to myocarddial injury induced by ISP.
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Key words：IGF-I;ISP;Energy-rich;Phosphate▲
异丙基肾上腺素(Isoproterenol,ISP)是造成心肌损伤的经典动物模型。多年来学者们一直在寻找预防和治疗缺血性心脏病的因素。胰岛素样生长因子-I(Insulin-like Growth Fator-I,IGF-I)是一类具有细胞分化和增殖功能并具有胰岛素样代谢作用的多肽，是属于细胞因子中多肽类生长因子与分化因子的一种[1]。目前分子生物学技术可以提供大量的基因重组IGF-I，并已应用于临床研究。IGF-I的临床用途正在引起广泛重视并已进入临床诊断及治疗疾病的新阶段[2]。IGF-I在缺血性心脏病方面的研究是一个新领域，其对ISP损伤大鼠心肌能量代谢影响的研究尚未见文献报导。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 实验动物：采用健康纯系雄性Wistar大鼠(由白求恩医科大学实验动物学部提供)，体重225±10g，随机分组。
1.1.2 仪器：日本岛津Lc-6A型高效液相色谱仪，SPD-6AV紫外检测器，C-RIB型数据处理机。
1.1.3 ODS柱(250×4.6id 5μm)，流动相是0.05mmol/L磷酸盐缓冲液(KH2PO4/K2HPO4,内含1mmol/L EDTA pH6.0)与甲醇(97.5/2.5v/v)，柱温为室温(20℃～25℃)，流速1.0ml/min，UV 254nm,ATT-3,吸收率0.02，纸速0.5cm/min,进样量5μl。
1.1.4 试剂：rhIGF-I,Promega公司产品，ISP，美国Sigma公司产品，5′-ATP钠盐，5′-ADP钠盐，上海生化所产品，5′-AMP钠盐，美国Sigma公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 动物分组及预处理：将动物随机分为3组，ISP损伤组：腹腔注射ISP 10mg/kg;IGF-I+ISP组：腹腔注射，每只IGF-I 4μg。1小时后，腹腔注射ISP 10mg/kg;对照组：腹腔注射与ISP等体积的生物盐水。末次注射药物24小时后处死动物，按实验要求取材。每组动物7只。
1.2.2 测定方法：采用高效液相色谱测定心肌组织ATP、ADP、AMP的含量[3]。
2 实验结果
大鼠心肌组织腺苷酸含量 采用APT/ADP、ADP/ATP、AMP/ATP分别表示ATP、ADP、AMP。ISP组与IGF-I+ISP组ATP均显著低于对照组(P<0.01)，IGF-I+ISP组ATP明显高于ISP组(P<0.01)；ISP组和IGF-I+ISP组ADP均显著高于对照组(P<0.01,P<0.05)，ISP组ADP明显高于IGF-I+ISP组(P<0.05)；ISP组和IGF-I+ISP组AMP均显著高于对照组(P<0.01)，ISP组AMP明显高于IGF-I+ISP组(P<0.01)，见附表。
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附表 大鼠心肌组织腺苷酸含量(
±s比值) 分组n
ATP
ADP
AMP
1.对照组
2.ISP
3.IGF-I+ISP
7
7
7
, http://www.100md.com 4.80±3.46
1.60±0.52
2.46±0.43
0.29±0.13
0.69±0.23
0.42±0.09
0.38±0.17
3.32±2.28
1.28±0.82
注：q检验P值，2∶1 P<0.01 2∶1 P<0.01 2∶1 P<0.01；
3∶1 P<0.01 3∶1 P<0.05 3∶1 P<0.01；
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3∶2 P<0.01 3∶2 P<0.05 3∶2 P<0.01
3 讨论
本实验结果显示，ISP损伤心肌细胞时，ATP合成相对减少，而ADP、AMP明显升高，心肌内总腺苷酸池(TAN)即(ATP+ADP+AMP)含量增高。TAN增加102.5%，ADP+AMP增加598.5%,提示：ISP损伤心肌细胞时除了促进ATP的降解外，还有可能抑制ATP的合成，使其前体ADP、AMP蓄积细胞内而不能合成ATP，造成心肌能量代谢障碍。ISP致心肌能量代谢障碍的确切机制还不很清楚。可能的机制如下：①ISP致心肌缺血缺氧，心肌细胞线粒体内呼吸链因电子受体缺乏，电子传递减慢，有氧氧化受抑制,ATP生成下降；②心肌缺氧时心肌细胞及线粒体结构受损，氧化磷酸化障碍，ATP合成减少。推测线粒体的“膜缺陷”将引起线粒体能量的拆偶联作用，同时激发呼吸链的旁路反应，促进超氧自由基的生成，它们的增加又势必进一步加深心肌线粒体的膜损伤，形成恶性循环。再有由于线粒体膜受损致ADP摄入率下降。在线粒体内膜有特异性催化ADP-ATP交换反应的腺苷转移酶，将线粒体内ATP运到胞质，而将胞质的ADP运到线粒体。心肌缺血时，此酶活性下降，促使ATP合成减少；③由于心肌缺血，心肌细胞钙超载，线粒体内Ca2+聚集[4]，Ca2+与磷酸根形成磷酸钙沉淀，干扰氧化磷酸化功能，使ATP合成减少。综上所述，ISP致心肌缺血缺氧，能量消耗增加，而合成减少，终致能量耗竭，引发心肌细胞死亡[5]。
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本实验结果证明，IGF-I保护组ATP含量明显高于ISP损伤组，而ADP、AMP则较ISP损伤组为低，提示IGF-I具有促进ATP生成同时抑制ATP降解的作用。心肌细胞是全身耗能最大的细胞之一，其能量代谢发生障碍，必然会引起其功能障碍，甚至结构破坏。IGF-I在细胞水平的这种遏制ISP导致能量代谢障碍，促进ATP生成的生物效应，无疑对保护心肌细胞起到一个积极的作用。能量代谢障碍是心肌细胞损伤的始动环节。因此，心肌细胞保护的首要问题是阻止损伤因素导致的能量代谢障碍，从而避免继发氧自由基、钙超载等的发生，使其不能形成恶性循环圈，减轻心肌损伤。因此可以推测IGF-I对缺血性心肌损伤(包括克山病的心肌损伤)，可有一定的保护作用。■
作者简介：李耀平，男，1964年生，主治医师，博士
参考文献：
[1]彭葆坤，周 宁.IGF-I临床应用探讨[J].天津医药，1996，24(8)：506.
, http://www.100md.com
[2]李郑芳.胰岛素样生长因子-I与骨重建[J].国外医学内分泌学分册，1994，14(4)：186.
[3]孟宪清，李群伟，朱大岭，等.高效液相色谱测定组织中ATP、ADP、AMP含量的方法[J].哈尔滨医科大学学报，1995，29(6)：490.
[4]Page E.Quantitative utrastructural analysis in cardiac membrane physiology[J].Am J physiol,1978,235(5):C147.
[5]Ohta H,Azuma J,Awata N,Hamaguchi T,et al.Mechanism of the protective action of taurine against isoprenaline induced myocardial damage[J].Cordiovasc Res,1988,22(6):407.
收稿日期：1999-10-15, 百拇医药