诊断超声对不同发育阶段大鼠睾丸组织凋亡的研究
作者：杜联芳 张青萍 刘望彭
单位：杜联芳(同济医科大学附属同济医院超声科，湖北 武汉 430030)；张青萍(同济医科大学附属同济医院超声科，湖北 武汉 430030)；刘望彭(山西医科大学附属第一医院)
关键词：睾丸；超声；凋亡
中国医学影像技术000746[摘 要] 目的 探讨诊断超声对不同发育阶段大鼠睾丸组织生精细胞凋亡的影响。方法 36只SD雄性大鼠随机分为6组。应用HP8500彩超仪对大鼠睾丸进行30 min持续照射，24h后取睾丸进行凋亡检测。结果 不同年龄组生精细胞均有不同程度的细胞凋亡，以出生后30d凋亡细胞数最多，随年龄增长凋亡细胞数有减少趋势。超声照射30min后各实验组凋亡细胞数均有显著增加。结论 不同发育阶段大鼠睾丸生精细胞凋亡率不同，超声照射30min后可引起各组生精细胞凋亡增加。
[中图分类号] R445.1 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 1003-3289(2000)07-0609-02
Study of Apoptosis in Different Age Rat Testes after Diagnostic Ultrasound Radiation
DU Lian-fang, ZHANG Qing-ping,LIU Wang-peng
(Department of Ultrasound,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030, China)
[Abstract] Objective To investigate the germ cell apoptosis in different age rat testes after diagnostic ultrasound. Methods 36 male Sprague-Danles rats were randomly separated into six groups of six according to different ages. Rat testes were radiated by HP 8500 color Doppler sonography with 7.5MHz linear phased array transducer for 30 minutes. Their testes were removed at 24 hour after radiation. Apoptosis was detected with TUNEL (in situterminal deoxynucleotityl transferase-mediated dUTP nick end labeling). Results The incidence of testicular germ cell apoptosis in all groups was detected and peaked at post-birth 30 days;after radiation apoptotic incidence in all experimental groups was significantly higher than control groups (P<0.001). Conclusion Germ cell apoptotic incidence varied in different age rat; radiation continuously 30 minutes by diagnostic ultrasound may result in germ cell apoptosis increasing in the different age rat testes.
, http://www.100md.com
[Key words] Testes; Ultrasound; Apoptosis
凋亡是机体清除感染、变异及衰老细胞而维持机体生理状态的主要调节方式之一。缺血、高温及γ射线都可引起睾丸生殖细胞凋亡[1-3]。但是诊断超声照射后是否会引起不同发育阶段睾丸生精细胞凋亡，我们进行了以下实验。
1 资料与方法
1.1 实验动物分组及模型标本制备 健康SD雄性大鼠36只(山西医科大学实验动物中心提供)，根据出生后不同的年龄随机分为6组：I组(出生后30天)，II组(出生后30天，对照组)，III组(出生后45天)，IV组(出生后45天，对照组)，V组(出生后60天)，VI组(出生后60天，对照组)。使用仪器为HP 8500彩色多普勒超声诊断仪，探头频率7.5MHz，超声输出功率6.8mW，空间平均时间平均声强(ISATA)为3.4mW/cm2，该声学参数由山西省计量测试研究所使用C-1型毫瓦级超声功率计测试。采用特制支架，将大鼠固定于三合板上，探头置于会阴部，直接接触睾丸，固定持续照射30分钟，II，IV，VI组为对照组。照射后24小时用3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射，麻醉后取出睾丸，置于10%甲醛溶液中固定24小时，常规石蜡包埋、切片(4μm)，将切片捞于预先涂有黏片剂的载玻片上，57℃烤箱烘干30分钟。
, http://www.100md.com
1.2 TUNEL技术 对上述特殊处理的石蜡切片，用二甲苯脱蜡，梯度酒精入水，BPS水化玻片，蛋白酶K透化组织，PBS漂洗5分钟×3次，TUNEL试验盒由德国Boechringer Mannheim公司提供，操作步骤按试剂盒说明书进行。阴性对照组标本上只加标记液，不加酶溶液，其余各步同上。光学显镜下观察凋亡细胞并计数，每张切片选10个高倍视野(1000×)，计数正常细胞和凋亡细胞，求出凋亡细胞百分比。
1.3 统计分析 各辐照组间及辐照组与对照组间凋亡细胞比较采用χ2检验。
2 结果
凋亡阳性细胞判断标准：强阳性细胞细胞核呈棕褐色，弱阳性细胞细胞核呈浅棕色，阴性细胞细胞核不着色。不同年龄组正常大鼠睾丸组织内生精细胞均有不同程度的细胞凋亡，以出生后30天组凋亡细胞数最多，随年龄增长其凋亡细胞数逐渐减少，强阳性细胞各组之间无差异(P>0.05)，但弱阳性细胞随年龄增加而明显减少(P<0.001)。诊
, 百拇医药
图1 诊断超声照射大鼠睾丸30分钟后30天年龄组
生精细胞凋亡细胞增加最多(1000 X油镜)
图2 诊断超声照射大鼠睾丸30分钟后性成熟组
生精细胞凋亡细胞增加(1000X油镜)
表1 诊断超声对不同年龄组生精细胞凋亡的
研究及比较表(
±s) 组 别
强阳性率(%)
弱阳性率(%)
, http://www.100md.com
总阳性率(%)
I组(n=6)
7.64±3.85※
39.67±14.28※
47.31±16.13※
II组(n=6)
0.67±0.19
31.59±12.45
32.26±12.54
III组(n=6)
6.08±3.27※△
, 百拇医药
36.38±13.24※△
42.46±16.15※△
IV组(n=6)
0.65±0.10
28.86±10.988
29.51±11.088
V组(n=6)
4.83±2.52※△
30.09±11.17※△
34.29±12.68※△
, 百拇医药
VI组(n=6)
0.60±0.08
24.73±"8.828
25.33±"8.888
※表示与对照组相比差异有显著性(P<0.001)；△表示与I，III组相比差异有显著性(P<0.001)；8表示与II，IV组相比差异有显著性(P<0.001)断超声照射30分钟后，各实验组凋亡细胞数均有所增加，以出生后30天组凋亡细胞数增加最多(见图1)，性成熟组增加最少，但仍显著高于对照组(P<0.001)(见图2)。对照组、实验组及各组间的测值见表1。3 讨论
正常生理状态下生精细胞的凋亡受到生殖激素的调控，对大鼠等啮齿目动物的研究表明，精原细胞、精母细胞和精子细胞均存在凋亡，其凋亡水平与年龄、血清促性腺激素水平特别是FSH水平，以及曲细精管特殊的生精上皮时相有关[4]。光照时间的长短也可影响睾丸组织的凋亡，有实验将雄性小鼠的光照时间由正常的12小时光照、12小时黑暗改变为短光照组(8小时光照，16小时黑暗)和长光照组(16小时光照，8小时黑暗)，如此持续2、4、6、8、10周，如期切除睾丸探测凋亡活性，结果发现除2周外，其它各组短光照时间组比长光照时间组每个曲细精管内凋亡细胞增加2～3倍[5]。本研究发现：正常对照组各级生精细胞的总凋亡率随年龄的增长而减少，出生后30天达(32.26±12.54)%，45天达(29.51±11.08)%，性成熟期(60天)达(25.33±8.88)%，说明生精细胞的总凋亡率在出生后1个月达高峰。在男性的生长发育过程中，大约75%以上的生精细胞经过凋亡而死亡[6]，而且生精细胞的凋亡主要在初级精母细胞阶段。
, 百拇医药
诊断超声的生物效应包括空化效应、机械效应和热效应，这些效应与细胞凋亡之间有何联系尚不清楚。我们对不同年龄组的雄性大鼠睾丸进行了30分钟诊断超声持续照射，发现照射后24小时各组生精细胞的凋亡百分率均明显增加，但增加程度不一致，其强阳性率、弱阳性率和总阳性率均在出生后30天组最高，显著大于各实验组和对照组，说明在大鼠睾丸组织的不同发育阶段，其生精细胞的凋亡率具有显著差异。
细胞凋亡，亦称程序性细胞死亡。近年来在生物学、医学等领域备受关注，细胞凋亡机制的研究日新月异。现认为细胞凋亡过程大体可分为三个阶段：诱导期(induction phase)、效应期(effect phase)和降解期(degradation phase)。各种不同的内外刺激经相应受体或目前尚不清楚的途径激发凋亡信号传导，通过效应分子相互作用引起caspase家族的级联反应，降解各种细胞内底物，随之出现细胞凋亡现象。诊断超声引起大鼠睾丸组织生精细胞凋亡增加，是通过什么途径尚待进一步研究。
, http://www.100md.com 作者简介：杜联芳(1958—)，女，山西人，博士，教授。
[参考文献]
[1] Simsek F,Turkeri L,Cevik L,et al. Role of apoptosis in testicular tissue damage caused by varicocele[J]. Arch Exp Urol,1998,51:947-950.
[2] Turner TT,Tung KS,Tomoasa H,et al. Acute testicular ischemia results in germ cell specific apoptosis in the rat[J]. Biol Report,1997,57:1267-1274.
[3] Hasegawa M,Wilson G,Russell LD,et al. Radiation induced cell death in he mouse testis:relationship to apoptosis[J]. Radiat Res,1997,14:457-467.
, http://www.100md.com
[4] Hakan Billing,Itsuko Furuta,Catherine Rivier,et al. Apoptosis in testis germ cells:developmental changes in gonadotropin dependence and localization to selective tubule stages[J]. Endocrinology,1995,136:5-12.
[5] Young KA,Zirkin BR,Nelson RJ. Short photoperiods evoke testicular apoptosis in white-footed mices (Peromyscus leucopus)[J]. Endocrinology,1999,140:3133-3139.
[6] Reyes Fuentes A,Chavarria Olarte ME. The participation of apoptosis in the development and function of the male gonad[J]. Ginecol Obstet,1999,67:330-340.
(收稿日期：1999-12-12), 百拇医药
单位：杜联芳(同济医科大学附属同济医院超声科，湖北 武汉 430030)；张青萍(同济医科大学附属同济医院超声科，湖北 武汉 430030)；刘望彭(山西医科大学附属第一医院)
关键词：睾丸；超声；凋亡
中国医学影像技术000746[摘 要] 目的 探讨诊断超声对不同发育阶段大鼠睾丸组织生精细胞凋亡的影响。方法 36只SD雄性大鼠随机分为6组。应用HP8500彩超仪对大鼠睾丸进行30 min持续照射，24h后取睾丸进行凋亡检测。结果 不同年龄组生精细胞均有不同程度的细胞凋亡，以出生后30d凋亡细胞数最多，随年龄增长凋亡细胞数有减少趋势。超声照射30min后各实验组凋亡细胞数均有显著增加。结论 不同发育阶段大鼠睾丸生精细胞凋亡率不同，超声照射30min后可引起各组生精细胞凋亡增加。
[中图分类号] R445.1 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 1003-3289(2000)07-0609-02
Study of Apoptosis in Different Age Rat Testes after Diagnostic Ultrasound Radiation
DU Lian-fang, ZHANG Qing-ping,LIU Wang-peng
(Department of Ultrasound,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030, China)
[Abstract] Objective To investigate the germ cell apoptosis in different age rat testes after diagnostic ultrasound. Methods 36 male Sprague-Danles rats were randomly separated into six groups of six according to different ages. Rat testes were radiated by HP 8500 color Doppler sonography with 7.5MHz linear phased array transducer for 30 minutes. Their testes were removed at 24 hour after radiation. Apoptosis was detected with TUNEL (in situterminal deoxynucleotityl transferase-mediated dUTP nick end labeling). Results The incidence of testicular germ cell apoptosis in all groups was detected and peaked at post-birth 30 days;after radiation apoptotic incidence in all experimental groups was significantly higher than control groups (P<0.001). Conclusion Germ cell apoptotic incidence varied in different age rat; radiation continuously 30 minutes by diagnostic ultrasound may result in germ cell apoptosis increasing in the different age rat testes.
, http://www.100md.com
[Key words] Testes; Ultrasound; Apoptosis
凋亡是机体清除感染、变异及衰老细胞而维持机体生理状态的主要调节方式之一。缺血、高温及γ射线都可引起睾丸生殖细胞凋亡[1-3]。但是诊断超声照射后是否会引起不同发育阶段睾丸生精细胞凋亡，我们进行了以下实验。
1 资料与方法
1.1 实验动物分组及模型标本制备 健康SD雄性大鼠36只(山西医科大学实验动物中心提供)，根据出生后不同的年龄随机分为6组：I组(出生后30天)，II组(出生后30天，对照组)，III组(出生后45天)，IV组(出生后45天，对照组)，V组(出生后60天)，VI组(出生后60天，对照组)。使用仪器为HP 8500彩色多普勒超声诊断仪，探头频率7.5MHz，超声输出功率6.8mW，空间平均时间平均声强(ISATA)为3.4mW/cm2，该声学参数由山西省计量测试研究所使用C-1型毫瓦级超声功率计测试。采用特制支架，将大鼠固定于三合板上，探头置于会阴部，直接接触睾丸，固定持续照射30分钟，II，IV，VI组为对照组。照射后24小时用3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射，麻醉后取出睾丸，置于10%甲醛溶液中固定24小时，常规石蜡包埋、切片(4μm)，将切片捞于预先涂有黏片剂的载玻片上，57℃烤箱烘干30分钟。
, http://www.100md.com
1.2 TUNEL技术 对上述特殊处理的石蜡切片，用二甲苯脱蜡，梯度酒精入水，BPS水化玻片，蛋白酶K透化组织，PBS漂洗5分钟×3次，TUNEL试验盒由德国Boechringer Mannheim公司提供，操作步骤按试剂盒说明书进行。阴性对照组标本上只加标记液，不加酶溶液，其余各步同上。光学显镜下观察凋亡细胞并计数，每张切片选10个高倍视野(1000×)，计数正常细胞和凋亡细胞，求出凋亡细胞百分比。
1.3 统计分析 各辐照组间及辐照组与对照组间凋亡细胞比较采用χ2检验。
2 结果
凋亡阳性细胞判断标准：强阳性细胞细胞核呈棕褐色，弱阳性细胞细胞核呈浅棕色，阴性细胞细胞核不着色。不同年龄组正常大鼠睾丸组织内生精细胞均有不同程度的细胞凋亡，以出生后30天组凋亡细胞数最多，随年龄增长其凋亡细胞数逐渐减少，强阳性细胞各组之间无差异(P>0.05)，但弱阳性细胞随年龄增加而明显减少(P<0.001)。诊
, 百拇医药
图1 诊断超声照射大鼠睾丸30分钟后30天年龄组
生精细胞凋亡细胞增加最多(1000 X油镜)
图2 诊断超声照射大鼠睾丸30分钟后性成熟组
生精细胞凋亡细胞增加(1000X油镜)
表1 诊断超声对不同年龄组生精细胞凋亡的
研究及比较表(
±s) 组 别强阳性率(%)
弱阳性率(%)
, http://www.100md.com
总阳性率(%)
I组(n=6)
7.64±3.85※
39.67±14.28※
47.31±16.13※
II组(n=6)
0.67±0.19
31.59±12.45
32.26±12.54
III组(n=6)
6.08±3.27※△
, 百拇医药
36.38±13.24※△
42.46±16.15※△
IV组(n=6)
0.65±0.10
28.86±10.988
29.51±11.088
V组(n=6)
4.83±2.52※△
30.09±11.17※△
34.29±12.68※△
, 百拇医药
VI组(n=6)
0.60±0.08
24.73±"8.828
25.33±"8.888
※表示与对照组相比差异有显著性(P<0.001)；△表示与I，III组相比差异有显著性(P<0.001)；8表示与II，IV组相比差异有显著性(P<0.001)断超声照射30分钟后，各实验组凋亡细胞数均有所增加，以出生后30天组凋亡细胞数增加最多(见图1)，性成熟组增加最少，但仍显著高于对照组(P<0.001)(见图2)。对照组、实验组及各组间的测值见表1。3 讨论
正常生理状态下生精细胞的凋亡受到生殖激素的调控，对大鼠等啮齿目动物的研究表明，精原细胞、精母细胞和精子细胞均存在凋亡，其凋亡水平与年龄、血清促性腺激素水平特别是FSH水平，以及曲细精管特殊的生精上皮时相有关[4]。光照时间的长短也可影响睾丸组织的凋亡，有实验将雄性小鼠的光照时间由正常的12小时光照、12小时黑暗改变为短光照组(8小时光照，16小时黑暗)和长光照组(16小时光照，8小时黑暗)，如此持续2、4、6、8、10周，如期切除睾丸探测凋亡活性，结果发现除2周外，其它各组短光照时间组比长光照时间组每个曲细精管内凋亡细胞增加2～3倍[5]。本研究发现：正常对照组各级生精细胞的总凋亡率随年龄的增长而减少，出生后30天达(32.26±12.54)%，45天达(29.51±11.08)%，性成熟期(60天)达(25.33±8.88)%，说明生精细胞的总凋亡率在出生后1个月达高峰。在男性的生长发育过程中，大约75%以上的生精细胞经过凋亡而死亡[6]，而且生精细胞的凋亡主要在初级精母细胞阶段。
, 百拇医药
诊断超声的生物效应包括空化效应、机械效应和热效应，这些效应与细胞凋亡之间有何联系尚不清楚。我们对不同年龄组的雄性大鼠睾丸进行了30分钟诊断超声持续照射，发现照射后24小时各组生精细胞的凋亡百分率均明显增加，但增加程度不一致，其强阳性率、弱阳性率和总阳性率均在出生后30天组最高，显著大于各实验组和对照组，说明在大鼠睾丸组织的不同发育阶段，其生精细胞的凋亡率具有显著差异。
细胞凋亡，亦称程序性细胞死亡。近年来在生物学、医学等领域备受关注，细胞凋亡机制的研究日新月异。现认为细胞凋亡过程大体可分为三个阶段：诱导期(induction phase)、效应期(effect phase)和降解期(degradation phase)。各种不同的内外刺激经相应受体或目前尚不清楚的途径激发凋亡信号传导，通过效应分子相互作用引起caspase家族的级联反应，降解各种细胞内底物，随之出现细胞凋亡现象。诊断超声引起大鼠睾丸组织生精细胞凋亡增加，是通过什么途径尚待进一步研究。
, http://www.100md.com 作者简介：杜联芳(1958—)，女，山西人，博士，教授。
[参考文献]
[1] Simsek F,Turkeri L,Cevik L,et al. Role of apoptosis in testicular tissue damage caused by varicocele[J]. Arch Exp Urol,1998,51:947-950.
[2] Turner TT,Tung KS,Tomoasa H,et al. Acute testicular ischemia results in germ cell specific apoptosis in the rat[J]. Biol Report,1997,57:1267-1274.
[3] Hasegawa M,Wilson G,Russell LD,et al. Radiation induced cell death in he mouse testis:relationship to apoptosis[J]. Radiat Res,1997,14:457-467.
, http://www.100md.com
[4] Hakan Billing,Itsuko Furuta,Catherine Rivier,et al. Apoptosis in testis germ cells:developmental changes in gonadotropin dependence and localization to selective tubule stages[J]. Endocrinology,1995,136:5-12.
[5] Young KA,Zirkin BR,Nelson RJ. Short photoperiods evoke testicular apoptosis in white-footed mices (Peromyscus leucopus)[J]. Endocrinology,1999,140:3133-3139.
[6] Reyes Fuentes A,Chavarria Olarte ME. The participation of apoptosis in the development and function of the male gonad[J]. Ginecol Obstet,1999,67:330-340.
(收稿日期：1999-12-12), 百拇医药