鼻咽血管纤维瘤雄激素受体的免疫组化检测
作者：祝小林 刘少英
单位：祝小林(江西医学院第二附属医院耳鼻咽喉科 南昌，330006)；刘少英(江西医学院第二附属医院耳鼻咽喉科 南昌，330006)
关键词：
临床耳鼻咽喉科杂志000216 鼻咽血管纤维瘤(Juvenile nasopharyngeal angiofibroma,JNA)多发于青春期男性。Martin(1948)和Schiff(1959)首次报道JNA与性激素有关。这说明类固醇性激素在JNA的发病和发展中可能有重要作用。近些年来，人们采用葡聚糖包裹活性碳吸附法(DCC法)对这一问题进行实质性探讨。但迄今为止，很少见到有关采用过氧化酶标记的链霉卵白素法(streptavidin peroxidase,SP法)，检测JNA组织中雄激素受体(androgen receptor,AR)，并对JNA中成纤维细胞进行特殊染色，用体视学方网测试系统定量计算成纤维细胞面数密度的报道，为探讨AR在JNA发病中的作用，我们进行了这方面的研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料来源
选用我院耳鼻咽喉科1974～1995年经手术摘除JNA的石蜡标本53例。均男性，年龄13～39岁，平均19.3岁。术前均未经放疗和内分泌治疗。另选健康男青年正常鼻咽上皮石蜡标本16例，年龄16～21岁，平均19岁。
1.2 检测方法
采用SP法检测AR的表达。Ⅰ抗为兔抗雄激素(睾酮)抗体(中山生物公司)，Ⅱ抗为生物素标记的羊抗兔IgG，Ⅲ抗为辣根过氧化酶标记链霉亲合素(Maxim Biotech Inc，美国)。
JNA石蜡切片(5 μm)脱蜡和水化，3%过氧化氢溶液去底物，0.2%胃蛋白酶消化；10%山羊血清封闭，加入适当稀释的Ⅰ抗，抗雄激素抗体为1∶100。阴性对照用PBS代替第一抗体。4℃冰箱孵育48 h，PBS冲洗3次，每次5 min；加入Ⅱ抗(1∶100)，37℃孵育1 h；PBS冲洗3次，每次5 min。加入Ⅲ抗(1∶100)，37℃孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min。加新鲜配制3′3-二氨基苯联胺(Diaminobenzidine,DAB)显色，Mayer苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。Olympus显微镜观察。在JNA组织中成纤维细胞核和(或)血管内皮细胞核内，有棕黄色细颗粒或呈棕黄色者为AR阳性细胞，且≥20%者为AR阳性病例。
, http://www.100md.com
Mollendorff铁苏木精成纤维细胞染色的具体操作按陈佛痴(1980)报告方法进行。成纤维细胞核染呈黑色，胞质呈灰色。成纤维细胞面数密度计算，首先将方网测试系统制成目镜测微尺形式放在目镜的焦点位置上，经物镜测尺标定后，即直接在显微镜下以600倍视野随机选择5个测试系统，计算每个测试系统中成纤维细胞核的截面数，求其平均值(NX)。根据公式NA=NX/AC(AC为测试系统面积，NA为面数密度)。
研究数据采用χ2检验和t检验。
2 结果
53例JNA，≤18岁28例，AR+11例，AR-17例；>18岁25例，AR+12例，AR-13例。即23例AR阳性表达，阳性率为43.4%。16例正常鼻咽上皮组织AR均呈阴性表达。两组间差异有显著性意义(P<0.01)。AR阳性表达物出现于JNA的纤维细胞核和(或)血管内皮细胞核中，呈棕黄色颗粒状或均匀着色(图1)。JNA组织中的AR阳性表达与其患者年龄无关(P>0.05)。
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图1 AR阳性细胞表达物 位于成纤维细胞核和(或)血管内皮细胞核，呈棕黄色颗粒或均匀着色
JNA中的成纤维细胞面数密度AR+(23例)为(4 291.12±1 039.70)个/mm2，AR-(30例)为(3 213.61±964.08)个/mm2。
JNA组织中与其成纤维细胞面数密度呈正相关。JNA组织经Mollendorff铁苏木精成纤维细胞染色，成纤维细胞核呈黑色，胞质呈灰色(图2)。
图2 成纤维细胞Mollendorff铁苏木精成纤维细胞染色 细胞核呈黑色，胞质呈灰色
3 讨论
JNA系由纤维组织和薄壁血管构成，纤维母细胞分化良好，大量异常的、不规则的、腔大壁薄的血管，极少数为厚壁血管。JNA发源于颅底，通常认为系良性肿瘤，但易发生危及生命的大出血等，故临床视为“恶性肿瘤”。JNA几乎都发生于青春期男性，故人们推测与性激素有关。本世纪80年代以来，人们采用DCC法检测JNA组织中性激素受体状况，结果尚不一致。
, 百拇医药
本研究资料表明，JNA组织中有AR存在，其阳性表达率为43.4%，支持Lee等(1980)及Farag等(1987)采用DCC法检测JNA中存在AR的报道。JNA组织中AR阳性表达与其成纤维细胞面数密度呈正相关。这与Brentani等(1989)报道高密度纤维细胞与AR阳性呈密切关系一致。JNA患者的年龄与AR阳性表达无显著相关，这说明JNA各年龄组的AR量无显著性差异。Gates等(1992)对5例JNA患者用抗雄激素制剂Flutamide治疗6周，4例JNA通过CT检查显示肿瘤缩小了44%。Hagen等(1994)报道，在3例JNA肿瘤组织中均检测有AR存在，并且对JNA组织中成纤维细胞进行体外培养，当雄激素(睾酮)加入培养剂中，可使JNA成纤维细胞的生长率升高，而加入抗雄激素制剂Flutamide，则JNA成纤维细胞生长率降低。以上均可提示JNA是类固醇性激素信赖性肿瘤，雄激素在JNA发病及发展中起一定作用。其可能机制是：在青春期，体内雄激素水平增高，刺激鼻咽AR的成纤维细胞过度生长，同时引起血管内皮细胞生长，最终形成JNA。故此肿瘤好发于青春期。待青春期过后，体内雄激素水平下降，刺激AR或成纤维细胞生长减弱，此时JNA肿瘤停止生长或自然消退。但鼻咽部AR成纤维细胞的来源及如何形成，有待于今后进一步探讨。抗雄激素的内分泌治疗可能为临床治疗JNA提供一条新的途径。
(本文承江西医学院病理教研室杜明生副教授、组胚教研室朱清仙副教授指导，谨此致谢。)■
(收稿 1999-02-10), http://www.100md.com
单位：祝小林(江西医学院第二附属医院耳鼻咽喉科 南昌，330006)；刘少英(江西医学院第二附属医院耳鼻咽喉科 南昌，330006)
关键词：
临床耳鼻咽喉科杂志000216 鼻咽血管纤维瘤(Juvenile nasopharyngeal angiofibroma,JNA)多发于青春期男性。Martin(1948)和Schiff(1959)首次报道JNA与性激素有关。这说明类固醇性激素在JNA的发病和发展中可能有重要作用。近些年来，人们采用葡聚糖包裹活性碳吸附法(DCC法)对这一问题进行实质性探讨。但迄今为止，很少见到有关采用过氧化酶标记的链霉卵白素法(streptavidin peroxidase,SP法)，检测JNA组织中雄激素受体(androgen receptor,AR)，并对JNA中成纤维细胞进行特殊染色，用体视学方网测试系统定量计算成纤维细胞面数密度的报道，为探讨AR在JNA发病中的作用，我们进行了这方面的研究。
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1 材料与方法
1.1 材料来源
选用我院耳鼻咽喉科1974～1995年经手术摘除JNA的石蜡标本53例。均男性，年龄13～39岁，平均19.3岁。术前均未经放疗和内分泌治疗。另选健康男青年正常鼻咽上皮石蜡标本16例，年龄16～21岁，平均19岁。
1.2 检测方法
采用SP法检测AR的表达。Ⅰ抗为兔抗雄激素(睾酮)抗体(中山生物公司)，Ⅱ抗为生物素标记的羊抗兔IgG，Ⅲ抗为辣根过氧化酶标记链霉亲合素(Maxim Biotech Inc，美国)。
JNA石蜡切片(5 μm)脱蜡和水化，3%过氧化氢溶液去底物，0.2%胃蛋白酶消化；10%山羊血清封闭，加入适当稀释的Ⅰ抗，抗雄激素抗体为1∶100。阴性对照用PBS代替第一抗体。4℃冰箱孵育48 h，PBS冲洗3次，每次5 min；加入Ⅱ抗(1∶100)，37℃孵育1 h；PBS冲洗3次，每次5 min。加入Ⅲ抗(1∶100)，37℃孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min。加新鲜配制3′3-二氨基苯联胺(Diaminobenzidine,DAB)显色，Mayer苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。Olympus显微镜观察。在JNA组织中成纤维细胞核和(或)血管内皮细胞核内，有棕黄色细颗粒或呈棕黄色者为AR阳性细胞，且≥20%者为AR阳性病例。
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Mollendorff铁苏木精成纤维细胞染色的具体操作按陈佛痴(1980)报告方法进行。成纤维细胞核染呈黑色，胞质呈灰色。成纤维细胞面数密度计算，首先将方网测试系统制成目镜测微尺形式放在目镜的焦点位置上，经物镜测尺标定后，即直接在显微镜下以600倍视野随机选择5个测试系统，计算每个测试系统中成纤维细胞核的截面数，求其平均值(NX)。根据公式NA=NX/AC(AC为测试系统面积，NA为面数密度)。
研究数据采用χ2检验和t检验。
2 结果
53例JNA，≤18岁28例，AR+11例，AR-17例；>18岁25例，AR+12例，AR-13例。即23例AR阳性表达，阳性率为43.4%。16例正常鼻咽上皮组织AR均呈阴性表达。两组间差异有显著性意义(P<0.01)。AR阳性表达物出现于JNA的纤维细胞核和(或)血管内皮细胞核中，呈棕黄色颗粒状或均匀着色(图1)。JNA组织中的AR阳性表达与其患者年龄无关(P>0.05)。
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图1 AR阳性细胞表达物 位于成纤维细胞核和(或)血管内皮细胞核，呈棕黄色颗粒或均匀着色
JNA中的成纤维细胞面数密度AR+(23例)为(4 291.12±1 039.70)个/mm2，AR-(30例)为(3 213.61±964.08)个/mm2。
JNA组织中与其成纤维细胞面数密度呈正相关。JNA组织经Mollendorff铁苏木精成纤维细胞染色，成纤维细胞核呈黑色，胞质呈灰色(图2)。
图2 成纤维细胞Mollendorff铁苏木精成纤维细胞染色 细胞核呈黑色，胞质呈灰色
3 讨论
JNA系由纤维组织和薄壁血管构成，纤维母细胞分化良好，大量异常的、不规则的、腔大壁薄的血管，极少数为厚壁血管。JNA发源于颅底，通常认为系良性肿瘤，但易发生危及生命的大出血等，故临床视为“恶性肿瘤”。JNA几乎都发生于青春期男性，故人们推测与性激素有关。本世纪80年代以来，人们采用DCC法检测JNA组织中性激素受体状况，结果尚不一致。
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本研究资料表明，JNA组织中有AR存在，其阳性表达率为43.4%，支持Lee等(1980)及Farag等(1987)采用DCC法检测JNA中存在AR的报道。JNA组织中AR阳性表达与其成纤维细胞面数密度呈正相关。这与Brentani等(1989)报道高密度纤维细胞与AR阳性呈密切关系一致。JNA患者的年龄与AR阳性表达无显著相关，这说明JNA各年龄组的AR量无显著性差异。Gates等(1992)对5例JNA患者用抗雄激素制剂Flutamide治疗6周，4例JNA通过CT检查显示肿瘤缩小了44%。Hagen等(1994)报道，在3例JNA肿瘤组织中均检测有AR存在，并且对JNA组织中成纤维细胞进行体外培养，当雄激素(睾酮)加入培养剂中，可使JNA成纤维细胞的生长率升高，而加入抗雄激素制剂Flutamide，则JNA成纤维细胞生长率降低。以上均可提示JNA是类固醇性激素信赖性肿瘤，雄激素在JNA发病及发展中起一定作用。其可能机制是：在青春期，体内雄激素水平增高，刺激鼻咽AR的成纤维细胞过度生长，同时引起血管内皮细胞生长，最终形成JNA。故此肿瘤好发于青春期。待青春期过后，体内雄激素水平下降，刺激AR或成纤维细胞生长减弱，此时JNA肿瘤停止生长或自然消退。但鼻咽部AR成纤维细胞的来源及如何形成，有待于今后进一步探讨。抗雄激素的内分泌治疗可能为临床治疗JNA提供一条新的途径。
(本文承江西医学院病理教研室杜明生副教授、组胚教研室朱清仙副教授指导，谨此致谢。)■
(收稿 1999-02-10), http://www.100md.com