鼻粘膜呼吸区上皮细胞原代培养模型的建立和纤毛运动频率的测量
作者：王丰 苏振伦 黄靖香 王莉 杨伟炎 姜泗长
单位：王丰(解放军304医院耳鼻咽喉科 北京，100037)；苏振伦(解放军总医院耳鼻咽喉研究所)；黄靖香(解放军总医院骨科研究所)；王莉(解放军总医院耳鼻咽喉研究所)；杨伟炎(解放军总医院耳鼻咽喉研究所)；姜泗长(解放军总医院耳鼻咽喉研究所)
关键词：鼻粘膜；上皮细胞；纤毛运动；细胞培养
临床耳鼻咽喉科杂志000814 摘要 目的：探讨建立人鼻粘膜呼吸区上皮细胞原代培养模型和纤毛运动频率测量的方法。方法：利用酶消化法分离、以无血清生长因子培养基培养人鼻粘膜上皮细胞。用电视显微镜法观察并记录纤毛运动。结果：培养的鼻粘膜呼吸上皮细胞在接种后24 h贴壁，6～8 d汇合，成活16 d，因实验需要结束培养。纤毛细胞纤毛摆动活跃，杯状细胞既分泌酸性粘多糖也分泌中性粘多糖，所培养细胞23对46条染色体正常。用电视显微镜法测得29例145个人鼻粘膜细胞的纤毛运动频率均值为(411±24)次/min。结论：酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养，可以建立人鼻粘膜呼吸区上皮细胞的原代培养模型；电视显微镜法可以用于纤毛运动频率测量。
, http://www.100md.com
Culture of human nasal respiratory epithelial cells in serum free medium supplemented with hormones and growth factors and measurement
of human nasal ciliary motility using videomicroscopy
WANG Feng SU Zhen-lun HUANG Jin-xiang
WANG Li YANG Wei-yan JIANG Si-chang
(Department of Otorhinolaryngology,PLA 304 Hospital,Beijing 100037)
, 百拇医药
(Institute of Otorhinolaryngology,PLA General Hospital)
(Institute of Orthopedics,PLA General Hospital)
Abstract Objective:To establish a culture model of human nasal respiratory epithelial cells and a method of measuring human nasal ciliary motility.Method:The human nasal respiratory epithelial cells were detached with collagenase and cultured in serum free medium supplemented with hormones and growth factors,the ciliary beat frequency was measured by videomicroscopy.Result:After inoculation,cells cultured with this method adhered in 24 hours,confluented in 6～8 days and lived for 16 days.During that time ciliary beating was active,both acidic and neutral mucoitin granules were rich in goblet cells and all chromosome of 23 pairs were normal,the ciliary beat frequency in 29 subjects′nasal mucosa was(411±24)beats/min(
±s).Conclusion:A culture model of human nasal respiratory epithelial cells in serum free medium supplemented with hormones and growth factors and a method of measuring human nasal ciliary motility was successfully established.
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Key words Nasal mucosa Epithelial cells Ciliary motility Cultured cells
人吸入气体时，呼吸道上皮细胞在抵御微生物的入侵和有毒物质的侵害中起着极其重要的作用。上皮细胞间紧密连成一道坚固的防线，纤毛细胞纤毛运动推动粘液毯向鼻咽部移动，清除粘液中的有害物质，跨上皮离子转移使呼吸粘膜表面水盐平衡、粘液水化。近来研究表明，呼吸上皮细胞能释放许多重要的介导炎症反应的因子，是发生炎症反应的关键部位。有人认为它们是人体对吸入性微生物和毒物发生免疫反应的始发细胞和协调细胞〔1，2〕。因此，探讨鼻粘膜上皮细胞的原代培养方法和纤毛运动频率的测量方法对于研究呼吸系统疾病的产生、发展机制及其防治具有较大的意义。
1 材料和方法
1.1 材料来源
, 百拇医药 呼吸区鼻粘膜组织取自接受鼻内窥镜手术的慢性鼻窦炎、鼻息肉患者的中鼻甲中下段或下鼻甲粘膜。
1.2 实验方法
人鼻粘膜上皮细胞的分离与培养参照Wu等(1985)报告的方法。将术中取下的鼻粘膜放入含15%胎牛血清、氟康唑(1 mg/L)、庆大霉素(10 mg/L)的Dulbecco′s modified eagle medium(DMEM)：Ham′s F12为1∶1的培养基(以下简称牛血清培养基)中，用含氟康唑(10 mg/L)、庆大霉素(100 mg/L)的无菌生理盐水反复冲洗6～7遍。将组织块放入含0.1%胶原酶的Hanks液中，4℃消化16～18 h或37℃消化30 min，以吸管轻轻吹打2～3 min，使上皮片脱落。将细胞悬液离心(1 000 r/min,4℃)后弃上清液，加入适量牛血清培养基制成细胞悬液。台盼蓝染色证明90%为未染色的活细胞，调整细胞数为1～5×107/L。将直径为25 mm的盖玻片放入35 mm的培养皿中，以吸管将前述细胞悬液移到准备好的培养皿里，每皿2.0 ml，置入饱和湿度的37℃恒温孵箱中，在95%空气、5% CO2条件下培养24 h后换成无血清生长因子培养基(以下简称生长因子培养基)。其成分是：DMEM:Ham′s F12为1∶1、胰岛素(5 mg/L)、转铁蛋白(5 mg/L)、表皮细胞生长因子(20 μg/L)、霍乱毒素(10 μg/L)、氢化可的松(10-7 mol/L)、内皮细胞生长因子(4 mg/L)、三碘甲状腺原氨酸(2×10-10 mol/L)、氟康唑(1 mg/L)及庆大霉素(10 mg/L)。培养第1～3 d，隔1 d换液1次，3 d后每天换液1次。
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1.3 细胞学观察及染色体鉴定
1.3.1 阿辛蓝(AB)与雪夫试剂(PAS)染色：原代培养第3天细胞用甲醛固定，蒸馏水浸洗1 min，常规AB、PAS染色〔3〕。
1.3.2 苏木素-伊红(HE)染色法：原代培养第13天细胞用37℃温平衡盐溶液(BSS)漂洗3次，每次20～60 s，中性甲醛固定30 min，常规HE染色〔3〕。
1.3.3 扫描电镜观察：取原代培养第16天细胞，吸去培养液，Hank′s液洗1遍，加2%戊二醛固定。加0.1% mol/L磷酸缓冲液洗2遍，用1%锇酸固定2 h。以2%单宁酸泡2次，每次30 min，再用0.1% mol/L磷酸缓冲液洗2次，每次10 min。然后梯度乙醇脱水，加入纯醋酸异戊酯过夜。标本在日立公司HCP-2型临界点干燥器里干燥，日立1 B-5型离子镀膜机喷镀，然后用Philips公司生产的S-505扫描电镜观察、照相。
, 百拇医药
1.3.4 传代培养细胞染色体显示法：取处于指数生长期汇合成单层的第4代培养细胞，加入0.1 mg/L秋水仙碱，37℃培养4 h。轻轻摇动培养瓶，使中期培养细胞脱落，将细胞悬液离心(1 000 r/min) 5 min后弃上清，加入37℃ 0.075 mo1/L KCl溶液，低渗下在37℃静置30 min。离心，弃上清，逐滴加入新鲜1∶3醋酸、甲醇固定液10 ml，用吸管吹打15 min。同法2次固定20 min，离心后弃上清，加固定液1 ml，打匀、滴2～3滴细胞悬液于载玻片上，自然干燥后，以1∶9 Giemsa磷酸缓冲液染色10 min，水洗晾干，过二甲苯2次，中性树胶封片、镜检。
1.4 纤毛运动频率测量
用AXIOVERT 35相差显微镜观察，用松下彩色摄像机WV-3600N和JVC公司的HR-D257 MS录像机，对室温下(23℃～25℃)纤毛运动过程进行录像。测量时慢速回放，每个样本共测量不同部位的5个细胞，取每个细胞的一束纤毛进行计数，然后进行统计学分析。共测量了取自29例145个人鼻粘膜细胞的纤毛运动频率。
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2 结果
2.1 培养细胞观察和细胞学检查
培养24 h后，相差显微镜50～100倍下见大部分上皮细胞及上皮片贴壁，细胞呈鹅卵石状；培养6～8 d，细胞汇合成单层；第16 d，仍有约70%细胞存活，因为实验需要停止培养。
从培养第2天起，在相差显微镜下放大100～400倍，见纤毛摆动活跃，节律稳定，摆动方向一致。随着培养天数的增加，纤毛细胞越来越多。从培养第11天起，每天可见到几个纤毛细胞纤毛摆动变慢且摆动方向紊乱，有的纤毛停止摆动。至培养第16天，仍有约60%～70%纤毛细胞纤毛摆动活跃，摆动方向一致且节律稳定。在扫描电镜下放大1 500～5 000倍观察，可见纤毛由细胞顶膜伸出，大部分集结成束，除纤毛外，还有稠密的较细短的微绒毛由细胞顶膜伸出(图1，2)。
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图1，2 扫描电镜片 鼻粘膜呼吸区上皮细胞原代培养第16天
从培养第3～5天始，在相差显微镜下放大400倍，可见到杯状细胞内富含分泌颗粒。AB、PAS染色呈双阳性，与培养前组织切片AB、PAS染色结果相同，表明鼻粘膜呼吸区杯状细胞既分泌酸性粘多糖，也分泌中性粘多糖。从培养第9天起，出现“拉网”现象，有的细胞甚至脱落。有人认为，这是由于上皮细胞在生长过程中产生透明质酸溶解酶使细胞间质发生液化，导致细胞相互分离甚至脱落〔5〕。
HE染色后，在相关显微镜下放大165倍观察，细胞为卵圆形，胞浆胞核比例大，胞核内有1～4个核仁，符合上皮细胞特点，有的细胞胞浆淡染，考虑为杯状细胞。
对1例第4代指数生长期细胞染色体进行检测，发现都为23对46条正常人染色体。
用电视显微镜法测得29例145个人鼻粘膜细胞的纤毛运动频率最小值为200次/min，最大值为690次/min，均数为411±24次/min。
, 百拇医药
3 讨论
近年来，鼻粘膜上皮细胞培养技术发展很快，因研究目的不同，培养方法亦各异。本实验利用无血清生长因子培养基成功地培养了人鼻粘膜呼吸区上皮细胞。方法简单易行，用途广泛，可用于进行细胞膜片钳记录及细胞内钙离子浓度的检测，纤毛运动观察及测量，以及细胞形态学研究等。本实验所培养的人鼻粘膜呼吸区上皮细胞，在相差显微镜下放大50～100倍，外观呈鹅卵石状，与Kondo等〔4〕报道相同；且从培养后第2天开始至第16天终止培养，纤毛细胞纤毛摆动活跃，杯状细胞中可见到分泌颗粒，说明细胞有良好的活性和功能，而且第4代培养细胞染色体正常，使我们有充分的时间利用其进行实验。
本文介绍的电视显微镜法是目前世界上较常用的纤毛运动测量方法之一。我们测定的结果(均数为411次/min)比Phillips等〔6〕报道的约540次/min略小。此方法不仅用于基础试验研究，也可用于临床上呼吸道纤毛运动的测量，可望成为某些呼吸系统疾病如不动纤毛综合征等的诊断方法之一〔6〕。
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参考文献
1，Guo F H,De-Raeve H R,Rice T W,et al,Continuous nitric oxide synthesis by inducible nitric oxide synthase in normal human airway epithelium in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:7809～7813
2，Yankaskas J R.The airway epithelial cell.In:Ann Harris,ed.Epithelial cell culture.UK:Cambridge University Press,1996.5～24
3，龚志锦，詹熔洲.病理组织制片染色技术.上海：上海科学技术出版社，1994.158～170
, 百拇医药
4，Kondo M,Finkbeiner W E,Widdicombe J H.Simple technique for culture of highly differentiated cells from dog tracheal epithelium.Am J Physiol,1991,261:L106～L117
5，鄂征.组织培养和分子生物学技术.北京：北京出版社，1997.151～161
6，Phillips P P,Mccaffrey T V,Kern E B.Measurement of human nasal ciliary motility using computerized microphotometry.Otolaryngol Head Neck Surg,1990,103:420～426
(收稿 1999-12-17), 百拇医药
单位：王丰(解放军304医院耳鼻咽喉科 北京，100037)；苏振伦(解放军总医院耳鼻咽喉研究所)；黄靖香(解放军总医院骨科研究所)；王莉(解放军总医院耳鼻咽喉研究所)；杨伟炎(解放军总医院耳鼻咽喉研究所)；姜泗长(解放军总医院耳鼻咽喉研究所)
关键词：鼻粘膜；上皮细胞；纤毛运动；细胞培养
临床耳鼻咽喉科杂志000814 摘要 目的：探讨建立人鼻粘膜呼吸区上皮细胞原代培养模型和纤毛运动频率测量的方法。方法：利用酶消化法分离、以无血清生长因子培养基培养人鼻粘膜上皮细胞。用电视显微镜法观察并记录纤毛运动。结果：培养的鼻粘膜呼吸上皮细胞在接种后24 h贴壁，6～8 d汇合，成活16 d，因实验需要结束培养。纤毛细胞纤毛摆动活跃，杯状细胞既分泌酸性粘多糖也分泌中性粘多糖，所培养细胞23对46条染色体正常。用电视显微镜法测得29例145个人鼻粘膜细胞的纤毛运动频率均值为(411±24)次/min。结论：酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养，可以建立人鼻粘膜呼吸区上皮细胞的原代培养模型；电视显微镜法可以用于纤毛运动频率测量。
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Culture of human nasal respiratory epithelial cells in serum free medium supplemented with hormones and growth factors and measurement
of human nasal ciliary motility using videomicroscopy
WANG Feng SU Zhen-lun HUANG Jin-xiang
WANG Li YANG Wei-yan JIANG Si-chang
(Department of Otorhinolaryngology,PLA 304 Hospital,Beijing 100037)
, 百拇医药
(Institute of Otorhinolaryngology,PLA General Hospital)
(Institute of Orthopedics,PLA General Hospital)
Abstract Objective:To establish a culture model of human nasal respiratory epithelial cells and a method of measuring human nasal ciliary motility.Method:The human nasal respiratory epithelial cells were detached with collagenase and cultured in serum free medium supplemented with hormones and growth factors,the ciliary beat frequency was measured by videomicroscopy.Result:After inoculation,cells cultured with this method adhered in 24 hours,confluented in 6～8 days and lived for 16 days.During that time ciliary beating was active,both acidic and neutral mucoitin granules were rich in goblet cells and all chromosome of 23 pairs were normal,the ciliary beat frequency in 29 subjects′nasal mucosa was(411±24)beats/min(
±s).Conclusion:A culture model of human nasal respiratory epithelial cells in serum free medium supplemented with hormones and growth factors and a method of measuring human nasal ciliary motility was successfully established., http://www.100md.com
Key words Nasal mucosa Epithelial cells Ciliary motility Cultured cells
人吸入气体时，呼吸道上皮细胞在抵御微生物的入侵和有毒物质的侵害中起着极其重要的作用。上皮细胞间紧密连成一道坚固的防线，纤毛细胞纤毛运动推动粘液毯向鼻咽部移动，清除粘液中的有害物质，跨上皮离子转移使呼吸粘膜表面水盐平衡、粘液水化。近来研究表明，呼吸上皮细胞能释放许多重要的介导炎症反应的因子，是发生炎症反应的关键部位。有人认为它们是人体对吸入性微生物和毒物发生免疫反应的始发细胞和协调细胞〔1，2〕。因此，探讨鼻粘膜上皮细胞的原代培养方法和纤毛运动频率的测量方法对于研究呼吸系统疾病的产生、发展机制及其防治具有较大的意义。
1 材料和方法
1.1 材料来源
, 百拇医药 呼吸区鼻粘膜组织取自接受鼻内窥镜手术的慢性鼻窦炎、鼻息肉患者的中鼻甲中下段或下鼻甲粘膜。
1.2 实验方法
人鼻粘膜上皮细胞的分离与培养参照Wu等(1985)报告的方法。将术中取下的鼻粘膜放入含15%胎牛血清、氟康唑(1 mg/L)、庆大霉素(10 mg/L)的Dulbecco′s modified eagle medium(DMEM)：Ham′s F12为1∶1的培养基(以下简称牛血清培养基)中，用含氟康唑(10 mg/L)、庆大霉素(100 mg/L)的无菌生理盐水反复冲洗6～7遍。将组织块放入含0.1%胶原酶的Hanks液中，4℃消化16～18 h或37℃消化30 min，以吸管轻轻吹打2～3 min，使上皮片脱落。将细胞悬液离心(1 000 r/min,4℃)后弃上清液，加入适量牛血清培养基制成细胞悬液。台盼蓝染色证明90%为未染色的活细胞，调整细胞数为1～5×107/L。将直径为25 mm的盖玻片放入35 mm的培养皿中，以吸管将前述细胞悬液移到准备好的培养皿里，每皿2.0 ml，置入饱和湿度的37℃恒温孵箱中，在95%空气、5% CO2条件下培养24 h后换成无血清生长因子培养基(以下简称生长因子培养基)。其成分是：DMEM:Ham′s F12为1∶1、胰岛素(5 mg/L)、转铁蛋白(5 mg/L)、表皮细胞生长因子(20 μg/L)、霍乱毒素(10 μg/L)、氢化可的松(10-7 mol/L)、内皮细胞生长因子(4 mg/L)、三碘甲状腺原氨酸(2×10-10 mol/L)、氟康唑(1 mg/L)及庆大霉素(10 mg/L)。培养第1～3 d，隔1 d换液1次，3 d后每天换液1次。
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1.3 细胞学观察及染色体鉴定
1.3.1 阿辛蓝(AB)与雪夫试剂(PAS)染色：原代培养第3天细胞用甲醛固定，蒸馏水浸洗1 min，常规AB、PAS染色〔3〕。
1.3.2 苏木素-伊红(HE)染色法：原代培养第13天细胞用37℃温平衡盐溶液(BSS)漂洗3次，每次20～60 s，中性甲醛固定30 min，常规HE染色〔3〕。
1.3.3 扫描电镜观察：取原代培养第16天细胞，吸去培养液，Hank′s液洗1遍，加2%戊二醛固定。加0.1% mol/L磷酸缓冲液洗2遍，用1%锇酸固定2 h。以2%单宁酸泡2次，每次30 min，再用0.1% mol/L磷酸缓冲液洗2次，每次10 min。然后梯度乙醇脱水，加入纯醋酸异戊酯过夜。标本在日立公司HCP-2型临界点干燥器里干燥，日立1 B-5型离子镀膜机喷镀，然后用Philips公司生产的S-505扫描电镜观察、照相。
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1.3.4 传代培养细胞染色体显示法：取处于指数生长期汇合成单层的第4代培养细胞，加入0.1 mg/L秋水仙碱，37℃培养4 h。轻轻摇动培养瓶，使中期培养细胞脱落，将细胞悬液离心(1 000 r/min) 5 min后弃上清，加入37℃ 0.075 mo1/L KCl溶液，低渗下在37℃静置30 min。离心，弃上清，逐滴加入新鲜1∶3醋酸、甲醇固定液10 ml，用吸管吹打15 min。同法2次固定20 min，离心后弃上清，加固定液1 ml，打匀、滴2～3滴细胞悬液于载玻片上，自然干燥后，以1∶9 Giemsa磷酸缓冲液染色10 min，水洗晾干，过二甲苯2次，中性树胶封片、镜检。
1.4 纤毛运动频率测量
用AXIOVERT 35相差显微镜观察，用松下彩色摄像机WV-3600N和JVC公司的HR-D257 MS录像机，对室温下(23℃～25℃)纤毛运动过程进行录像。测量时慢速回放，每个样本共测量不同部位的5个细胞，取每个细胞的一束纤毛进行计数，然后进行统计学分析。共测量了取自29例145个人鼻粘膜细胞的纤毛运动频率。
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2 结果
2.1 培养细胞观察和细胞学检查
培养24 h后，相差显微镜50～100倍下见大部分上皮细胞及上皮片贴壁，细胞呈鹅卵石状；培养6～8 d，细胞汇合成单层；第16 d，仍有约70%细胞存活，因为实验需要停止培养。
从培养第2天起，在相差显微镜下放大100～400倍，见纤毛摆动活跃，节律稳定，摆动方向一致。随着培养天数的增加，纤毛细胞越来越多。从培养第11天起，每天可见到几个纤毛细胞纤毛摆动变慢且摆动方向紊乱，有的纤毛停止摆动。至培养第16天，仍有约60%～70%纤毛细胞纤毛摆动活跃，摆动方向一致且节律稳定。在扫描电镜下放大1 500～5 000倍观察，可见纤毛由细胞顶膜伸出，大部分集结成束，除纤毛外，还有稠密的较细短的微绒毛由细胞顶膜伸出(图1，2)。
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图1，2 扫描电镜片 鼻粘膜呼吸区上皮细胞原代培养第16天
从培养第3～5天始，在相差显微镜下放大400倍，可见到杯状细胞内富含分泌颗粒。AB、PAS染色呈双阳性，与培养前组织切片AB、PAS染色结果相同，表明鼻粘膜呼吸区杯状细胞既分泌酸性粘多糖，也分泌中性粘多糖。从培养第9天起，出现“拉网”现象，有的细胞甚至脱落。有人认为，这是由于上皮细胞在生长过程中产生透明质酸溶解酶使细胞间质发生液化，导致细胞相互分离甚至脱落〔5〕。
HE染色后，在相关显微镜下放大165倍观察，细胞为卵圆形，胞浆胞核比例大，胞核内有1～4个核仁，符合上皮细胞特点，有的细胞胞浆淡染，考虑为杯状细胞。
对1例第4代指数生长期细胞染色体进行检测，发现都为23对46条正常人染色体。
用电视显微镜法测得29例145个人鼻粘膜细胞的纤毛运动频率最小值为200次/min，最大值为690次/min，均数为411±24次/min。
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3 讨论
近年来，鼻粘膜上皮细胞培养技术发展很快，因研究目的不同，培养方法亦各异。本实验利用无血清生长因子培养基成功地培养了人鼻粘膜呼吸区上皮细胞。方法简单易行，用途广泛，可用于进行细胞膜片钳记录及细胞内钙离子浓度的检测，纤毛运动观察及测量，以及细胞形态学研究等。本实验所培养的人鼻粘膜呼吸区上皮细胞，在相差显微镜下放大50～100倍，外观呈鹅卵石状，与Kondo等〔4〕报道相同；且从培养后第2天开始至第16天终止培养，纤毛细胞纤毛摆动活跃，杯状细胞中可见到分泌颗粒，说明细胞有良好的活性和功能，而且第4代培养细胞染色体正常，使我们有充分的时间利用其进行实验。
本文介绍的电视显微镜法是目前世界上较常用的纤毛运动测量方法之一。我们测定的结果(均数为411次/min)比Phillips等〔6〕报道的约540次/min略小。此方法不仅用于基础试验研究，也可用于临床上呼吸道纤毛运动的测量，可望成为某些呼吸系统疾病如不动纤毛综合征等的诊断方法之一〔6〕。
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参考文献
1，Guo F H,De-Raeve H R,Rice T W,et al,Continuous nitric oxide synthesis by inducible nitric oxide synthase in normal human airway epithelium in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:7809～7813
2，Yankaskas J R.The airway epithelial cell.In:Ann Harris,ed.Epithelial cell culture.UK:Cambridge University Press,1996.5～24
3，龚志锦，詹熔洲.病理组织制片染色技术.上海：上海科学技术出版社，1994.158～170
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4，Kondo M,Finkbeiner W E,Widdicombe J H.Simple technique for culture of highly differentiated cells from dog tracheal epithelium.Am J Physiol,1991,261:L106～L117
5，鄂征.组织培养和分子生物学技术.北京：北京出版社，1997.151～161
6，Phillips P P,Mccaffrey T V,Kern E B.Measurement of human nasal ciliary motility using computerized microphotometry.Otolaryngol Head Neck Surg,1990,103:420～426
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