狗喉甲杓肌组织化学及超微结构的研究
作者：白伟良 宋辉 何平 杨式麟
单位：中国医科大学第二临床学院耳鼻咽喉科(沈阳 110003)
关键词：甲杓肌；组织化学；琥珀酸脱氢酶；超微结构
听力学及言语疾病杂志990402 【摘要】 目的 研究甲杓肌各型肌纤维光镜及电镜下的结构特点，探讨其与生理功能的关系。方法 采用琥珀酸脱氢酶(SDH)染色及电镜技术对狗喉甲杓肌进行分型。结果 经SDH染色后，甲杓肌可分红肌、白肌及中间肌三种肌纤维型，它们所占比例分别为53.3%、17.8%、28.9%。电镜下，根据线粒体的数量及分布特点可分出三种类型的超微结构，它们分别与光镜下的肌纤维分型相对应。结论 甲杓肌各型肌纤维构成特点与生理功能密切相关；定量分析Z线及肌节的宽度对于电镜下的肌纤维分型有重要意义。
Histochemistry and Ultrastructure of Canine Thyroarytenoid Muscle
, 百拇医药
Bai Weiliang,Song Hui ,He Ping,et al.
(ENT Department,The Second Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang，110033)
【Abstract】 Objective To study the characteristics of thyroarytenoid(TA)muscle types under light microscope and electron microscope,and to find out the relationship between the characteristics and its physical function.Methods We classified the canine TA with succinic dehydrogenase (SDH)staining method and electron-microscopy.Results The TA could be classified into red muscle,white muscle and intermediate muscle by SDH stains.The TA consisted of 53.3% of red muscle,17.8% of white muscle and 28.9% of intermediate muscle.We found three different ultrastructures according to the amount and distribution of mitochondria,which corresponded to the three muscle types under light microscope respectively.Conclusion The characteristics of TA muscle types was closely related with its physical function.It was significant to measure the value of Z-line and sarcomere for quantitative analysis.
, 百拇医药
【Key words】 Thyroarytenoid Histochemistry Succinic dehydrogenase Ultrastructure
近年来，人们发现各种神经肌肉的疾病往往与肌纤维类型的改变有关。肌纤维分型越来越引起重视。人们发现用组织化学方法及电镜能分出不同的肌纤维型，各肌纤维型有不同的物理化学特性。这些方法把肌纤维组织的形态与功能有机的结合起来，通过形态学变化可以推断其功能的改变。对于四肢及躯干部的肌纤维研究较多，而对于喉内肌的研究较少，本实验通过组织化学方法及电镜对狗喉甲杓肌各肌纤维进行了分型，揭示了甲杓肌各型肌纤维型的分布比例及各型肌纤维的超微结构特点。
1 材料与方法
受试对象为4只体重10～15 kg的健康杂种成年犬，用硫喷妥钠按30～40 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，将犬仰卧固定手术台上，颈前部去毛，常规消毒，铺无菌巾，由颈前正中线之舌骨下缘至第六气管环水平作一垂直切口，分离颈前舌骨下肌群，暴露甲状软骨，用组织剪将甲状软骨正中剪开，分离声带粘膜，取双侧甲杓肌。
, 百拇医药
光镜取材：分别将两则甲杓肌切成小块，浸入4℃的Holt's液中12小时[1]，再于-20℃恒冷切片机(Leica2020)制备厚10微米的冰冻横切片。电镜取材：另取双侧甲杓肌，修成小于1立方毫米的小块，于4℃下，浸入用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液配制的2.5%戊二醛中固定24小时。组化染色：将冰冻切片放入琥珀酸脱氢酶(SDH)孵育液内(PH7.6，37℃)30分钟，孵育后，经双蒸水清洗，用甘油明胶常规封片。
透射电镜的观察方法[2]：经戊二醛固定的标本，0.1M二甲胂酸钠缓冲液漂洗，再浸入1%四氧化锇固定1.5小时，0.1M二甲胂酸钠缓冲液漂洗，逐级丙酮脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机(Ultracut)制备超薄切片，切片经醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，置于JEM-1200EX透射电镜下观察。显微图象分析：用日本产Luzex-F图象分析仪，对双侧甲杓肌直径进行定量测量。随机抽取肌纤维100根，以各个肌纤维的短径做为肌纤维的直径，最后将测得的数据进行统计学处理(t检验)。
, 百拇医药
2 结果
2.1 用SDH组织化学方法，甲杓肌的横断及纵断面上均可清晰分出由浅至深三种类型肌纤维(图1)。红肌纤维呈深蓝色，直径最细，为28.3±7.85 μm，数量最多，占肌纤维总数的53.3%，其中间可见散在的中间型肌纤维和白肌纤维。白肌纤维呈浅蓝色，直径比红肌纤维粗，为32.7±5.83 μm，数量少，约占肌纤维总数的17.8%。中间型肌纤维呈蓝色，直径34.1±4.9 um，数量介于红、白肌之间，占28.9%，红肌纤维直径比白肌纤维及中间肌 纤维细(P<0.05)，白肌纤维直径与中间肌直径无显著差别(P>0.05)。
图1 染色深，直径细的为红肌纤维(R)，染色最浅直径粗的为白肌纤维(W)，周边染色深中间染色浅的为中间肌纤维(I)。x2500
, 百拇医药 2.2 超微结构 与其它骨肌相类似，在电镜下根据线粒体的数量及分布可分辩出三种不同肌纤维的超微结构(图2～4)，他们分别与用SDH染色所分出的红肌纤维、白肌纤维、中间肌纤维相对应。测量这三种不同超微结构的20根肌原纤维的Z线及肌节，并对其进行统计学分析。三种不同肌纤维超微结构特点见附表。
图2 红肌纤维的超微结构：线粒体(M)大且呈多型，糖元颗粒(G)多，Z线(Z)到及肌节均较宽。x8500
图3 中间肌纤维的超微结构：线粒体(M)及糖元颗粒(G)少，Z线(Z)的宽度及肌节的长度相对较短。x8760
, 百拇医药
图4 白肌纤维的超微结构：线粒体(M)数量少且小，糖元颗粒(G)及肌浆网Z线及肌节(S)相对较宽。x8500附表 三种肌纤维的超微结构 分型
线粒体
Z线(nm)
肌节(nm)
肌浆网
糖元颗粒
红肌
多，呈弥漫分布
71.4±6.5
1857.1±12.5
丰富
, 百拇医药
多
白肌
少
72.1±7.6
1839.5±14.3
丰富
多
中间肌
较多，聚集于肌纤维周边部
62.4±6.2
1815.5±15.8
较少
少
, 百拇医药
红肌纤维、白肌纤维的Z线宽度无显著性差异(P>0.05)，但他们与中间肌Z线的宽度有显著性差异(P<0.05)，这三种肌纤维的肌节之间的差异都有显著性(P<0.05)。
3 讨论
3.1 甲杓肌组织化学分型的意义 SDH是线粒体的标志酶，其染色的深浅反映了肌纤维内线粒体的多少，线粒体的含量反应了肌纤维细胞氧化能力的高低。甲杓肌经SDH染色，根据呈色深浅的不同，可将肌纤维分为红肌、白肌、中间肌三种类型。其中红肌纤维染色最深，SDH活性强，线粒体含量最多，该型肌纤维既能有氧代谢，又能通过糖酵解提供能量，生理学已证明该种肌纤维能够快速收缩而不易疲劳，适于持久的快速运动。白肌纤维染色最浅，SDH活性极弱，线粒体含量少，这种肌纤维主要从无氧糖酵解来获取能量，其收缩张力大，不耐疲劳，因而适于爆发性的短时张力强的快速运动[3～5]。中间型肌纤维染色介于红肌纤维和白肌纤维之间，因此线粒体含量也介于红、白肌之间，收缩速度慢，兴奋阈低，容易发动而不易疲劳，因而适合维持平衡和姿势。红肌纤维和白肌纤维因收缩速度快，也被称为快肌肌纤维，中间肌纤维因收缩速度慢，也被称为慢肌纤维。同一种动物中，由于肢体部位不同肌肉亦有不同功能，每种肌肉内肌纤维的构成比和分布各异，但多以一种肌纤维型占优势，此种纤维是构成肌肉活动的主要基础。甲杓肌各型肌纤维的比例，直径及其排列方式都有自身特点。甲杓肌快肌占72.1%，其中红肌肌纤维比例为53.3%，白肌比例为17.8%，表明甲杓肌既能快速收缩，又能耐受疲劳，甲杓肌各型纤维直径都很细小，不象其他骨骼肌纤维那样粗大，另外，肌纤维之间排列疏松，肌纤维收缩空间大。甲杓肌所有这些特点都与其完成特定的发声功能有关。
, 百拇医药
3.2 甲杓肌电镜下的超微结构特点 在电镜下，能观察到肌纤维更精细的结构，如线粒体、肌浆网、糖元颗粒、肌节、Z线等。其中，肌节是肌原纤维上相邻两个Z线之间的一段肌原纤维，也是肌纤维结构和功能的基本单位。自从用组织化学方法区分肌纤维类型以来，人们开始探讨各型肌纤维型的超微结构特点。1966年，Shafiq[6]等学者研究认为股外直肌中红肌比白肌的线粒体数目多，但没有提出电镜下区分肌纤维型的标准。1969年Ogata发现红肌与白肌的显著不同的是线粒体的形态与大小，红肌纤维线粒体肥大且多型，而白肌线粒体狭长。这些学者的研究还都局限于对电镜下肌纤维内的线粒体的定性分析。Sjostrom[7]等学者对人四肢肌的三种肌纤维分型的超微结构作了定量分析，认为肌纤维的Z线及M线的宽度对肌纤维分型有重要意义。目前的研究大多以人或动物的躯干或四肢肌为对象，而对于喉内肌超微结构的研究还很不充分。本实验对狗甲杓肌在电镜下进行观察，发现从线粒体的数量、肌浆网及糖原颗粒的多少等几方面可以区分出三种不同的超微结构，其与光镜下的分型一一对应。并发现红肌纤维、白肌纤维及中间肌纤维肌节的宽度存在明显差别(P<0.05)，快肌(包括白肌纤维和红肌纤维)与慢肌纤维(即中间肌纤维)的Z线宽度有显著性差别，可见定量分析Z线及肌节的宽度对于电镜下的肌纤维分型有重要意义。
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 陈啸梅.组织化学手册.北京：人民卫生出版社，1982.224～225.
2 Robert J,Tomanek,Donald D.Degeneration of different types of skeletal muscle fibers,l.Denervation J.Anat,1973,116:395.
3 李志义.人类骨骼肌的肌纤维型及其分布特征.遵义医学院学报，1991，2：49.
4 王东林.骨骼肌纤维类型及其细胞与分子基础.国外医学生理，病理科学与临床分册，1995，15：9.
5 李明扬.人类四肢骨骼肌的肌纤维型分布.解剖学杂志，1992，2：146.
, 百拇医药
6 Shafiq SA,Gorycki M,Goldstone L,et al.Fine structure of fiber types in nomal human muscle.Anat Rec,1996:156.
7 Sjostrom M，Kidman S,Larsen KH,et al.Z-and M-band appearance in different histochemically defined types of human skeletal muscle fibers.Journal of Histochemisty and Cytochemistry,1982,30:1.
(1999-01-05收稿 1999-04-07修回), http://www.100md.com
单位：中国医科大学第二临床学院耳鼻咽喉科(沈阳 110003)
关键词：甲杓肌；组织化学；琥珀酸脱氢酶；超微结构
听力学及言语疾病杂志990402 【摘要】 目的 研究甲杓肌各型肌纤维光镜及电镜下的结构特点，探讨其与生理功能的关系。方法 采用琥珀酸脱氢酶(SDH)染色及电镜技术对狗喉甲杓肌进行分型。结果 经SDH染色后，甲杓肌可分红肌、白肌及中间肌三种肌纤维型，它们所占比例分别为53.3%、17.8%、28.9%。电镜下，根据线粒体的数量及分布特点可分出三种类型的超微结构，它们分别与光镜下的肌纤维分型相对应。结论 甲杓肌各型肌纤维构成特点与生理功能密切相关；定量分析Z线及肌节的宽度对于电镜下的肌纤维分型有重要意义。
Histochemistry and Ultrastructure of Canine Thyroarytenoid Muscle
, 百拇医药
Bai Weiliang,Song Hui ,He Ping,et al.
(ENT Department,The Second Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang，110033)
【Abstract】 Objective To study the characteristics of thyroarytenoid(TA)muscle types under light microscope and electron microscope,and to find out the relationship between the characteristics and its physical function.Methods We classified the canine TA with succinic dehydrogenase (SDH)staining method and electron-microscopy.Results The TA could be classified into red muscle,white muscle and intermediate muscle by SDH stains.The TA consisted of 53.3% of red muscle,17.8% of white muscle and 28.9% of intermediate muscle.We found three different ultrastructures according to the amount and distribution of mitochondria,which corresponded to the three muscle types under light microscope respectively.Conclusion The characteristics of TA muscle types was closely related with its physical function.It was significant to measure the value of Z-line and sarcomere for quantitative analysis.
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【Key words】 Thyroarytenoid Histochemistry Succinic dehydrogenase Ultrastructure
近年来，人们发现各种神经肌肉的疾病往往与肌纤维类型的改变有关。肌纤维分型越来越引起重视。人们发现用组织化学方法及电镜能分出不同的肌纤维型，各肌纤维型有不同的物理化学特性。这些方法把肌纤维组织的形态与功能有机的结合起来，通过形态学变化可以推断其功能的改变。对于四肢及躯干部的肌纤维研究较多，而对于喉内肌的研究较少，本实验通过组织化学方法及电镜对狗喉甲杓肌各肌纤维进行了分型，揭示了甲杓肌各型肌纤维型的分布比例及各型肌纤维的超微结构特点。
1 材料与方法
受试对象为4只体重10～15 kg的健康杂种成年犬，用硫喷妥钠按30～40 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，将犬仰卧固定手术台上，颈前部去毛，常规消毒，铺无菌巾，由颈前正中线之舌骨下缘至第六气管环水平作一垂直切口，分离颈前舌骨下肌群，暴露甲状软骨，用组织剪将甲状软骨正中剪开，分离声带粘膜，取双侧甲杓肌。
, 百拇医药
光镜取材：分别将两则甲杓肌切成小块，浸入4℃的Holt's液中12小时[1]，再于-20℃恒冷切片机(Leica2020)制备厚10微米的冰冻横切片。电镜取材：另取双侧甲杓肌，修成小于1立方毫米的小块，于4℃下，浸入用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液配制的2.5%戊二醛中固定24小时。组化染色：将冰冻切片放入琥珀酸脱氢酶(SDH)孵育液内(PH7.6，37℃)30分钟，孵育后，经双蒸水清洗，用甘油明胶常规封片。
透射电镜的观察方法[2]：经戊二醛固定的标本，0.1M二甲胂酸钠缓冲液漂洗，再浸入1%四氧化锇固定1.5小时，0.1M二甲胂酸钠缓冲液漂洗，逐级丙酮脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机(Ultracut)制备超薄切片，切片经醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，置于JEM-1200EX透射电镜下观察。显微图象分析：用日本产Luzex-F图象分析仪，对双侧甲杓肌直径进行定量测量。随机抽取肌纤维100根，以各个肌纤维的短径做为肌纤维的直径，最后将测得的数据进行统计学处理(t检验)。
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2 结果
2.1 用SDH组织化学方法，甲杓肌的横断及纵断面上均可清晰分出由浅至深三种类型肌纤维(图1)。红肌纤维呈深蓝色，直径最细，为28.3±7.85 μm，数量最多，占肌纤维总数的53.3%，其中间可见散在的中间型肌纤维和白肌纤维。白肌纤维呈浅蓝色，直径比红肌纤维粗，为32.7±5.83 μm，数量少，约占肌纤维总数的17.8%。中间型肌纤维呈蓝色，直径34.1±4.9 um，数量介于红、白肌之间，占28.9%，红肌纤维直径比白肌纤维及中间肌 纤维细(P<0.05)，白肌纤维直径与中间肌直径无显著差别(P>0.05)。
图1 染色深，直径细的为红肌纤维(R)，染色最浅直径粗的为白肌纤维(W)，周边染色深中间染色浅的为中间肌纤维(I)。x2500
, 百拇医药 2.2 超微结构 与其它骨肌相类似，在电镜下根据线粒体的数量及分布可分辩出三种不同肌纤维的超微结构(图2～4)，他们分别与用SDH染色所分出的红肌纤维、白肌纤维、中间肌纤维相对应。测量这三种不同超微结构的20根肌原纤维的Z线及肌节，并对其进行统计学分析。三种不同肌纤维超微结构特点见附表。
图2 红肌纤维的超微结构：线粒体(M)大且呈多型，糖元颗粒(G)多，Z线(Z)到及肌节均较宽。x8500
图3 中间肌纤维的超微结构：线粒体(M)及糖元颗粒(G)少，Z线(Z)的宽度及肌节的长度相对较短。x8760
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图4 白肌纤维的超微结构：线粒体(M)数量少且小，糖元颗粒(G)及肌浆网Z线及肌节(S)相对较宽。x8500附表 三种肌纤维的超微结构 分型
线粒体
Z线(nm)
肌节(nm)
肌浆网
糖元颗粒
红肌
多，呈弥漫分布
71.4±6.5
1857.1±12.5
丰富
, 百拇医药
多
白肌
少
72.1±7.6
1839.5±14.3
丰富
多
中间肌
较多，聚集于肌纤维周边部
62.4±6.2
1815.5±15.8
较少
少
, 百拇医药
红肌纤维、白肌纤维的Z线宽度无显著性差异(P>0.05)，但他们与中间肌Z线的宽度有显著性差异(P<0.05)，这三种肌纤维的肌节之间的差异都有显著性(P<0.05)。
3 讨论
3.1 甲杓肌组织化学分型的意义 SDH是线粒体的标志酶，其染色的深浅反映了肌纤维内线粒体的多少，线粒体的含量反应了肌纤维细胞氧化能力的高低。甲杓肌经SDH染色，根据呈色深浅的不同，可将肌纤维分为红肌、白肌、中间肌三种类型。其中红肌纤维染色最深，SDH活性强，线粒体含量最多，该型肌纤维既能有氧代谢，又能通过糖酵解提供能量，生理学已证明该种肌纤维能够快速收缩而不易疲劳，适于持久的快速运动。白肌纤维染色最浅，SDH活性极弱，线粒体含量少，这种肌纤维主要从无氧糖酵解来获取能量，其收缩张力大，不耐疲劳，因而适于爆发性的短时张力强的快速运动[3～5]。中间型肌纤维染色介于红肌纤维和白肌纤维之间，因此线粒体含量也介于红、白肌之间，收缩速度慢，兴奋阈低，容易发动而不易疲劳，因而适合维持平衡和姿势。红肌纤维和白肌纤维因收缩速度快，也被称为快肌肌纤维，中间肌纤维因收缩速度慢，也被称为慢肌纤维。同一种动物中，由于肢体部位不同肌肉亦有不同功能，每种肌肉内肌纤维的构成比和分布各异，但多以一种肌纤维型占优势，此种纤维是构成肌肉活动的主要基础。甲杓肌各型肌纤维的比例，直径及其排列方式都有自身特点。甲杓肌快肌占72.1%，其中红肌肌纤维比例为53.3%，白肌比例为17.8%，表明甲杓肌既能快速收缩，又能耐受疲劳，甲杓肌各型纤维直径都很细小，不象其他骨骼肌纤维那样粗大，另外，肌纤维之间排列疏松，肌纤维收缩空间大。甲杓肌所有这些特点都与其完成特定的发声功能有关。
, 百拇医药
3.2 甲杓肌电镜下的超微结构特点 在电镜下，能观察到肌纤维更精细的结构，如线粒体、肌浆网、糖元颗粒、肌节、Z线等。其中，肌节是肌原纤维上相邻两个Z线之间的一段肌原纤维，也是肌纤维结构和功能的基本单位。自从用组织化学方法区分肌纤维类型以来，人们开始探讨各型肌纤维型的超微结构特点。1966年，Shafiq[6]等学者研究认为股外直肌中红肌比白肌的线粒体数目多，但没有提出电镜下区分肌纤维型的标准。1969年Ogata发现红肌与白肌的显著不同的是线粒体的形态与大小，红肌纤维线粒体肥大且多型，而白肌线粒体狭长。这些学者的研究还都局限于对电镜下肌纤维内的线粒体的定性分析。Sjostrom[7]等学者对人四肢肌的三种肌纤维分型的超微结构作了定量分析，认为肌纤维的Z线及M线的宽度对肌纤维分型有重要意义。目前的研究大多以人或动物的躯干或四肢肌为对象，而对于喉内肌超微结构的研究还很不充分。本实验对狗甲杓肌在电镜下进行观察，发现从线粒体的数量、肌浆网及糖原颗粒的多少等几方面可以区分出三种不同的超微结构，其与光镜下的分型一一对应。并发现红肌纤维、白肌纤维及中间肌纤维肌节的宽度存在明显差别(P<0.05)，快肌(包括白肌纤维和红肌纤维)与慢肌纤维(即中间肌纤维)的Z线宽度有显著性差别，可见定量分析Z线及肌节的宽度对于电镜下的肌纤维分型有重要意义。
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 陈啸梅.组织化学手册.北京：人民卫生出版社，1982.224～225.
2 Robert J,Tomanek,Donald D.Degeneration of different types of skeletal muscle fibers,l.Denervation J.Anat,1973,116:395.
3 李志义.人类骨骼肌的肌纤维型及其分布特征.遵义医学院学报，1991，2：49.
4 王东林.骨骼肌纤维类型及其细胞与分子基础.国外医学生理，病理科学与临床分册，1995，15：9.
5 李明扬.人类四肢骨骼肌的肌纤维型分布.解剖学杂志，1992，2：146.
, 百拇医药
6 Shafiq SA,Gorycki M,Goldstone L,et al.Fine structure of fiber types in nomal human muscle.Anat Rec,1996:156.
7 Sjostrom M，Kidman S,Larsen KH,et al.Z-and M-band appearance in different histochemically defined types of human skeletal muscle fibers.Journal of Histochemisty and Cytochemistry,1982,30:1.
(1999-01-05收稿 1999-04-07修回), http://www.100md.com