水杨酸钠降低庆大霉素所致耳蜗自由基含量的实验研究
作者：陈贤明 王锦玲 姜鸿彦 陈亚东
单位：陈贤明(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科 西安 710032)；王锦玲(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科 西安 710032)；姜鸿彦(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科 西安 710032)陈亚东(兰州大学分析测试中心)
关键词：庆大霉素；自由基；耳蜗；水杨酸钠；电子顺磁共振法
听力学及言语疾病杂志000202 【摘要】 目的 采用电子顺磁共振法(electron paramagnetic resonance spectroscopy,EPR)观察水杨酸钠对庆大霉素注射过程中耳蜗组织羟自由基含量增加的预防作用。方法 耳廓反射良好的豚鼠随机分成3组，庆大霉素组、庆大霉素+水杨酸钠组和正常对照组。取标本前和标本制备时向耳蜗组织加入自由基捕捉剂5，5-dimethyl-pyrroline-1-oxide(DMPO)，用EPR直接检测耳蜗组织中自由基含量。结果 正常对照组耳蜗组织可测出较弱的羟(OH)自由基信号，庆大霉素注射后，自由基信号明显增强(P<0.01)，水杨酸钠和庆大霉素同时注射，自由基信号明显减弱(P<0.01)。结论 加入自由基捕捉剂DMPO，用EPR直接检测耳蜗组织中自由基含量是一种较有效的方法；水杨酸钠可部分清除庆大霉素治疗过程中产生的过量自由基。
, 百拇医药
【中图分类号】 R764.5 【文献标识码】 A
【文章编号】1006-7299(2000)02-0068-03
An Experimental Study on Salicylate Preventing Exessive Free Radicals
in Cochlea From Generated by Gentamicin Injection
Chen Xianming,Wang Jinling,Jiang Hongyan,et al.
(Department of Otolaryngology,Xijing Hospital,Forth
Military Medical University,Xi'an,710032)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the effed of salicylate in preventtng excessive free radicals in cochlea from generated by Gentamicin injection.Methods The animals were arranged in three groups(Gentamicin;salicylate and Gentamicin;control).5,5-dimethyl-pyrroline-l-oxide(DMPO),a spin trap agent,was injected into the cochleas and added in cochlea homogenates.Electron paramagnetic resonance spectroscopy(EPR)was used to provide a direct measure of oxygen radical production-hydroxyl radical in guinea pig's cochlea.Results DMPO-OH adduct coulel be detected in normal cochlea by EPR.There were only weak signals in control group,after animals were injected by Gentamicin for three days,the EPR signals became stronger(P<0.01)when animals were injected with Gentamicin and salicylate simultaneously,signals from free radicals in cochlea weakened obviously(P<0.01).Conclusion EPR,combined with spin trapping,is an effective method to detect free radicals in cochlea,and salicylate can partly prevent excessive free radicals from generatied by Gentamicin injection.
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【Key words】 Gentamicin Free radicals Cochlea Salicylate Electron paramagnetic resonance spectroscopy(EPR)
大量研究资料表明，氧自由基参与缺血再灌注损伤、炎症、药物毒性、衰老、肿瘤等病理过程，能对多种重要的生物大分子如核酸、蛋白质、脂质等造成氧化损伤，导致多种病理损害。在氨基甙类抗生素(AmAn)引起内耳损害过程中也有自由基参与[1，2]。如何预防和减轻AmAn的耳毒性是耳鼻咽喉科领域一道难题。有研究发现水杨酸钠可竞争性地抑制氧自由基的产生[3]，提示水杨酸钠可能预防或减轻AmAn的耳毒性。羟自由基(OH)是细胞毒性较大的氧自由基之一，但其性质活泼，寿命极短，一般方法难以直接检测。电子顺磁共振(EPR)技术是目前直接检测自由基的唯一方法[4]。本实验用EPR法研究了水杨酸钠对庆大霉素注射过程中产生过量羟自由基的预防作用。
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1 资料与方法
1.1 材料及分组 选耳廓反射良好的花色豚鼠为实验动物，体重250～350 g，雌雄不拘。随机分为3组，每组6只。庆大霉素组在EPR测试前肌注硫酸庆大霉素(200 mg.kg-1.d-1)3天；庆大霉素+水杨酸钠组，肌注硫酸庆大霉素方法同前，同时每天肌注水杨酸钠200 mg.kg-1.d-1；对照组注射等量生理盐水。
1.2 标本制备 实验动物腹腔内注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，切除耳廓，打开听泡，充分止血，去除镫骨底板并刺破圆窗膜，用微量注射器从圆窗处向蜗内注入DMPO(Sigma公司生产)约20 μL(DMPO浓度为100 mM)[5]。5分钟后迅速取下两侧听泡，剔除蜗壳，将蜗轴连同膜蜗管取下，加3倍体积Hank液(含DMPO100 mM)在离心管内用玻璃捧将上述组织研碎制成匀浆，组织匀浆静置片刻取上部组织悬液进行EPR分析。
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1.3 EPR测试方法 取上述组织悬液约50 μL，注入细玻璃管内，放入EPR测试腔。仪器为ER200D-SRC型EPR波谱仪(德国Bruker)。X-波段，常温下测试，微波频率9.78 GHz，微波功率30 mW、调频100 kHz、调幅1 Gs、扫描时间200 s、扫描次数10次，所得信号经计算机分析处理。放大倍数为10×105。
以EPR波谱第二峰的高度作为自由基含量的相对值，所得结果经t检验。
2 结果
当一个自由电子周围存在氮、氢两个不等性核时，经计算机模拟出的EPR波谱呈4峰谱线，其峰强度比为1：2：2：1，超精细分裂常数为aN＝aH＝14.9 Gs(图1)，此为OH被DMPO捕捉后出现的典型的EPR波谱。正常生物组织也有少量自由基生产，这些自由基被自由基捕捉剂DMPO捕捉后经EPR测试也呈现出一组4峰谱线，强度比和超精细分裂常数值与图1相似，只是信号较弱(图2)。庆大霉素组信号有所增强(图3)，表明庆大霉素可增加动物耳蜗OH自由基含量。而庆大霉素+水杨酸钠组，EPR信号又减弱(图4)，表明水杨酸钠抑制了OH的生成，或清除了部分过量OH自由基。无组织成分的空白对照液中，未测出任何特征性的信号峰(图5)。
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各组标本自由基含量相对值及比较分析见附表。
图1 计算机模拟EPR波谱，超精细分裂常数为
aN=aH=14.9 Gs，峰强度比为1：2：2：1
图2 正常豚鼠耳蜗EPR波谱，可见较弱羟自由基信号
图3 庆大霉素组豚鼠耳蜗EPR波谱，羟自由基
信号较正常组明显增强
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图4 水杨酸钠+庆大霉素组豚鼠耳蜗羟自由基信号减弱
图5 无组织成份的Hank液，EPR测试无羟自由基信号
附表 各组自由基含量的相对值(
±s) 分组
例数
自由基相对值
对照组
庆大霉素组
庆大霉素+
水杨酸钠组
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6
6
6
1
2.14±0.077
1.45±0.052*
*庆大霉素+水杨酸钠组与庆大霉素组比较P<0.013 讨论
自由基是指带有不成对电子的原子、分子或离子。由于带有不成对电子，具有顺磁特性。这种不成对电子在外界静磁场的作用下，能吸收电磁波的能量，而实现电子在能级间的跃迁。电子顺磁共振法是利用这一特性，对具有顺磁性的物质进行检测和分析的一种方法[5]。由于自由基具有不成对电子，很活泼，其稳定浓度难以达到EPR波谱仪检测阈值所要求的水平，用普通方法很难检测。自旋捕捉剂为一类抗磁性化合物，能与自由基起加成反应生成寿命较长的自旋加合物，后者可在常温下用常规EPR法研究。DMPO是目前常用的羟基捕捉剂，它能与氧族自由基OH形成稳定的自旋加合物(DMPO-OH)，EPR测试可呈现特征性波谱，如图1所示，表现为强度比为1：2：2：1，超精细分裂常数为aN＝aH=14.9 Gauss的一组峰。由于生物标本多种成分的干扰，出现一些不规则杂波，但OH自由基的特征峰尚清晰。
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由于生物体自由基含量极低，直接测试很难得到明显信号，必须使用自由基捕捉剂，以便使自由基积累到相当浓度。有人用该方法对胰腺组织匀奖及动物心脏灌注液进行自由基检测，均获得成功[8] 。我们在取标本前向耳蜗内注入少量DMPO，制备组织悬液时再加入DMPO，目的是使组织内自由基积聚到足够浓度。结果证明该方法直接检测到耳蜗组织自由基含量。据文献报道，100 mM浓度的DMPO已能够充分捕捉生物标本内的羟自由基，并被仪器检测[5]。为减少操作过程中自由基丢失，标本取出后应尽快进行EPR测试，并防止血液等污染。
正常情况下生物细胞不断有自由基产生，其中以氧族自由基为主，如超氧阴离子(O2-)和OH，O2-在过渡金属(如铁)离子存在的情况下可被催化生成毒性更强的OH(Fenton型Haber-weiss反应)[6]。氨基甙类抗生素在耳蜗毛细胞的积聚部位主要是线粒体[7]，线粒体是细胞能量代谢、蛋白合成的主要部位。线粒体功能障碍，可能影响自由基代谢相关酶的合成和活性，同时电子传递链中也可能有更多电子溢出。自由基的生成增加和代谢障碍，将使耳蜗毛细胞受损。
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OH化学性质十分活泼，不仅攻击各种生物大分子，还选择性地攻击芳香化合物的苯环，并与之起加成反应。水杨酸盐是临床常用的一类药物，在体内迅速解离出水杨酸，水杨酸的苯环被OH羟化生成二羟基苯甲酸[9]，二羟基苯甲酸又可作为铁离子螯合剂，抑制铁介导的Fenton型Haber-weiss反应，减少OH的生成[10]。也就是说水杨酸具有减少OH生成和清除OH的作用。AmAn注射过程中可引起耳蜗组织自由基含量增加，水杨酸钠与庆大霉素同时应用，能减少AmAn注射过程中羟自由基的产生。水杨酸钠是否能减轻AmAn治疗过程中所致的听力损害，尚须进一步研究。
作者简介：陈贤明(1964-)，男，安徽人，在读博士研究生。
参考文献
1，Pierson MG,Moller AR.Prephylaxis of kanamycin-induced ototoxicity by a radiopretectant[J].Hear Res,1981,4:79.
, http://www.100md.com
2，Song BB,Anderson DJ,Schacht J.Protection from gentamycin ototoxicity by iron chelators in guinea pig in vivo[J].J Pharmacol Exp Ther,1997,282:369.
3，Halliwell B,Gutteridge JMC.Role of iron in oxygen radical reactions[J].Methods Enzymol,1984,105:47.
4，Floyd RA,Lewis CA.Hydroxyl free radical formation from hydrogen peroxide by ferrous iron-nucleotide complexes[J].Biochem,1983,22:2645.
5，Buettner GR,Oberley LW.Considerations in the spin trapping of supperoxide and hydroxyl radical in aqueous systems using DMPO[J].Bioche Biophy Res Commun,1978,83:69.
, http://www.100md.com
6，Hardy JA,Aust AE.Iron in asbestos chemistry and carcinogenicity[J].chem Rev,1995,95:97.
7，丁大连.卡那霉素在耳蜗毛细胞中的积聚部位[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1997，32：348.
8，Pieper GM,Felix CC,Kalyanaraman B,et al.Detection by ESR of DMPO hybroxyl adduct formation from islets of Langerhans[J].Free Radic Bio Med,1995,19:219.
9，Moorhouse CP,Halliwell B,Grootveld M,el al.Cobalt(Ⅱ)ion as a promotor of hydroxyl radical and possible “crypto-hydroxyl”radical formation under physiological condition.Differential effects of hydroxyl radical scavengers[J].Biochem Biophys Acta,1985,843:261.
10，Walker PD,Shah SV.Evidence suggesting a role for hydroxyl radical in gentamicin-induced acute renal failure in rats[J].J Clin Invest,1988,81:334.
1999-07-08收稿
1999-11-17修回, 百拇医药
单位：陈贤明(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科 西安 710032)；王锦玲(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科 西安 710032)；姜鸿彦(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科 西安 710032)陈亚东(兰州大学分析测试中心)
关键词：庆大霉素；自由基；耳蜗；水杨酸钠；电子顺磁共振法
听力学及言语疾病杂志000202 【摘要】 目的 采用电子顺磁共振法(electron paramagnetic resonance spectroscopy,EPR)观察水杨酸钠对庆大霉素注射过程中耳蜗组织羟自由基含量增加的预防作用。方法 耳廓反射良好的豚鼠随机分成3组，庆大霉素组、庆大霉素+水杨酸钠组和正常对照组。取标本前和标本制备时向耳蜗组织加入自由基捕捉剂5，5-dimethyl-pyrroline-1-oxide(DMPO)，用EPR直接检测耳蜗组织中自由基含量。结果 正常对照组耳蜗组织可测出较弱的羟(OH)自由基信号，庆大霉素注射后，自由基信号明显增强(P<0.01)，水杨酸钠和庆大霉素同时注射，自由基信号明显减弱(P<0.01)。结论 加入自由基捕捉剂DMPO，用EPR直接检测耳蜗组织中自由基含量是一种较有效的方法；水杨酸钠可部分清除庆大霉素治疗过程中产生的过量自由基。
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【中图分类号】 R764.5 【文献标识码】 A
【文章编号】1006-7299(2000)02-0068-03
An Experimental Study on Salicylate Preventing Exessive Free Radicals
in Cochlea From Generated by Gentamicin Injection
Chen Xianming,Wang Jinling,Jiang Hongyan,et al.
(Department of Otolaryngology,Xijing Hospital,Forth
Military Medical University,Xi'an,710032)
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【Abstract】 Objective To investigate the effed of salicylate in preventtng excessive free radicals in cochlea from generated by Gentamicin injection.Methods The animals were arranged in three groups(Gentamicin;salicylate and Gentamicin;control).5,5-dimethyl-pyrroline-l-oxide(DMPO),a spin trap agent,was injected into the cochleas and added in cochlea homogenates.Electron paramagnetic resonance spectroscopy(EPR)was used to provide a direct measure of oxygen radical production-hydroxyl radical in guinea pig's cochlea.Results DMPO-OH adduct coulel be detected in normal cochlea by EPR.There were only weak signals in control group,after animals were injected by Gentamicin for three days,the EPR signals became stronger(P<0.01)when animals were injected with Gentamicin and salicylate simultaneously,signals from free radicals in cochlea weakened obviously(P<0.01).Conclusion EPR,combined with spin trapping,is an effective method to detect free radicals in cochlea,and salicylate can partly prevent excessive free radicals from generatied by Gentamicin injection.
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【Key words】 Gentamicin Free radicals Cochlea Salicylate Electron paramagnetic resonance spectroscopy(EPR)
大量研究资料表明，氧自由基参与缺血再灌注损伤、炎症、药物毒性、衰老、肿瘤等病理过程，能对多种重要的生物大分子如核酸、蛋白质、脂质等造成氧化损伤，导致多种病理损害。在氨基甙类抗生素(AmAn)引起内耳损害过程中也有自由基参与[1，2]。如何预防和减轻AmAn的耳毒性是耳鼻咽喉科领域一道难题。有研究发现水杨酸钠可竞争性地抑制氧自由基的产生[3]，提示水杨酸钠可能预防或减轻AmAn的耳毒性。羟自由基(OH)是细胞毒性较大的氧自由基之一，但其性质活泼，寿命极短，一般方法难以直接检测。电子顺磁共振(EPR)技术是目前直接检测自由基的唯一方法[4]。本实验用EPR法研究了水杨酸钠对庆大霉素注射过程中产生过量羟自由基的预防作用。
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1 资料与方法
1.1 材料及分组 选耳廓反射良好的花色豚鼠为实验动物，体重250～350 g，雌雄不拘。随机分为3组，每组6只。庆大霉素组在EPR测试前肌注硫酸庆大霉素(200 mg.kg-1.d-1)3天；庆大霉素+水杨酸钠组，肌注硫酸庆大霉素方法同前，同时每天肌注水杨酸钠200 mg.kg-1.d-1；对照组注射等量生理盐水。
1.2 标本制备 实验动物腹腔内注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，切除耳廓，打开听泡，充分止血，去除镫骨底板并刺破圆窗膜，用微量注射器从圆窗处向蜗内注入DMPO(Sigma公司生产)约20 μL(DMPO浓度为100 mM)[5]。5分钟后迅速取下两侧听泡，剔除蜗壳，将蜗轴连同膜蜗管取下，加3倍体积Hank液(含DMPO100 mM)在离心管内用玻璃捧将上述组织研碎制成匀浆，组织匀浆静置片刻取上部组织悬液进行EPR分析。
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1.3 EPR测试方法 取上述组织悬液约50 μL，注入细玻璃管内，放入EPR测试腔。仪器为ER200D-SRC型EPR波谱仪(德国Bruker)。X-波段，常温下测试，微波频率9.78 GHz，微波功率30 mW、调频100 kHz、调幅1 Gs、扫描时间200 s、扫描次数10次，所得信号经计算机分析处理。放大倍数为10×105。
以EPR波谱第二峰的高度作为自由基含量的相对值，所得结果经t检验。
2 结果
当一个自由电子周围存在氮、氢两个不等性核时，经计算机模拟出的EPR波谱呈4峰谱线，其峰强度比为1：2：2：1，超精细分裂常数为aN＝aH＝14.9 Gs(图1)，此为OH被DMPO捕捉后出现的典型的EPR波谱。正常生物组织也有少量自由基生产，这些自由基被自由基捕捉剂DMPO捕捉后经EPR测试也呈现出一组4峰谱线，强度比和超精细分裂常数值与图1相似，只是信号较弱(图2)。庆大霉素组信号有所增强(图3)，表明庆大霉素可增加动物耳蜗OH自由基含量。而庆大霉素+水杨酸钠组，EPR信号又减弱(图4)，表明水杨酸钠抑制了OH的生成，或清除了部分过量OH自由基。无组织成分的空白对照液中，未测出任何特征性的信号峰(图5)。
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各组标本自由基含量相对值及比较分析见附表。
图1 计算机模拟EPR波谱，超精细分裂常数为
aN=aH=14.9 Gs，峰强度比为1：2：2：1
图2 正常豚鼠耳蜗EPR波谱，可见较弱羟自由基信号
图3 庆大霉素组豚鼠耳蜗EPR波谱，羟自由基
信号较正常组明显增强
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图4 水杨酸钠+庆大霉素组豚鼠耳蜗羟自由基信号减弱
图5 无组织成份的Hank液，EPR测试无羟自由基信号
附表 各组自由基含量的相对值(
±s) 分组例数
自由基相对值
对照组
庆大霉素组
庆大霉素+
水杨酸钠组
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6
6
6
1
2.14±0.077
1.45±0.052*
*庆大霉素+水杨酸钠组与庆大霉素组比较P<0.013 讨论
自由基是指带有不成对电子的原子、分子或离子。由于带有不成对电子，具有顺磁特性。这种不成对电子在外界静磁场的作用下，能吸收电磁波的能量，而实现电子在能级间的跃迁。电子顺磁共振法是利用这一特性，对具有顺磁性的物质进行检测和分析的一种方法[5]。由于自由基具有不成对电子，很活泼，其稳定浓度难以达到EPR波谱仪检测阈值所要求的水平，用普通方法很难检测。自旋捕捉剂为一类抗磁性化合物，能与自由基起加成反应生成寿命较长的自旋加合物，后者可在常温下用常规EPR法研究。DMPO是目前常用的羟基捕捉剂，它能与氧族自由基OH形成稳定的自旋加合物(DMPO-OH)，EPR测试可呈现特征性波谱，如图1所示，表现为强度比为1：2：2：1，超精细分裂常数为aN＝aH=14.9 Gauss的一组峰。由于生物标本多种成分的干扰，出现一些不规则杂波，但OH自由基的特征峰尚清晰。
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由于生物体自由基含量极低，直接测试很难得到明显信号，必须使用自由基捕捉剂，以便使自由基积累到相当浓度。有人用该方法对胰腺组织匀奖及动物心脏灌注液进行自由基检测，均获得成功[8] 。我们在取标本前向耳蜗内注入少量DMPO，制备组织悬液时再加入DMPO，目的是使组织内自由基积聚到足够浓度。结果证明该方法直接检测到耳蜗组织自由基含量。据文献报道，100 mM浓度的DMPO已能够充分捕捉生物标本内的羟自由基，并被仪器检测[5]。为减少操作过程中自由基丢失，标本取出后应尽快进行EPR测试，并防止血液等污染。
正常情况下生物细胞不断有自由基产生，其中以氧族自由基为主，如超氧阴离子(O2-)和OH，O2-在过渡金属(如铁)离子存在的情况下可被催化生成毒性更强的OH(Fenton型Haber-weiss反应)[6]。氨基甙类抗生素在耳蜗毛细胞的积聚部位主要是线粒体[7]，线粒体是细胞能量代谢、蛋白合成的主要部位。线粒体功能障碍，可能影响自由基代谢相关酶的合成和活性，同时电子传递链中也可能有更多电子溢出。自由基的生成增加和代谢障碍，将使耳蜗毛细胞受损。
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OH化学性质十分活泼，不仅攻击各种生物大分子，还选择性地攻击芳香化合物的苯环，并与之起加成反应。水杨酸盐是临床常用的一类药物，在体内迅速解离出水杨酸，水杨酸的苯环被OH羟化生成二羟基苯甲酸[9]，二羟基苯甲酸又可作为铁离子螯合剂，抑制铁介导的Fenton型Haber-weiss反应，减少OH的生成[10]。也就是说水杨酸具有减少OH生成和清除OH的作用。AmAn注射过程中可引起耳蜗组织自由基含量增加，水杨酸钠与庆大霉素同时应用，能减少AmAn注射过程中羟自由基的产生。水杨酸钠是否能减轻AmAn治疗过程中所致的听力损害，尚须进一步研究。
作者简介：陈贤明(1964-)，男，安徽人，在读博士研究生。
参考文献
1，Pierson MG,Moller AR.Prephylaxis of kanamycin-induced ototoxicity by a radiopretectant[J].Hear Res,1981,4:79.
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2，Song BB,Anderson DJ,Schacht J.Protection from gentamycin ototoxicity by iron chelators in guinea pig in vivo[J].J Pharmacol Exp Ther,1997,282:369.
3，Halliwell B,Gutteridge JMC.Role of iron in oxygen radical reactions[J].Methods Enzymol,1984,105:47.
4，Floyd RA,Lewis CA.Hydroxyl free radical formation from hydrogen peroxide by ferrous iron-nucleotide complexes[J].Biochem,1983,22:2645.
5，Buettner GR,Oberley LW.Considerations in the spin trapping of supperoxide and hydroxyl radical in aqueous systems using DMPO[J].Bioche Biophy Res Commun,1978,83:69.
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6，Hardy JA,Aust AE.Iron in asbestos chemistry and carcinogenicity[J].chem Rev,1995,95:97.
7，丁大连.卡那霉素在耳蜗毛细胞中的积聚部位[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1997，32：348.
8，Pieper GM,Felix CC,Kalyanaraman B,et al.Detection by ESR of DMPO hybroxyl adduct formation from islets of Langerhans[J].Free Radic Bio Med,1995,19:219.
9，Moorhouse CP,Halliwell B,Grootveld M,el al.Cobalt(Ⅱ)ion as a promotor of hydroxyl radical and possible “crypto-hydroxyl”radical formation under physiological condition.Differential effects of hydroxyl radical scavengers[J].Biochem Biophys Acta,1985,843:261.
10，Walker PD,Shah SV.Evidence suggesting a role for hydroxyl radical in gentamicin-induced acute renal failure in rats[J].J Clin Invest,1988,81:334.
1999-07-08收稿
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