第三代新维甲类化合物R9158对人急性早幼粒白血病NB4细胞的分化诱导作用
作者：何小庆 韩 锐
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050
关键词：维甲类；细胞分化；白血病NB4细胞
摘要 目的 为了研究本所合成的第三代新维甲类化合物3 摘要 目的 为了研究本所合成的第三代新维甲类化合物3′，5′，二叔丁基-4′-甲氧基-4-羧基查尔酮酸(R9158)对NB4细胞的分化诱导作用。方法 从形态、功能及染色体核型等方面观察R9158对NB4细胞的影响。结果 发现R9158与全反式维甲酸(RA)相似，可明显抑制NB4细胞的生长及克隆形成，且在相同浓度下R9158的作用强于RA。用10-6 mol/L R9158处理NB4细胞，发现随作用时间的延长NBT还原能力也明显增强，处理6 d时NBT阳性率为97.5%。用R9158与RA处理NB4细胞，NBT还原的ED50分别为3.9×10-9及2.8×10-9 mol/L。形态学检查表明，用10-6 mol/L R9158及RA诱导2 d，可使细胞缩小；处理6 d，细胞向成熟方向分化，但大多数细胞处于中幼及晚幼粒细胞阶段。染色体核型分析表明，NB4细胞具有亚四倍体型染色体核型，用R9158处理可使其非整倍体染色体数目下降。从对照的80.85±7.5降至72.96±6.9(P<0.01)。G带显示，用10-6 mol/L R9158及RA处理NB4细胞6 d，其典型的t(15；17)易位未见消失。结论 R9158对NB4细胞具有显著的分化诱导作用。
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中图号 R733.71
图 1 RA及R9158的化学结构式
Fig 1 The chemical structure of RA and R9158
癌症是一种分化受阻或反分化疾病，维生素A及维甲类化合物可使癌细胞表型逆转，诱导细胞向正常方向分化[1，2]。全反式维甲酸(RA)治疗人急性早幼粒白血病(APL)的成功显示了分化治疗的可行性[3，4]，然而RA在分化治疗中也存在局限性[5]。3′，5′，二叔丁基-4′-甲氧基-4-羧基查尔酮(R9158)是本所新合成的第三代维甲类化合物，经计算机分子模拟计算，其立体构象与全反式维甲酸(RA)非常相似(图1)。本实验采用来自APL患者并经传代培养的NB4细胞研究R9158的体外癌分化诱导作用。
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1 材料和方法
细胞及培养条件 人急性早幼粒白血病NB4细胞含t(15；17)易位， 由美国 S.Waxman 教授惠赠。 细胞培养用RPMI-1640， 含体积分数为10%胎牛血清(Hyclone公司)、 青霉素100 U/ml及链霉素100 μg/ml的培养液， 在37℃、 体积分数为5%CO2的培养箱内培养传代。
药品及试剂 R9158相对分子质量为394.54，乳白色粉末，性质稳定；RA相对分子质量为300.44，黄色粉末，见光易分解，两药均由本所合成室郭宗儒教授提供。实验时用无水乙醇配制，细胞培养液中无水乙醇终体积分数为0.1%。甲基蓝四氮唑(P-Nitro blue tetrazalium chloride,NBT),Sigma公司产品，以DMSO助溶、生理盐水稀释。TPA(12-o-tetradecanoy (phorbol-13-acetate),Sigma公司产品，以DMSO溶解，配成母液，分装、-80℃储存，临用前用生理盐水稀释。
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细胞生长曲线测定 取对数生长期细胞制成0.5×105 个/ml细胞悬液，分装于24孔板中，分组加药，对照组加相应溶剂，每组设3个平行孔。置含体积分数为5% CO2的37℃培养箱中培养，于给药后不同时间取出一定量细胞，按台盼蓝排斥法计数死及活细胞。
软琼脂克隆形成率测定[6] 采用双层软琼脂培养法。 在31 mm平皿中加入不同浓度的药物和相应溶剂后， 加含0.5%琼脂及体积分数为20%胎牛血清的RPMI 1640作为底层培养基， 上层加含0.3%琼脂， 1000个活细胞体积分数为20%胎牛血清的RPMI 1640培养基， 在37℃、 体积分数为5% CO2及一定温度的温箱中培养14 d。 在16×解剖镜下计数集落数。
NBT还原能力测定[7] 将药物作用一定时间的细胞和对照组细胞在4℃下，1 000 r/min离心5 min，弃上清，每管加0.5 ml 含0.1% NBT、200 ng/ml TPA 的生理盐水，置37℃水浴保温1 h，1 000 r/min离心5 min，取细胞沉淀涂片，Wright-Giemsa染色10 min，油镜下每玻片观察200个细胞，胞浆中有蓝紫色甲FDA3颗粒者为NBT阳性细胞，计算NBT阳性细胞百分数。
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细胞形态观察[8] 将药物作用一定时间的细胞和对照组细胞在4℃下，1 000 r/min离心5 min，取细胞沉淀涂片，Wright-Giemsa染色，油镜下观察细胞形态学变化，每玻片观察200个细胞，分别计数不同分化时期细胞的百分数。
染色体制备及G显带[9] 取对数生长期细胞，加药及相应溶剂处理一定时间后，在终止培养前1 h加0.2 μg/ml秋水仙素，1 000 r/min离心8 min，收获细胞，用浓度为0.075 mol/L KCl 37℃低渗处理20 min，加新鲜制备的甲醇∶冰醋酸=3∶1(体积分数)，预固定8 min，1 000 r/min离心10 min，弃上清，轻轻吹起沉淀，再反复固定3次，每次10 min，取细胞沉淀滴片，风干。
G显带：将制备好的中期染色体片置37℃烤箱中过夜，用0.025%胰酶消化20 s，生理盐水浸洗2次，Giemsa染色，油镜下观察计数50～100个中期分裂相细胞中染色体数目并配对进行核型分析。
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统计处理 数据以均值±标准差(
+s)表示，用t检验检查组间差异的显著性。
2 结果
R9158对NB4细胞增殖能力的影响 对NB4细胞生长曲线的影响:用浓度为10-6 mol/L的R9158及RA分别处理NB4细胞，结果表明，随作用时间延长，R9158及RA对NB4细胞的生长抑制作用加强，R9158作用6 d可使抑制率达到76%，R9158的作用强于RA(P<0.01)(图2)。
对NB4细胞克隆形成率的影响：浓度为10-9～10-6 mol/L R9158均可抑制NB4细胞的克隆形成率，这种作用呈明显的浓度依赖关系，且强于RA(图3)。
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图 2 R9158及RA对NB4细胞生长的影响
Fig 2 Effect of R9158 and RA on the growth of NB4 cells (
±s,n=6)
图 3 R9158及RA对NB4细胞软琼脂克隆形成率的影响
Fig 3 Effect of R9158 and RA on clonogenicity of NB4 cells in soft agar assay
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1 000 alive cells were seeded per dish and the cells were cultured in the indicated concentration for 14 days in 37℃ with 5% CO2
R9158对NB4细胞NBT还原能力的影响 用浓度为10-6mol/L R9158及RA分别处理NB4细胞，可见随作用时间延长，NBT阳性率明显增高，作用6 d时NBT阳性率分别达到97.5%(R9158)及95%(RA)(图4)。用不同浓度(10-10～10-5 mol/L)的R9158及RA处理NB4细胞4 d，可见随浓度增加，NBT还原反应阳性率也增加。R9158及RA使NB4细胞NBT阳性的ED50分别为2.8×10-9及3.9×10-9 mol/L。
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图 4 R9158及RA对NB4细胞NBT还原能力的影响
Fig 4 NBT reduction activity of NB4 cells induced by R9158 and RA in the indicated concentration (±s,n=6)
R9158对NB4细胞形态的影响 用10-6 mol/L R9158及RA处理NB4细胞2 d就可见核缩小，核浆比例缩小；作用至6 d时，可见核明显缩小，染色浅淡，核仁消失，核呈肾形、马蹄形、杆状及分叶状等，胞浆出现嗜酸性颗粒并有明显空泡化。表明R9158及RA可诱导NB4细胞向粒系方向成熟分化，但大部分细胞仍处在中幼及晚幼粒细胞阶段，分叶核少见。R9158处理的NB4细胞胞浆空泡化等退行性变强于RA(图5，附表)。
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图 5 NB4细胞在10-6 mol/L R9158及RA处理4～6 d时的形态变化
Fig 5 Morphological changes of NB4 cells treated with 10-6 mol/L R9158 and RA for 4 or 6 days
A: control cells; B: cells treated with RA for 6 days; C:cells treated with R9158 for 4 days; D:cells treated with R9158 for 6 days Wright-Giemsa stain
×1 000
附表 R9158及RA(10-6 mol/L)对NB4细胞形态的影响
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Table Effect of R9158 and RA(10-6 mol/L) on the morphology of NB4 cells
(exposure time) t/d
Group
Myeloid cell type% of total cells
Promyelo
Myelo
Metamyelo
Banded andsegmented
2
, 百拇医药
Control
94
6
0
0
RA
86
14
0
0
R9158
82
18
0
, 百拇医药
0
4
Control
93
7
0
0
RA
12
60
27
1
R9158
12
, 百拇医药
62
24
2
6
Control
92
8
0
0
RA
10
45
38
7
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R9158
11
44
39
6
R9158对NB4细胞染色体的影响 用浓度为10-6 mol/L R9158及RA处理NB4细胞3～6 d后，常规制备染色体及G显带，结果发现对照组NB4细胞染色体呈亚四倍体型，染色体数目在71～99条之间；G显带表明具有明显的t(15;17)易位特征。用R9158及RA处理3～6 d，可使染色体非整倍体数目下降，对照组为80.85±7.1，R9158组为72.96±6.9(51～81)，RA组为68.5±7.0(49～78)，R9158及RA组与对照组相比差异有非常显著意义(P<0.01)，但其典型的t(15；17)易位未见消失(图6)。
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图 6 NB4细胞的核型
Fig 6 A karyotype of NB4 cell line (G-bands)
A: A karyotype of NB4 cell line (arrows indicate the rearranged chromosomes)
B: Comparison among Giemsa stained (G-bands) chromosomes 15,17 of control,RA and R9158 treated NB4 cells
3 讨论
1988年Dalton等[10]发现经典的HL-60细胞不具有急性早幼粒白血病(APL)的特征性染色体t(15；17)易位现象，按FAB分型属M2型。1991年Lanotte等[11]建立了具有典型APL特征并可被诱导向成熟分化的NB4细胞系。本实验发现本所合成的第三代新维甲类化合物R9158对NB4细胞具有很强的生长抑制作用，特别对肿瘤干细胞的克隆形成率具有明显抑制作用，高浓度(10-6 mol/L)R9158几乎可完全抑制NB4细胞的克隆生长，且其作用强于RA。R9158的这种特征有利于克服RA治疗APL时出现高白细胞血症及残留白血病干细胞引起白血病复发等问题。NBT还原能力增强是NB4细胞向成熟分化的一个标志。R9158处理NB4细胞2 d，NBT还原能力便明显改善，处理6 d可使绝大部分细胞(97.5%)呈NBT阳性；但形态观察发现R9158及RA诱导6 d后细胞分化并不完全，大部分细胞处于中幼及晚幼粒细胞阶段，成熟的杆状及分叶核细胞少见，且细胞浆出现空泡化等退行性变。提示R9158及RA诱导细胞分化可能有其他作用机制参与，如PCD等(未发表资料)。染色体分析发现，NB4细胞染色体数目呈亚四倍体，在71～99之间，与Lanotte[11]报道(68～90)相近。用R9158及RA处理后恶性白血病NB4细胞的多倍体染色体数目向二倍体趋近。染色体G显带发现NB4细胞具有APL的典型t(15；17)易位，用R9158及RA处理6 d这种易位未见消失。曾有文献报道，用RA治疗APL患者45 d可使染色体异常恢复正常；灵敏的RT-PCR检查表明，由t(15；17)易位可造成PML-RARα融合基因，后者在完全缓解期可消失[12]。本实验在体外诱导NB4细胞分化后染色体数目未完全恢复，t(15;17)易位仍然存在，这是否由于在体外诱导6 d，分化并不彻底，或是在整体条件下还有别的机制参与修复染色体数目及结构上的改变，或是染色体结构改变根本就不可逆转，均有待进一步研究证实。
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参考文献
1 Sporn MB,Roberts AB.Role of retinoids in differentiation and carcinogenesis.Cancer Res,1983,43:3034～3043
2 Hong WK,Lotan R.Retinoids in oncology.New York:Marcel Dekker Inc,1993.121～125
3 Huang ME,Ye YC,Chen JR,et al. Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia.Blood,1988,72:567～575
4 Warell RP Jr,Frankes SR,Miller WH Jr,et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans retinoic acid).N Engl J Med,1991,324:1385～1398
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5 Warell PR Jr,Pastorino U,Decensi A.Clinical toxicology of the retinoids.In:Degos L.Parkinson DR eds.Retinoids in oncology.Berlin,New York:Springer,1995.67～71
6 Cowan JD,Von Hoff DD,Dinesman A,et al. Use of a human tumor cloning system to screen retinoids for antineoplastic activity.Cancer,1983,51:92～101
7 Imaizumi M,Breitman TR.Retinoic acid-induced differentiation of the human promyelocytic leukemia cell line,HL-60 and human leukemia cell in primary culture:a model for differentiation inducing therapy of leukemia.Eur J Haematol,1987,38:289～294
, 百拇医药
8 Mauer Alvin M.The biology of human leukemia.Baltimore:The Johns Hopkins University Press,1990.207～214
9 鄂 征主编.组织培养技术.第2版.北京：人民卫生出版社，1986
10 Dalton WT,Michael JA Jr,Mc Credie KB,et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.Blood,1988,71:242～256
11 Lanotte M,Martin-Thouvenin V,Najman S, et al. NB4,a maturation inducible cell line witht (15;17) marker isolated from a human acute promyelocytic leukemia (M3).Blood,1991,77:1080～1092
, 百拇医药
12 Lo Coco F,Diverio D,Pandolfi PP,et al. Molecular evaluation of residual disease as a predictor of relapse in acute promyelocytic leukemia.Lancet,1992,340:1437～1449
Induction Differentiation by a New Third Generation Retinoid R9158on Human Acute Promyelocytic Leukemia Cell Line,NB4
He Xiaoqing Han Rui
(Institute of Materia Medica,CAMS and PUMC,Beijing 100050)
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Objective In order to investigate the differentiation of 3′，5′-ditertiary-butiary-4′-methoxy-carboxyl chalcone (R9158) on the acute promyelocytic leukemia NB4 cells. Methods By inditifying the function,morphology and karyotype of NB4 cells induced by R9158. Results Our results showed that R9158 or all-trans retinoic acid(RA) significantly inhibited the growth and colony formation of acute promyelocytic leukemia NB4 cells,while NBT-reduction (a functional differentiation marker of granulocytic) was dramatically increased when the cells were exposed to R9158 at 10-9～10-6 mol/L,and the NBT positive cells reached about 97.5% at 10-6 mol/L after 6 days expouse.The ED50 of NBT-reduction was achieved at concentration of 3.9×10-9 mol/L and 2.8×10-9 mol/L for R9158 and RA,respectively.Morphologically,most of the cells induced by R9158 and RA at 10-6 mol/L were in the myelocytic or metamyelocytic stage and a few cells were in the banded or segmented stage.Cytogenetic analysis revealed that the karyotype of NB4 cells was subtetraploid and the chromosome numbers were in the range of 71～99,when NB4 cells were treated with R9158 or RA for 3～6 days,the abnormal polyploid chormosome numbers decreased to 72.9±6.9 (P<0.01) or 68.5±7.0 (P<0.01),but the t(15;17) translation did not disappear. Conclusions R9158 has significant effects on the differentiation of NB4 cells.
Key words retinoid;cell differentiation;leukemia NB4 cell line
(1996-03-18 收稿), http://www.100md.com
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050
关键词：维甲类；细胞分化；白血病NB4细胞
摘要 目的 为了研究本所合成的第三代新维甲类化合物3 摘要 目的 为了研究本所合成的第三代新维甲类化合物3′，5′，二叔丁基-4′-甲氧基-4-羧基查尔酮酸(R9158)对NB4细胞的分化诱导作用。方法 从形态、功能及染色体核型等方面观察R9158对NB4细胞的影响。结果 发现R9158与全反式维甲酸(RA)相似，可明显抑制NB4细胞的生长及克隆形成，且在相同浓度下R9158的作用强于RA。用10-6 mol/L R9158处理NB4细胞，发现随作用时间的延长NBT还原能力也明显增强，处理6 d时NBT阳性率为97.5%。用R9158与RA处理NB4细胞，NBT还原的ED50分别为3.9×10-9及2.8×10-9 mol/L。形态学检查表明，用10-6 mol/L R9158及RA诱导2 d，可使细胞缩小；处理6 d，细胞向成熟方向分化，但大多数细胞处于中幼及晚幼粒细胞阶段。染色体核型分析表明，NB4细胞具有亚四倍体型染色体核型，用R9158处理可使其非整倍体染色体数目下降。从对照的80.85±7.5降至72.96±6.9(P<0.01)。G带显示，用10-6 mol/L R9158及RA处理NB4细胞6 d，其典型的t(15；17)易位未见消失。结论 R9158对NB4细胞具有显著的分化诱导作用。
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中图号 R733.71
图 1 RA及R9158的化学结构式
Fig 1 The chemical structure of RA and R9158
癌症是一种分化受阻或反分化疾病，维生素A及维甲类化合物可使癌细胞表型逆转，诱导细胞向正常方向分化[1，2]。全反式维甲酸(RA)治疗人急性早幼粒白血病(APL)的成功显示了分化治疗的可行性[3，4]，然而RA在分化治疗中也存在局限性[5]。3′，5′，二叔丁基-4′-甲氧基-4-羧基查尔酮(R9158)是本所新合成的第三代维甲类化合物，经计算机分子模拟计算，其立体构象与全反式维甲酸(RA)非常相似(图1)。本实验采用来自APL患者并经传代培养的NB4细胞研究R9158的体外癌分化诱导作用。
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1 材料和方法
细胞及培养条件 人急性早幼粒白血病NB4细胞含t(15；17)易位， 由美国 S.Waxman 教授惠赠。 细胞培养用RPMI-1640， 含体积分数为10%胎牛血清(Hyclone公司)、 青霉素100 U/ml及链霉素100 μg/ml的培养液， 在37℃、 体积分数为5%CO2的培养箱内培养传代。
药品及试剂 R9158相对分子质量为394.54，乳白色粉末，性质稳定；RA相对分子质量为300.44，黄色粉末，见光易分解，两药均由本所合成室郭宗儒教授提供。实验时用无水乙醇配制，细胞培养液中无水乙醇终体积分数为0.1%。甲基蓝四氮唑(P-Nitro blue tetrazalium chloride,NBT),Sigma公司产品，以DMSO助溶、生理盐水稀释。TPA(12-o-tetradecanoy (phorbol-13-acetate),Sigma公司产品，以DMSO溶解，配成母液，分装、-80℃储存，临用前用生理盐水稀释。
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细胞生长曲线测定 取对数生长期细胞制成0.5×105 个/ml细胞悬液，分装于24孔板中，分组加药，对照组加相应溶剂，每组设3个平行孔。置含体积分数为5% CO2的37℃培养箱中培养，于给药后不同时间取出一定量细胞，按台盼蓝排斥法计数死及活细胞。
软琼脂克隆形成率测定[6] 采用双层软琼脂培养法。 在31 mm平皿中加入不同浓度的药物和相应溶剂后， 加含0.5%琼脂及体积分数为20%胎牛血清的RPMI 1640作为底层培养基， 上层加含0.3%琼脂， 1000个活细胞体积分数为20%胎牛血清的RPMI 1640培养基， 在37℃、 体积分数为5% CO2及一定温度的温箱中培养14 d。 在16×解剖镜下计数集落数。
NBT还原能力测定[7] 将药物作用一定时间的细胞和对照组细胞在4℃下，1 000 r/min离心5 min，弃上清，每管加0.5 ml 含0.1% NBT、200 ng/ml TPA 的生理盐水，置37℃水浴保温1 h，1 000 r/min离心5 min，取细胞沉淀涂片，Wright-Giemsa染色10 min，油镜下每玻片观察200个细胞，胞浆中有蓝紫色甲FDA3颗粒者为NBT阳性细胞，计算NBT阳性细胞百分数。
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细胞形态观察[8] 将药物作用一定时间的细胞和对照组细胞在4℃下，1 000 r/min离心5 min，取细胞沉淀涂片，Wright-Giemsa染色，油镜下观察细胞形态学变化，每玻片观察200个细胞，分别计数不同分化时期细胞的百分数。
染色体制备及G显带[9] 取对数生长期细胞，加药及相应溶剂处理一定时间后，在终止培养前1 h加0.2 μg/ml秋水仙素，1 000 r/min离心8 min，收获细胞，用浓度为0.075 mol/L KCl 37℃低渗处理20 min，加新鲜制备的甲醇∶冰醋酸=3∶1(体积分数)，预固定8 min，1 000 r/min离心10 min，弃上清，轻轻吹起沉淀，再反复固定3次，每次10 min，取细胞沉淀滴片，风干。
G显带：将制备好的中期染色体片置37℃烤箱中过夜，用0.025%胰酶消化20 s，生理盐水浸洗2次，Giemsa染色，油镜下观察计数50～100个中期分裂相细胞中染色体数目并配对进行核型分析。
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统计处理 数据以均值±标准差(
+s)表示，用t检验检查组间差异的显著性。2 结果
R9158对NB4细胞增殖能力的影响 对NB4细胞生长曲线的影响:用浓度为10-6 mol/L的R9158及RA分别处理NB4细胞，结果表明，随作用时间延长，R9158及RA对NB4细胞的生长抑制作用加强，R9158作用6 d可使抑制率达到76%，R9158的作用强于RA(P<0.01)(图2)。
对NB4细胞克隆形成率的影响：浓度为10-9～10-6 mol/L R9158均可抑制NB4细胞的克隆形成率，这种作用呈明显的浓度依赖关系，且强于RA(图3)。
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图 2 R9158及RA对NB4细胞生长的影响
Fig 2 Effect of R9158 and RA on the growth of NB4 cells (
±s,n=6)图 3 R9158及RA对NB4细胞软琼脂克隆形成率的影响
Fig 3 Effect of R9158 and RA on clonogenicity of NB4 cells in soft agar assay
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1 000 alive cells were seeded per dish and the cells were cultured in the indicated concentration for 14 days in 37℃ with 5% CO2
R9158对NB4细胞NBT还原能力的影响 用浓度为10-6mol/L R9158及RA分别处理NB4细胞，可见随作用时间延长，NBT阳性率明显增高，作用6 d时NBT阳性率分别达到97.5%(R9158)及95%(RA)(图4)。用不同浓度(10-10～10-5 mol/L)的R9158及RA处理NB4细胞4 d，可见随浓度增加，NBT还原反应阳性率也增加。R9158及RA使NB4细胞NBT阳性的ED50分别为2.8×10-9及3.9×10-9 mol/L。
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图 4 R9158及RA对NB4细胞NBT还原能力的影响
Fig 4 NBT reduction activity of NB4 cells induced by R9158 and RA in the indicated concentration (
±s,n=6)R9158对NB4细胞形态的影响 用10-6 mol/L R9158及RA处理NB4细胞2 d就可见核缩小，核浆比例缩小；作用至6 d时，可见核明显缩小，染色浅淡，核仁消失，核呈肾形、马蹄形、杆状及分叶状等，胞浆出现嗜酸性颗粒并有明显空泡化。表明R9158及RA可诱导NB4细胞向粒系方向成熟分化，但大部分细胞仍处在中幼及晚幼粒细胞阶段，分叶核少见。R9158处理的NB4细胞胞浆空泡化等退行性变强于RA(图5，附表)。
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图 5 NB4细胞在10-6 mol/L R9158及RA处理4～6 d时的形态变化
Fig 5 Morphological changes of NB4 cells treated with 10-6 mol/L R9158 and RA for 4 or 6 days
A: control cells; B: cells treated with RA for 6 days; C:cells treated with R9158 for 4 days; D:cells treated with R9158 for 6 days Wright-Giemsa stain
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附表 R9158及RA(10-6 mol/L)对NB4细胞形态的影响
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Table Effect of R9158 and RA(10-6 mol/L) on the morphology of NB4 cells
(exposure time) t/d
Group
Myeloid cell type% of total cells
Promyelo
Myelo
Metamyelo
Banded andsegmented
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92
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R9158
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R9158对NB4细胞染色体的影响 用浓度为10-6 mol/L R9158及RA处理NB4细胞3～6 d后，常规制备染色体及G显带，结果发现对照组NB4细胞染色体呈亚四倍体型，染色体数目在71～99条之间；G显带表明具有明显的t(15;17)易位特征。用R9158及RA处理3～6 d，可使染色体非整倍体数目下降，对照组为80.85±7.1，R9158组为72.96±6.9(51～81)，RA组为68.5±7.0(49～78)，R9158及RA组与对照组相比差异有非常显著意义(P<0.01)，但其典型的t(15；17)易位未见消失(图6)。
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图 6 NB4细胞的核型
Fig 6 A karyotype of NB4 cell line (G-bands)
A: A karyotype of NB4 cell line (arrows indicate the rearranged chromosomes)
B: Comparison among Giemsa stained (G-bands) chromosomes 15,17 of control,RA and R9158 treated NB4 cells
3 讨论
1988年Dalton等[10]发现经典的HL-60细胞不具有急性早幼粒白血病(APL)的特征性染色体t(15；17)易位现象，按FAB分型属M2型。1991年Lanotte等[11]建立了具有典型APL特征并可被诱导向成熟分化的NB4细胞系。本实验发现本所合成的第三代新维甲类化合物R9158对NB4细胞具有很强的生长抑制作用，特别对肿瘤干细胞的克隆形成率具有明显抑制作用，高浓度(10-6 mol/L)R9158几乎可完全抑制NB4细胞的克隆生长，且其作用强于RA。R9158的这种特征有利于克服RA治疗APL时出现高白细胞血症及残留白血病干细胞引起白血病复发等问题。NBT还原能力增强是NB4细胞向成熟分化的一个标志。R9158处理NB4细胞2 d，NBT还原能力便明显改善，处理6 d可使绝大部分细胞(97.5%)呈NBT阳性；但形态观察发现R9158及RA诱导6 d后细胞分化并不完全，大部分细胞处于中幼及晚幼粒细胞阶段，成熟的杆状及分叶核细胞少见，且细胞浆出现空泡化等退行性变。提示R9158及RA诱导细胞分化可能有其他作用机制参与，如PCD等(未发表资料)。染色体分析发现，NB4细胞染色体数目呈亚四倍体，在71～99之间，与Lanotte[11]报道(68～90)相近。用R9158及RA处理后恶性白血病NB4细胞的多倍体染色体数目向二倍体趋近。染色体G显带发现NB4细胞具有APL的典型t(15；17)易位，用R9158及RA处理6 d这种易位未见消失。曾有文献报道，用RA治疗APL患者45 d可使染色体异常恢复正常；灵敏的RT-PCR检查表明，由t(15；17)易位可造成PML-RARα融合基因，后者在完全缓解期可消失[12]。本实验在体外诱导NB4细胞分化后染色体数目未完全恢复，t(15;17)易位仍然存在，这是否由于在体外诱导6 d，分化并不彻底，或是在整体条件下还有别的机制参与修复染色体数目及结构上的改变，或是染色体结构改变根本就不可逆转，均有待进一步研究证实。
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Induction Differentiation by a New Third Generation Retinoid R9158on Human Acute Promyelocytic Leukemia Cell Line,NB4
He Xiaoqing Han Rui
(Institute of Materia Medica,CAMS and PUMC,Beijing 100050)
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Objective In order to investigate the differentiation of 3′，5′-ditertiary-butiary-4′-methoxy-carboxyl chalcone (R9158) on the acute promyelocytic leukemia NB4 cells. Methods By inditifying the function,morphology and karyotype of NB4 cells induced by R9158. Results Our results showed that R9158 or all-trans retinoic acid(RA) significantly inhibited the growth and colony formation of acute promyelocytic leukemia NB4 cells,while NBT-reduction (a functional differentiation marker of granulocytic) was dramatically increased when the cells were exposed to R9158 at 10-9～10-6 mol/L,and the NBT positive cells reached about 97.5% at 10-6 mol/L after 6 days expouse.The ED50 of NBT-reduction was achieved at concentration of 3.9×10-9 mol/L and 2.8×10-9 mol/L for R9158 and RA,respectively.Morphologically,most of the cells induced by R9158 and RA at 10-6 mol/L were in the myelocytic or metamyelocytic stage and a few cells were in the banded or segmented stage.Cytogenetic analysis revealed that the karyotype of NB4 cells was subtetraploid and the chromosome numbers were in the range of 71～99,when NB4 cells were treated with R9158 or RA for 3～6 days,the abnormal polyploid chormosome numbers decreased to 72.9±6.9 (P<0.01) or 68.5±7.0 (P<0.01),but the t(15;17) translation did not disappear. Conclusions R9158 has significant effects on the differentiation of NB4 cells.
Key words retinoid;cell differentiation;leukemia NB4 cell line
(1996-03-18 收稿), http://www.100md.com