细管无胶筛分电泳在苯丙氨酸羟化酶基因短串联重复序列分析及苯丙酮尿症基因诊断中的应用△
作者：许 琪 宋 昉* 韩富天** 林炳承** 沈 岩 吴冠芸
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005
关键词：毛细管电泳；苯丙酮尿症；短串联重复序列；聚合酶链反应；产前诊断
摘要 目的 应用毛细管无胶筛分电泳技术分析苯丙氨酸羟化酶基因内含子3中四核苷酸 摘要 目的 应用毛细管无胶筛分电泳技术分析苯丙氨酸羟化酶基因内含子3中四核苷酸(TCTA)重复序列的多态性。 方法 通过毛细管无胶筛分电泳分离分析特异PCR产物。 结果 在61个正常中国人和6个苯丙酮尿症家系中共检测到从224 bp到260 bp连续分布的10种等位基因片段，多态信息量为0.738。其中260 bp等位片段是第1次在中国人群中被检测到。用这一检测方法对6个苯丙酮尿症家系进行基因型分析，并完成了1例产前基因诊断。 结论 与聚丙烯酰胺变性凝胶电泳相比，毛细管电泳具有准确、快速、自动化和高分辨等优点。毛细管电泳技术与PCR技术的结合在遗传病基因诊断方面具有广泛的应用前景。
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中图号 R394.3 Q75
苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)是一种较常见的常染色体隐性遗传病，在我国发病率为1/16 000[1]。PKU患儿因肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)缺陷，使苯丙氨酸在体内代谢紊乱，影响脑组织发育，而导致患儿严重智力障碍。对于大多数患儿即使采取及时正规的饮食疗法，效果也不尽人意，因此许多家长要求进行产前诊断[2]。人类基因组中的短串联重复序列(short tandem repeats, STR)具有高度的多态性。STR作为第2代遗传标记，已被越来越多地应用于基因连锁分析中[3]。Goltsov等[4]于1993年首先发现了PAH基因内含子3中(TCTA)n短串联重复序列的多态性及其在PKU基因诊断中的价值。目前国内检测STR最常用的方法是通过聚丙烯酰胺变性胶电泳分离PCR扩增片段，然后进行银染。这种方法凭目测判断结果，有一定的主观性，当出现“微笑条带”、“鬼带”时，容易引起失误。因此，本工作选用分辨率高、重复性好、且快速自动检测的方法——毛细管电泳技术，分析61例中国人PAH基因内(TCTA)nSTR长度的多态性，对6个PKU家系进行基因连锁分析，包括1例风险胎儿的出生前基因诊断。
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1 材料和方法
样品来源 61例中国人无关个体随机取自健康人群，6个PKU家系及产前基因诊断样品来自首都儿科研究所。分别取对象静脉血，低渗溶血法分离白细胞，蛋白酶K消化，苯酚、氯仿法提取DNA。胎儿绒毛组织直接经蛋白酶消化后，苯酚、氯仿法提取DNA。
方法 寡核苷酸引物：特异扩增人12号染色体上苯丙氨酸羟化酶基因内含子3中(TCTA)n短串联重复序列的引物，由贝克曼Oligo 1 000 DNA合成仪合成，其序列分别为：5′-GCC AGA ACA ACT ACT GGT TC-3′和5′-AAT CAT AAG TGT TCC CAG AC-3′。
PCR反应条件：反应总体积为40 μl,反应体系中含4 μl 10×缓冲液，25 μmol dNTP(GmbH, 德国)，引物各20 pmol,Taq DNA聚合酶2.5 U(Sangon, 加拿大)，及0.1 μg模板DNA。反应条件为94℃预变性5 min； 94℃， 1 min→55℃，1 min→72℃，1 min 15 sec, 35个循环；然后72℃延伸5 min(DNA热循环仪，Perkin-Elmer公司，美国)。
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PCR扩增产物的纯化：40 μl PCR产物过Sephadex G-50柱(中颗粒，Pharmacia,柱高2 cm)，20℃，3 000r/min,离心2 min脱盐。
内标：毛细管电泳时取2 μl脱盐的PCR产物，加入 2 μl已知244/244 bp长度的PCR扩增片段作为内标记。
毛细管电泳：在Bio Focus 3 000型毛细管电泳仪(Bio-Rad公司，美国)上进行。所用毛细管为聚丙烯酰胺涂渍石英毛细管柱(30 cm×50 μm i.d.,有效分离长度为25.5 cm,大连化学物理研究所)，分离缓冲液含羟丙基甲基纤维素、7 mol/L尿素和 TBE(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L 硼酸， 2 mmol/L EDTA, 大连化学物理研究所)。电泳条件为 10 kV×10 s电进样，样品在25℃，恒压4 kV(电流5.2 μA)，极性“-→+”运行，于波长260 nm下检测，由Bio Focus 3 000软件记录，经Specta软件(Bio-Rad公司，美国)对数据进行分析处理。
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2 结果
中国人群体PAH基因内含子3中STR的多态性 在61例中国人无关个体和6个PKU家系的PAH基因中共检出10种STR等位基因，PCR扩增产物的长度在224 bp～260 bp之间(表1)。各等位基因的毛细管电泳图谱见图1。在所分析的146个无遗传关系的PAH基因中，244 bp等位基因出现的频率最高，达到42.5%。该STR提供的多态信息量(polymorphism informative contents, PIC)为0.738。
PAH基因STR纯合子及杂合子的频率 在包括61例无关个体和6个PKU家系在内的80个中国人群体中，共检测出20种基因型，其中PAH基因杂合子出现的频率为75%(表2)。
利用PAH基因STR多态性对5个PKU家系进行基因连锁分析 5个PKU家系中共见到6种STR等位基因、7种基因型(图2)。其中家系1与家系2的父母均为PAH基因STR杂合子，根据患儿的基因型可以100%确认其父母的致病基因。家系3与家系4的父母一方为STR杂合子，一方为纯合子，根据患儿的基因型只可确认父母为杂合子一方的致病基因。家系5的父母均为STR纯合子，无法进行基因连锁分析。
, 百拇医药
图 1 中国人群体PAH基因内含子3中STR片段的毛细管电泳图谱
Fig 1 Capillary electropherogram of STR within intron 3 of PAH gene in Chinese population A 244 bp fragment was used as inner standard in each electropherogram
表 1 中国人群PAH基因内含子3中STR等位基因的分布频率
Table 1 Frequencies of the PAH gene STR alleles in Chinese population
STR allele
224 bp
, 百拇医药
228 bp
232 bp
236 bp
240 bp
244 bp
248 bp
252 bp
256 bp
260 bp
Total
Number
1
3
, 百拇医药
5
11
32
62
23
5
1
3
146
Frequency(%)
0.69
2.05
3.42
, http://www.100md.com
7.54
21.92
42.47
15.75
3.42
0.69
2.05
100
表 2 80个中国人PAH基因(TCTA)nSTR的基因型
Table 2 Genotype of PAH STR of 80 Chinese people
Genotype
, 百拇医药
Number
Frequency(%)
Homozygosity
20
25
244/244 bp
12
15
248/248 bp
4
5
240/240 bp
, http://www.100md.com 3
3.7
236/236 bp
1
1.3
Hetrozygosity
60
75
240/244 bp
17
21.2
244/248 bp
15
, 百拇医药
18.8
232/244 bp
5
6.3
236/244 bp
4
5
228/240 bp
3
3.8
244/260 bp
2
2.5
, 百拇医药
236/240 bp
2
2.5
240/248 bp
2
2.5
240/252 bp
2
2.5
236/252 bp
2
2.5
224/244 bp
, http://www.100md.com
1
1.25
228/244 bp
1
1.25
244/252 bp
1
1.25
244/256 bp
1
1.25
236/260 bp
1
, http://www.100md.com
1.25
224/240 bp
1
1.25
图 2 5个苯丙酮尿症家系的遗传图谱和基因型
Fig 2 Pedigree and genotype of five families with phenylketonuria
■●：phenylketonuria patients;
： carriers; The underlined based pairs are difinable pathogenic genes
, 百拇医药
利用PAH基因STR多态性进行1例PKU风险胎儿的出生前基因诊断 根据先证者(Ⅱ-1)的基因型(224/240 bp)可知其父亲(Ⅰ-1，基因型224/244 bp)224 bp所在的基因为致病基因，244 bp所在基因为正常基因。由于母亲(Ⅰ-2)为STR纯合子(240/240 bp)，无法明确胎儿(Ⅱ-2，基因型240/244 bp)遗传了母亲的哪一条染色体。但可知胎儿遗传了一条来自父亲正常PAH基因(244 bp)的染色体。因此，胎儿可能为正常或携带者，一定不会是患者(图3)。此诊断在婴儿出生后得到验证。
3 讨论
国内外已有若干关于PAH基因内含子3中(TCTA)n多态性在白种人及不同中国人群中分布频率的报告[4～7]，我们将本次实验结果和以往国内外文献报道进行综合分析(表3)。
表3 中国人与高加索人群体PAH基因内含子3中STR的等位基因分布频率的比较
, 百拇医药
Table 3 Frequencies of PAH STR alleles in Chinese and European Caucasion
Allele
Chinese
Caucasion
frequency
Analyzed
Ref.5
Ref.6
Ref.7
Total
Ref.6
, http://www.100md.com
frequency
(%)
(N)
(N)
(N)
(N)
(N)
(N)
(%)
224 bp
1
0
0
, 百拇医药
2
3
0.55
0
0
228 bp
3
3
4
7
17
3.10
6
1.84
, 百拇医药
232 bp
5
8
6
11
30
5.46
26
7.97
236 bp
11
4
2
, http://www.100md.com 9
26
4.73
35
10.74
240 bp
32
30
24
57
143
26.05
111
, 百拇医药 34.05
244 bp
62
63
27
80
232
42.26
96
29.45
248 bp
23
25
, http://www.100md.com
7
23
78
14.20
31
9.51
252 bp
5
3
0
6
14
2.55
, 百拇医药 16
4.91
256 bp
1
0
1
1
3
0.55
3
0.92
260 bp
3
0
, http://www.100md.com
0
0
3
0.55
2
0.61
Total
146
136
71
196
549
100
, 百拇医药 326
100
PIC
0.726
0.768
本工作在中国人群中检出了以往有关文献报道过的所有10种等位基因。比黄尚志等[5]对中国北方36个无关个体中该STR等位基因的分析结果多检出224 bp、256 bp和260 bp 3种等位基因，比Eisensmith等[6]对北京地区19个PKU家系的分析结果多检出224 bp、252 bp和260 bp 3种等位基因，比宋昉等[7]结果多检出260 bp等位基因，比高加索人[6]多检出224 bp等位基因。其中260 bp是第一次在中国人群中检出，这可能是由于256 bp与260 bp片段已非聚丙烯酰胺变性胶电泳的最适分离范围，而且260 bp等位基因的出现频率较低，因而易与256 bp等位基因混淆。毛细管电泳因其所具有的高分辨率而将全部等位基因均明确分离。有鉴于此，本工作利用毛细管电泳对以往使用“聚丙烯酰胺变性胶电泳结合银染”技术确定STR的部分标本进行了重新检测，发现其中两例样品的结果有误。分别将244 bp/244 bp和 244 bp/240 bp基因型误诊为248 bp/248 bp和248 bp/248 bp基因型，偏差4～8 bp。这其中既有电泳的问题，也有对电泳结果判读的问题。经过掺入不同内标反复验证，毛细管电泳的检测结果全部正确。表明毛细管电泳的判断比聚丙烯酰胺变性胶电泳更客观、准确和可靠。
, 百拇医药
通过对中国人与高加索人PAH基因内STR分布频率的比较，发现中国人群中出现频率最高的是244 bp等位基因，占42.26%；而高加索人群中240 bp等位基因所占的比例最大，为34.05%，且未发现224 bp等位基因，这些差异可能与种族有关。综合表3数据分析，中国人群中PAH基因内含子 3中(TCTA)n STR位点的多态信息量(polymorphism informative contents, PIC)高达0.726，比应用ASO探针直接检测基因点突变的诊断率(70%)还高。提示PAH基因中(TCTA)n重复序列在PKU基因诊断方面具有很高的应用价值。
图 3 利用PAH基因中STR进行产前诊断的家系
, 百拇医药 Fig 3 Prenatal diagnosis in a PKU family by PAH gene STR 、A： pedigree & genotype. ●: PKU patients;：carriers; :fetal
B： capillary electropherogram. A 244 bp fragment was used as internal standard in each electropherogram
本工作采用的毛细管无胶筛分电泳系统较聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳操作的自动化程度高，同时又达到了重复性好、结果可靠和1.5%(4 bp/260 bp)的高分辨率。这使得毛细管电泳结合PCR(STR)技术在基因连锁分析和DNA诊断方面具有了更加广阔的应用前景。
, 百拇医药
△美国中华医学基金(CMB，95-617)资助；*首都儿科研究所，北京10020；**中国科学院化学物理研究所
参 考 文 献
1 11省市苯丙酮尿症筛查协作组.我国11省市苯丙酮尿症新生儿筛查.中华儿科杂志，1985，23(6)：321～324
2 Scriver CR, Clow CL. Avoiding phenylketonuria: why parents seek prenatal diagnosis. J Pediatr, 1988, 113:495～498
3 唐学明，杜传书.数目可变的串联重复序列(VNTR)的研究方法进展.国外医学遗传学分册，1994，17(3)：120～122
, 百拇医药 4 Goltsov AA, Eisensmith RC, Naughton E, et al. A single polymorphic STR system in the human phenylalanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screening for phenylketonuria. Hum Mol Genet, 1993, 2:577～581
5 黄尚志，方炳良，初海鹰，等.苯丙氨酸羟化酶基因内短串联重复序列多态性的分析及应用.中华医学杂志，1995，75(1)：22～24
6 Eisensmith RC, Goltsov AA, Woo SLC. A simple, rapid, and highly information PCR-based procedure for prenatal diagnosis and carrier screening of phenylkatonuria. Prenat Diag, 1994, 14:1113～1118
, 百拇医药
7 宋 昉，吴冠芸，徐光芝，等.苯丙酮尿症突变分析和产前诊断.中华医学遗传学杂志，1997，12(6)：321～323
Application of Capillary Non-gel Sieving Electrophoresis to the Analysis of Short Tandem Repeat in Phenylalanine Hydroxylase Gene and Gene Diagnosis of Phenylketonuria
Xu Qi Song Fang Han Futian Lin Bingcheng Shen Yan, et al
(National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical
, 百拇医药 Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To establish a sensitive, accurate and reliable method for analysis of short tandem repeat (STR) markers for gene diagnosis, capillary electrophoresis (CE) was used for analysis of a polymorphic tetranucleotide (TCTA)n in intron 3 of the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene. Methods Capillary non-gel sieving electrophoresis (CNGSE) system was used to analyze PCR products of PAH STR among 61 normal Chinese individuals and 6 phenylketonuria (PKU) families. Results The PCR fragments that differ 4 bp from each other were well separated by CNGSE. Ten alleles were identified, with a continuous distribution from 224 bp to 260 bp. The largest allele (260 bp) was first detected in Chinese population. The alleles frequencies were caculated and PIC is 0.738. The genotypes of PAH STR of total 80 Chinese people were also analyzed and the heterozygosity is 75%. We used this procedure to PAH gene linkage analysis in 6 PKU families, in which pathogenic gene could be affirmed in 3 families, including one case of prenatal diagnosis. Conclusions In comparison with denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, CE is an accurate, rapid, automatic and with high resolution analytical tool. CE in combination with PCR is a hopeful technique and might be widely used for gene diagnosis of genetic diseases in the future.
Key words capillary electrophoresis; phenylketonuria; short tandem repeat; polymerase chain reaction; prenatal diagnosis
(1997-11-05 收稿), http://www.100md.com(许 琪 宋 昉* 韩富天** 林炳承** 沈 岩 吴冠芸)
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005
关键词：毛细管电泳；苯丙酮尿症；短串联重复序列；聚合酶链反应；产前诊断
摘要 目的 应用毛细管无胶筛分电泳技术分析苯丙氨酸羟化酶基因内含子3中四核苷酸 摘要 目的 应用毛细管无胶筛分电泳技术分析苯丙氨酸羟化酶基因内含子3中四核苷酸(TCTA)重复序列的多态性。 方法 通过毛细管无胶筛分电泳分离分析特异PCR产物。 结果 在61个正常中国人和6个苯丙酮尿症家系中共检测到从224 bp到260 bp连续分布的10种等位基因片段，多态信息量为0.738。其中260 bp等位片段是第1次在中国人群中被检测到。用这一检测方法对6个苯丙酮尿症家系进行基因型分析，并完成了1例产前基因诊断。 结论 与聚丙烯酰胺变性凝胶电泳相比，毛细管电泳具有准确、快速、自动化和高分辨等优点。毛细管电泳技术与PCR技术的结合在遗传病基因诊断方面具有广泛的应用前景。
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中图号 R394.3 Q75
苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)是一种较常见的常染色体隐性遗传病，在我国发病率为1/16 000[1]。PKU患儿因肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)缺陷，使苯丙氨酸在体内代谢紊乱，影响脑组织发育，而导致患儿严重智力障碍。对于大多数患儿即使采取及时正规的饮食疗法，效果也不尽人意，因此许多家长要求进行产前诊断[2]。人类基因组中的短串联重复序列(short tandem repeats, STR)具有高度的多态性。STR作为第2代遗传标记，已被越来越多地应用于基因连锁分析中[3]。Goltsov等[4]于1993年首先发现了PAH基因内含子3中(TCTA)n短串联重复序列的多态性及其在PKU基因诊断中的价值。目前国内检测STR最常用的方法是通过聚丙烯酰胺变性胶电泳分离PCR扩增片段，然后进行银染。这种方法凭目测判断结果，有一定的主观性，当出现“微笑条带”、“鬼带”时，容易引起失误。因此，本工作选用分辨率高、重复性好、且快速自动检测的方法——毛细管电泳技术，分析61例中国人PAH基因内(TCTA)nSTR长度的多态性，对6个PKU家系进行基因连锁分析，包括1例风险胎儿的出生前基因诊断。
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1 材料和方法
样品来源 61例中国人无关个体随机取自健康人群，6个PKU家系及产前基因诊断样品来自首都儿科研究所。分别取对象静脉血，低渗溶血法分离白细胞，蛋白酶K消化，苯酚、氯仿法提取DNA。胎儿绒毛组织直接经蛋白酶消化后，苯酚、氯仿法提取DNA。
方法 寡核苷酸引物：特异扩增人12号染色体上苯丙氨酸羟化酶基因内含子3中(TCTA)n短串联重复序列的引物，由贝克曼Oligo 1 000 DNA合成仪合成，其序列分别为：5′-GCC AGA ACA ACT ACT GGT TC-3′和5′-AAT CAT AAG TGT TCC CAG AC-3′。
PCR反应条件：反应总体积为40 μl,反应体系中含4 μl 10×缓冲液，25 μmol dNTP(GmbH, 德国)，引物各20 pmol,Taq DNA聚合酶2.5 U(Sangon, 加拿大)，及0.1 μg模板DNA。反应条件为94℃预变性5 min； 94℃， 1 min→55℃，1 min→72℃，1 min 15 sec, 35个循环；然后72℃延伸5 min(DNA热循环仪，Perkin-Elmer公司，美国)。
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PCR扩增产物的纯化：40 μl PCR产物过Sephadex G-50柱(中颗粒，Pharmacia,柱高2 cm)，20℃，3 000r/min,离心2 min脱盐。
内标：毛细管电泳时取2 μl脱盐的PCR产物，加入 2 μl已知244/244 bp长度的PCR扩增片段作为内标记。
毛细管电泳：在Bio Focus 3 000型毛细管电泳仪(Bio-Rad公司，美国)上进行。所用毛细管为聚丙烯酰胺涂渍石英毛细管柱(30 cm×50 μm i.d.,有效分离长度为25.5 cm,大连化学物理研究所)，分离缓冲液含羟丙基甲基纤维素、7 mol/L尿素和 TBE(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L 硼酸， 2 mmol/L EDTA, 大连化学物理研究所)。电泳条件为 10 kV×10 s电进样，样品在25℃，恒压4 kV(电流5.2 μA)，极性“-→+”运行，于波长260 nm下检测，由Bio Focus 3 000软件记录，经Specta软件(Bio-Rad公司，美国)对数据进行分析处理。
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2 结果
中国人群体PAH基因内含子3中STR的多态性 在61例中国人无关个体和6个PKU家系的PAH基因中共检出10种STR等位基因，PCR扩增产物的长度在224 bp～260 bp之间(表1)。各等位基因的毛细管电泳图谱见图1。在所分析的146个无遗传关系的PAH基因中，244 bp等位基因出现的频率最高，达到42.5%。该STR提供的多态信息量(polymorphism informative contents, PIC)为0.738。
PAH基因STR纯合子及杂合子的频率 在包括61例无关个体和6个PKU家系在内的80个中国人群体中，共检测出20种基因型，其中PAH基因杂合子出现的频率为75%(表2)。
利用PAH基因STR多态性对5个PKU家系进行基因连锁分析 5个PKU家系中共见到6种STR等位基因、7种基因型(图2)。其中家系1与家系2的父母均为PAH基因STR杂合子，根据患儿的基因型可以100%确认其父母的致病基因。家系3与家系4的父母一方为STR杂合子，一方为纯合子，根据患儿的基因型只可确认父母为杂合子一方的致病基因。家系5的父母均为STR纯合子，无法进行基因连锁分析。
, 百拇医药
图 1 中国人群体PAH基因内含子3中STR片段的毛细管电泳图谱
Fig 1 Capillary electropherogram of STR within intron 3 of PAH gene in Chinese population A 244 bp fragment was used as inner standard in each electropherogram
表 1 中国人群PAH基因内含子3中STR等位基因的分布频率
Table 1 Frequencies of the PAH gene STR alleles in Chinese population
STR allele
224 bp
, 百拇医药
228 bp
232 bp
236 bp
240 bp
244 bp
248 bp
252 bp
256 bp
260 bp
Total
Number
1
3
, 百拇医药
5
11
32
62
23
5
1
3
146
Frequency(%)
0.69
2.05
3.42
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7.54
21.92
42.47
15.75
3.42
0.69
2.05
100
表 2 80个中国人PAH基因(TCTA)nSTR的基因型
Table 2 Genotype of PAH STR of 80 Chinese people
Genotype
, 百拇医药
Number
Frequency(%)
Homozygosity
20
25
244/244 bp
12
15
248/248 bp
4
5
240/240 bp
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3.7
236/236 bp
1
1.3
Hetrozygosity
60
75
240/244 bp
17
21.2
244/248 bp
15
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18.8
232/244 bp
5
6.3
236/244 bp
4
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3
3.8
244/260 bp
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2.5
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236/240 bp
2
2.5
240/248 bp
2
2.5
240/252 bp
2
2.5
236/252 bp
2
2.5
224/244 bp
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1
1.25
228/244 bp
1
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244/252 bp
1
1.25
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1
1.25
236/260 bp
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1.25
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1
1.25
图 2 5个苯丙酮尿症家系的遗传图谱和基因型
Fig 2 Pedigree and genotype of five families with phenylketonuria
■●：phenylketonuria patients;
： carriers; The underlined based pairs are difinable pathogenic genes, 百拇医药
利用PAH基因STR多态性进行1例PKU风险胎儿的出生前基因诊断 根据先证者(Ⅱ-1)的基因型(224/240 bp)可知其父亲(Ⅰ-1，基因型224/244 bp)224 bp所在的基因为致病基因，244 bp所在基因为正常基因。由于母亲(Ⅰ-2)为STR纯合子(240/240 bp)，无法明确胎儿(Ⅱ-2，基因型240/244 bp)遗传了母亲的哪一条染色体。但可知胎儿遗传了一条来自父亲正常PAH基因(244 bp)的染色体。因此，胎儿可能为正常或携带者，一定不会是患者(图3)。此诊断在婴儿出生后得到验证。
3 讨论
国内外已有若干关于PAH基因内含子3中(TCTA)n多态性在白种人及不同中国人群中分布频率的报告[4～7]，我们将本次实验结果和以往国内外文献报道进行综合分析(表3)。
表3 中国人与高加索人群体PAH基因内含子3中STR的等位基因分布频率的比较
, 百拇医药
Table 3 Frequencies of PAH STR alleles in Chinese and European Caucasion
Allele
Chinese
Caucasion
frequency
Analyzed
Ref.5
Ref.6
Ref.7
Total
Ref.6
, http://www.100md.com
frequency
(%)
(N)
(N)
(N)
(N)
(N)
(N)
(%)
224 bp
1
0
0
, 百拇医药
2
3
0.55
0
0
228 bp
3
3
4
7
17
3.10
6
1.84
, 百拇医药
232 bp
5
8
6
11
30
5.46
26
7.97
236 bp
11
4
2
, http://www.100md.com 9
26
4.73
35
10.74
240 bp
32
30
24
57
143
26.05
111
, 百拇医药 34.05
244 bp
62
63
27
80
232
42.26
96
29.45
248 bp
23
25
, http://www.100md.com
7
23
78
14.20
31
9.51
252 bp
5
3
0
6
14
2.55
, 百拇医药 16
4.91
256 bp
1
0
1
1
3
0.55
3
0.92
260 bp
3
0
, http://www.100md.com
0
0
3
0.55
2
0.61
Total
146
136
71
196
549
100
, 百拇医药 326
100
PIC
0.726
0.768
本工作在中国人群中检出了以往有关文献报道过的所有10种等位基因。比黄尚志等[5]对中国北方36个无关个体中该STR等位基因的分析结果多检出224 bp、256 bp和260 bp 3种等位基因，比Eisensmith等[6]对北京地区19个PKU家系的分析结果多检出224 bp、252 bp和260 bp 3种等位基因，比宋昉等[7]结果多检出260 bp等位基因，比高加索人[6]多检出224 bp等位基因。其中260 bp是第一次在中国人群中检出，这可能是由于256 bp与260 bp片段已非聚丙烯酰胺变性胶电泳的最适分离范围，而且260 bp等位基因的出现频率较低，因而易与256 bp等位基因混淆。毛细管电泳因其所具有的高分辨率而将全部等位基因均明确分离。有鉴于此，本工作利用毛细管电泳对以往使用“聚丙烯酰胺变性胶电泳结合银染”技术确定STR的部分标本进行了重新检测，发现其中两例样品的结果有误。分别将244 bp/244 bp和 244 bp/240 bp基因型误诊为248 bp/248 bp和248 bp/248 bp基因型，偏差4～8 bp。这其中既有电泳的问题，也有对电泳结果判读的问题。经过掺入不同内标反复验证，毛细管电泳的检测结果全部正确。表明毛细管电泳的判断比聚丙烯酰胺变性胶电泳更客观、准确和可靠。
, 百拇医药
通过对中国人与高加索人PAH基因内STR分布频率的比较，发现中国人群中出现频率最高的是244 bp等位基因，占42.26%；而高加索人群中240 bp等位基因所占的比例最大，为34.05%，且未发现224 bp等位基因，这些差异可能与种族有关。综合表3数据分析，中国人群中PAH基因内含子 3中(TCTA)n STR位点的多态信息量(polymorphism informative contents, PIC)高达0.726，比应用ASO探针直接检测基因点突变的诊断率(70%)还高。提示PAH基因中(TCTA)n重复序列在PKU基因诊断方面具有很高的应用价值。
图 3 利用PAH基因中STR进行产前诊断的家系
, 百拇医药 Fig 3 Prenatal diagnosis in a PKU family by PAH gene STR 、A： pedigree & genotype. ●: PKU patients;
：carriers; :fetalB： capillary electropherogram. A 244 bp fragment was used as internal standard in each electropherogram
本工作采用的毛细管无胶筛分电泳系统较聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳操作的自动化程度高，同时又达到了重复性好、结果可靠和1.5%(4 bp/260 bp)的高分辨率。这使得毛细管电泳结合PCR(STR)技术在基因连锁分析和DNA诊断方面具有了更加广阔的应用前景。
, 百拇医药
△美国中华医学基金(CMB，95-617)资助；*首都儿科研究所，北京10020；**中国科学院化学物理研究所
参 考 文 献
1 11省市苯丙酮尿症筛查协作组.我国11省市苯丙酮尿症新生儿筛查.中华儿科杂志，1985，23(6)：321～324
2 Scriver CR, Clow CL. Avoiding phenylketonuria: why parents seek prenatal diagnosis. J Pediatr, 1988, 113:495～498
3 唐学明，杜传书.数目可变的串联重复序列(VNTR)的研究方法进展.国外医学遗传学分册，1994，17(3)：120～122
, 百拇医药 4 Goltsov AA, Eisensmith RC, Naughton E, et al. A single polymorphic STR system in the human phenylalanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screening for phenylketonuria. Hum Mol Genet, 1993, 2:577～581
5 黄尚志，方炳良，初海鹰，等.苯丙氨酸羟化酶基因内短串联重复序列多态性的分析及应用.中华医学杂志，1995，75(1)：22～24
6 Eisensmith RC, Goltsov AA, Woo SLC. A simple, rapid, and highly information PCR-based procedure for prenatal diagnosis and carrier screening of phenylkatonuria. Prenat Diag, 1994, 14:1113～1118
, 百拇医药
7 宋 昉，吴冠芸，徐光芝，等.苯丙酮尿症突变分析和产前诊断.中华医学遗传学杂志，1997，12(6)：321～323
Application of Capillary Non-gel Sieving Electrophoresis to the Analysis of Short Tandem Repeat in Phenylalanine Hydroxylase Gene and Gene Diagnosis of Phenylketonuria
Xu Qi Song Fang Han Futian Lin Bingcheng Shen Yan, et al
(National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical
, 百拇医药 Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To establish a sensitive, accurate and reliable method for analysis of short tandem repeat (STR) markers for gene diagnosis, capillary electrophoresis (CE) was used for analysis of a polymorphic tetranucleotide (TCTA)n in intron 3 of the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene. Methods Capillary non-gel sieving electrophoresis (CNGSE) system was used to analyze PCR products of PAH STR among 61 normal Chinese individuals and 6 phenylketonuria (PKU) families. Results The PCR fragments that differ 4 bp from each other were well separated by CNGSE. Ten alleles were identified, with a continuous distribution from 224 bp to 260 bp. The largest allele (260 bp) was first detected in Chinese population. The alleles frequencies were caculated and PIC is 0.738. The genotypes of PAH STR of total 80 Chinese people were also analyzed and the heterozygosity is 75%. We used this procedure to PAH gene linkage analysis in 6 PKU families, in which pathogenic gene could be affirmed in 3 families, including one case of prenatal diagnosis. Conclusions In comparison with denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, CE is an accurate, rapid, automatic and with high resolution analytical tool. CE in combination with PCR is a hopeful technique and might be widely used for gene diagnosis of genetic diseases in the future.
Key words capillary electrophoresis; phenylketonuria; short tandem repeat; polymerase chain reaction; prenatal diagnosis
(1997-11-05 收稿), http://www.100md.com(许 琪 宋 昉* 韩富天** 林炳承** 沈 岩 吴冠芸)