人类红细胞酯酶D的多态性检测与分析
作者：张吉生
单位：张吉生(湖北省咸宁市咸安区人民检察院技术科，咸宁 437000)
关键词：
咸宁医学院学报000228 中图分类号 R446.11+9 文献标识码 B
文章编号 1008-0635(2000)02-0136-02
本文使用改良的非平衡pH梯度电泳技术对咸宁地区200名汉人酯酶D(EsD)多态性进行检测，旨在建立一种简明、实用、经济的检测方法，为进一步提高EsD在法医学中的运用价值而提供参考数据。
1 材料和方法
1.1样品处理
, 百拇医药
取抗凝静脉血1.0ml用生理盐水洗三次，每次2000rpm/5min，取压积红细胞加等量蒸溜水混匀，置-20℃冰箱中过夜，冻融后高速离心20000rpm/15min，取上清液一滴加等量0.05M DTT液作用15min后电泳。
1.2 主要试剂
两性电解质pH4～6.5 40%。丙烯酰胺氯仿重结晶。N*N'-亚甲基双丙烯酰胺，化学纯，丙酮重结晶。过硫酸铵，优极纯。蔗糖，分析纯。四甲基乙二胺，分析纯。二硫基苏糖醇(DTT)。4-甲基伞形酮醋酸盐。
1.3 主要仪器
LKB-2197三恒电源。LKB-2219MultitmpⅡ型冷却水循环机。LKB-2117MultitmpⅡ型多功能电泳槽。
1.4 方法
, 百拇医药
1.4.1 凝胶规格
胶板大小100mm×70mm×0.3mm。聚丙烯酰胺凝胶总浓度T5.5%，交联度C4.5%，两性电解质浓度3%，蔗糖12.3%。
1.4.2 点样
用加样滤纸(5mm×5mm)蘸取处理好样品约10μl贴在胶板上离负极端1.5cm处。
1.4.3 电泳
正极液：1M H3PO4，负极液：0.2N NaOH，电极间距7cm，循环水温4℃，250V预聚焦8分钟，加样后调至500V，电流不限，电泳10min，去样后，再将电压调至1000V电泳40min。
1.4.4 显色
, http://www.100md.com
取2mg 4-甲基伞形酮醋酸盐，加丙酮一滴助溶后，再加醋酸缓冲液(pH5.2)5.0ml混匀，湿润大小为10cm×7cm的滤纸一张，复盖凝胶表面，37℃孵化3～5min，置长波紫外灯下观察结果。
2 结 果
在200例血样检测中，除EsD三种普通型外，还发现了EsD7-1和EsD7-2型。
200例EsD的表现型和基因频率见表1。上述结果，经遗传平衡吻合度检验，各表现型观察值与期望值之间无显著性差异，符合Hardy-Weinberg平衡定律，并依据有关公式算出非父排除率EPP为0.1944，鉴别机率为0.6390。
表1 EsD的表现型和基因频率 表现型
观察值(%)
期望值
, http://www.100md.com
基因频率
EsD1
83(41.5)
83.6
EsD1=0.630
EsD2-1
88(44.0)
87.2
EsD2=0.330
EsD2
24(12.0)
23.7
, http://www.100md.com
EsD7=0.015
EsD7-1
4(2.0)
3.6
EsD7-2
2(1.0)
1.9
df=3，0.9>P>0.75
3 讨 论
3.1EsD的多态性
EsD是一类能够水解羧酸酯键的酶，60年代以来，用红细胞溶血液电泳，共发现4种非特异人红细胞酯酶A、B、C、D，但酯酶A遗传变异罕见，酯酶B没有异体，唯酯酶D具有多态性。
, 百拇医药
EsD多态性表现型是Hopkison等用淀粉凝胶电泳法，以4-甲基伞形酮醋酸盐或丁酸盐为底物进行荧光显影而发现的，其分子量为6000，最适pH为5.0～5.5，其遗传控制是由常染色体等位基因按共显性遗传，到目前为止，已经发现EsD至少有18种等位基因。
用普通电泳法可将EsD基因产物分为EsP1、EsP2-1、EsP2三种表现型，用普通等电聚焦电泳能检出EsD多种基因产物，但对EsD1、EsD2的分离效果极差，因为他们的等电点十分接近。运用超薄聚丙烯酰胺凝胶非平衡pH梯度电泳方法检测EsD，其结果能检出更多的EsD的基因产物，谱带分离更为清晰，还能发现EsD7-1、EsD7-2两型。
3.2 实验方法的改良
本实验采用超薄聚丙烯酰胺凝胶非平衡pH梯度电泳，使用时作了某些修改，节省了试剂，但不影响结果，改变了常规使用时的胶浓度(T7%改为5.5%)和胶联度(C3.3%改为4.5%)，增强了胶的强度，电极间距较原始作了缩短，仅为6.8cm，催化剂改为过硫酸铵，可使胶快速凝聚，加样后低电压，去样后提高电压，大大减轻了谱带的扭曲现象，提高了分辨率。
(本实验得到同济医大法医系的帮助，谨此致谢)
收稿2000-03-27, 百拇医药
单位：张吉生(湖北省咸宁市咸安区人民检察院技术科，咸宁 437000)
关键词：
咸宁医学院学报000228 中图分类号 R446.11+9 文献标识码 B
文章编号 1008-0635(2000)02-0136-02
本文使用改良的非平衡pH梯度电泳技术对咸宁地区200名汉人酯酶D(EsD)多态性进行检测，旨在建立一种简明、实用、经济的检测方法，为进一步提高EsD在法医学中的运用价值而提供参考数据。
1 材料和方法
1.1样品处理
, 百拇医药
取抗凝静脉血1.0ml用生理盐水洗三次，每次2000rpm/5min，取压积红细胞加等量蒸溜水混匀，置-20℃冰箱中过夜，冻融后高速离心20000rpm/15min，取上清液一滴加等量0.05M DTT液作用15min后电泳。
1.2 主要试剂
两性电解质pH4～6.5 40%。丙烯酰胺氯仿重结晶。N*N'-亚甲基双丙烯酰胺，化学纯，丙酮重结晶。过硫酸铵，优极纯。蔗糖，分析纯。四甲基乙二胺，分析纯。二硫基苏糖醇(DTT)。4-甲基伞形酮醋酸盐。
1.3 主要仪器
LKB-2197三恒电源。LKB-2219MultitmpⅡ型冷却水循环机。LKB-2117MultitmpⅡ型多功能电泳槽。
1.4 方法
, 百拇医药
1.4.1 凝胶规格
胶板大小100mm×70mm×0.3mm。聚丙烯酰胺凝胶总浓度T5.5%，交联度C4.5%，两性电解质浓度3%，蔗糖12.3%。
1.4.2 点样
用加样滤纸(5mm×5mm)蘸取处理好样品约10μl贴在胶板上离负极端1.5cm处。
1.4.3 电泳
正极液：1M H3PO4，负极液：0.2N NaOH，电极间距7cm，循环水温4℃，250V预聚焦8分钟，加样后调至500V，电流不限，电泳10min，去样后，再将电压调至1000V电泳40min。
1.4.4 显色
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取2mg 4-甲基伞形酮醋酸盐，加丙酮一滴助溶后，再加醋酸缓冲液(pH5.2)5.0ml混匀，湿润大小为10cm×7cm的滤纸一张，复盖凝胶表面，37℃孵化3～5min，置长波紫外灯下观察结果。
2 结 果
在200例血样检测中，除EsD三种普通型外，还发现了EsD7-1和EsD7-2型。
200例EsD的表现型和基因频率见表1。上述结果，经遗传平衡吻合度检验，各表现型观察值与期望值之间无显著性差异，符合Hardy-Weinberg平衡定律，并依据有关公式算出非父排除率EPP为0.1944，鉴别机率为0.6390。
表1 EsD的表现型和基因频率 表现型
观察值(%)
期望值
, http://www.100md.com
基因频率
EsD1
83(41.5)
83.6
EsD1=0.630
EsD2-1
88(44.0)
87.2
EsD2=0.330
EsD2
24(12.0)
23.7
, http://www.100md.com
EsD7=0.015
EsD7-1
4(2.0)
3.6
EsD7-2
2(1.0)
1.9
df=3，0.9>P>0.75
3 讨 论
3.1EsD的多态性
EsD是一类能够水解羧酸酯键的酶，60年代以来，用红细胞溶血液电泳，共发现4种非特异人红细胞酯酶A、B、C、D，但酯酶A遗传变异罕见，酯酶B没有异体，唯酯酶D具有多态性。
, 百拇医药
EsD多态性表现型是Hopkison等用淀粉凝胶电泳法，以4-甲基伞形酮醋酸盐或丁酸盐为底物进行荧光显影而发现的，其分子量为6000，最适pH为5.0～5.5，其遗传控制是由常染色体等位基因按共显性遗传，到目前为止，已经发现EsD至少有18种等位基因。
用普通电泳法可将EsD基因产物分为EsP1、EsP2-1、EsP2三种表现型，用普通等电聚焦电泳能检出EsD多种基因产物，但对EsD1、EsD2的分离效果极差，因为他们的等电点十分接近。运用超薄聚丙烯酰胺凝胶非平衡pH梯度电泳方法检测EsD，其结果能检出更多的EsD的基因产物，谱带分离更为清晰，还能发现EsD7-1、EsD7-2两型。
3.2 实验方法的改良
本实验采用超薄聚丙烯酰胺凝胶非平衡pH梯度电泳，使用时作了某些修改，节省了试剂，但不影响结果，改变了常规使用时的胶浓度(T7%改为5.5%)和胶联度(C3.3%改为4.5%)，增强了胶的强度，电极间距较原始作了缩短，仅为6.8cm，催化剂改为过硫酸铵，可使胶快速凝聚，加样后低电压，去样后提高电压，大大减轻了谱带的扭曲现象，提高了分辨率。
(本实验得到同济医大法医系的帮助，谨此致谢)
收稿2000-03-27, 百拇医药