实验性外淋巴瘘对内耳形态学的影响
作者：吴立连 梁建伟 曾英 吕红 王显红 董民声
单位：吴立连 梁建伟 曾英 吕红 王显红(咸宁医学院附属第一医院耳鼻咽喉科，咸宁 437100)；董民声(河南医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，郑州 450000)
关键词：外淋巴瘘；圆窗；毛细胞；内耳形态学；扫描电镜
咸宁医学院学报000211 摘 要 目的：建立动物模型观察实验性外淋巴瘘(EPLF)对内耳形态学的影响，为临床治疗外淋巴瘘提供实验性依据。方法：24只豚鼠随机分成6组，每组4只，右耳为对照耳。用微型注射器刺破左耳圆窗膜(RWM)，并抽出2～4μl外淋巴液造成EPLF，分别于造瘘后1、2、4、7、14和28天处死，光镜和电镜下观察内耳形态变化。结果：穿孔的RWM大部分(83%)易于愈合。RWM破裂后2～4天穿孔处组织连接，7～14天基本愈合。扫描电镜观察造瘘后4天有毛细胞损伤，瘘口未愈合耳的耳蜗底回毛细胞明显减少。结论：EPLF转归有二，单一RWM穿孔趋向自然修复愈合，其组织形态学变化可逆；未愈合者或病程大于14天者，内耳形态学存在组织病理学改变，病理改变以及病程可作为手术干预的客观指标。
, http://www.100md.com
中图分类号 R764.3 文献标识码 A
文章编号 1008-0635(2000)02-0110-03
Influence of Experimental Perilymphatic Fistula
on the Inner Ear Morphology
WU Lilian LIANG Jianwei ZENG Ying et al
(Department of otolaryngology,the First Affiliated Hospital,Xianning Medical College,Xianning 437100)
OBSTRACT Objective The influence of experimental perilymphatic fistula (EPLF) on inner ear morphology was investigated to establish an experimental model which could offer a warranty for cinical treatment.Methods 24 guinea pigs were randomly divided into 6 groups of 4 animals each (right ear as a control).EPLF was produced by pricking in the left round window membrane (RWM) of the guinea pig and by suctioning 2～4μl of perilymph fluid with a fine needle,than,the animals were killed on 1,2,4,7,14 and 28 days later,respectively.Morphologic changes of the cochlea were observed under a light and scanning electronic microscope.Results Most of the RWM ruptured were easily healed.The RWM perforation had already closed after 2～4 days and largely healed at 7～14 days.Loss of hair cell was immediately occured with causing fistula.Hair cells in the cochlea's basal turn were significantly decreased,particularly under that perforation still unlealed.Conclusion The pathologically morphologic variation exist in inner ear following EPLF.It can be regarded as a objective indication of surgery and a theoretical basis in clinical treatment when the duration of the window membrane ruptured is more than 7～14days.
, 百拇医药
KWY WORDS Perilymphatic fistula；Round window；Hair cell；Inner ear morphology；SEM
目前国内关于圆窗膜(RWM)破裂致外淋巴瘘(EPLG)引起的突发性耳聋的实验研究报导甚少。本研究通过豚鼠内耳造模，旨在观察实验性外淋巴瘘对耳蜗形态学结构的影响，为临床提供实验性依据。
1 材料与方法
1.1材料
健康豚鼠24只，体重350～450克，雌雄不拘，鼓膜及耳廓反射正常，随机分为1、2、4、7、14和28天组，每组4只，左耳为实验耳，右耳为对照耳。
1.2 方法
1.2.1 动物模型
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20%乌拉坦8ml/kg腹腔注射麻醉，耳后径路打开听泡，暴露圆窗膜，在解剖显微镜下，用微型注射器在6点位刺破圆窗膜，并抽吸2～4μl清亮外淋巴液，在刺破抽吸过程中避免损伤内耳其它结构。对照耳只打开听泡暴露圆窗膜。
1.2.2 光镜标本
分别在造瘘后各期断头处死动物，快速取出双侧颞骨，用4%甲醛固定，10%EDTA脱钙，石蜡包埋切片，片厚4～6um，每10张捡出1张用苏木素—伊红染色，光学显微镜观察。
1.2.3 扫描电镜标本
断头后，快速取出双侧颞骨，浸于3.5%戊二醛磷酸缓冲液(PBS,pH=7.4)中。在解剖显微镜下取出镫骨，自蜗尖钻一小孔，从孔处灌注3.5%戊二醛5ml，然后放入3.5%戊二醛溶液中固定6小时。10%EDTA脱钙，经PBS漂洗后，50%酒精脱水20分钟，继放入70%酒精中，于解剖显微镜下除去耳蜗骨壳、螺旋韧带、前庭膜，制成耳蜗整体标本，酒精梯度脱水，置入100%醋酸异戊酯过夜。日立HCP-2型临界点干燥器干燥，EiKo IB-3型离子溅射仪喷金。日立S-570型扫描电镜观察。
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2 结 果
对照耳：2天组1耳见耳蜗第一二回前庭阶、鼓阶有少量浆液渗出，中阶、柯替氏器无异常发现，其余各对照组耳无明显形态变化。扫描电镜未观察到任何病理学变化。
实验耳：存活1、2天组，可见RWM穿孔尚未愈合，红细胞聚集在穿孔后淋巴腔，有浆液及纤维素性渗出物，上皮细胞开始向瘘孔边缘伸进；4天组在造孔边缘见纤维肉芽组织和较多间皮细胞增殖，中层有连接。首次观察到有1耳穿孔为凝结团和纤维肉芽组织完全封闭。1耳显示中阶扩大积水，Reissner's膜凸向前庭阶，顶转螺旋器明显受压，毛细胞少部分受损，在第一排与第二排毛细胞间的网状层可见切迹，此处盖膜弯曲(图1)；7天组RWM中外层肉芽组织增生性闭锁瘘孔，间皮组织增殖活跃，更多纤维素渗出物参与，中层纤维组织增殖更明显；14天组RWM穿孔处内层已完全愈合，间皮组织增殖显著(图2)；28天组1耳外毛细胞弯进了柯替氏器隧道，内外柱细胞质肿胀致柯替氏器隧道变窄，三排毛细胞均重度受损，内毛细胞也显现不同程度的破坏，纤毛缺失，Deiter 、Henson氏细胞部分破坏(图3)。发现实验耳RWM瘘孔多能自然愈合，24耳中22耳在7～14天完全愈合(占83%)。愈合时间最快4天，一般为7～14天。从连续观察结果来看，愈合过程中组织修复可归为1～2天、7～14天、28天三个时间段。
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图1 实验耳4天后改变
3 讨 论
国内外学者多采用豚鼠RWM破裂的动物模型研究外淋巴瘘[1]，但文献中报导EPLF后RWM瘘孔早期愈合特征的研究不多。本文连续观察造瘘后1个月内RWM瘘孔愈合过程及相应耳蜗形态学变化，分析其瘘孔愈合过程及可能机理为：①1～2天表现面向鼓室的上皮层开始沿穿孔缘生长，红细胞聚积在鼓阶侧，浆液性及纤维蛋白渗出，间皮组织开始反应；②4～7天RWM外内层上皮与有机化学块使穿孔愈合，表现为间皮下新生血管，间皮组织增殖活跃并释放纤维蛋白，细胞聚集封闭瘘孔。本实验发现，豚鼠RWM瘘孔愈合较快，此特点不同于鼓膜穿孔愈合过程[1]。鼓膜两侧界面与空气接触，而RWM一侧为空气，另一测为外淋巴，镜下所见RWM愈合主要发生在鼓阶，即凝结块形成和纤维蛋白与间皮细胞的增殖不仅来自于毗邻鼓阶的骨膜，而且来自于RWM的内层面，这种活跃的修复证实鼓阶具有很强的防御能力[2]。
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图2 实验耳14天后改变
图3 实验耳28天后改变
实验结果表明，RWM穿孔后外淋巴瘘的转归有不利于耳蜗功能的一面。RWM瘘孔持续2周未能自愈者，可造成耳蜗底回、二回Cortis器损害。14、28天各一耳穿孔未愈合，表现为内、外毛细胞遭到破坏，前庭膜破裂，纤毛缺失，支持细胞受损是为直接的证明。其机理可能为①窗膜破裂导致蜗管膜破裂，内外淋巴液混合，外淋巴被K+污染，造成毛细胞损害[3]；②内外淋巴压力改变的结果。本实验及Nomura[4]都观察到部分动物在前庭膜膨出的同时又伴耳蜗其它回前庭膜的萎陷；③窗膜破裂，空气进入外淋巴腔内抑制了基底膜振动。气体渗透致内淋巴积水，使毛细胞受损，气体泡增加了迷路内压力可致内耳膜破裂[2，3，5]；④穿刺直接损伤基底膜；⑤浆液性或化脓性迷路炎症，本实验未愈合耳鼓阶内大量白细胞聚积为其表现；⑥EPLF外淋巴液中游离氨基酸浓度升高可改变中阶液体的自身平衡引起血管纹和Cortis器结构变性[6]。
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EPLF可能有两种转归，即RWM自然修复愈合和出现不同程度的积水、前庭膜萎陷和破裂、毛细胞变性、缺失等病理变化。单一圆窗膜破裂致外淋巴瘘并不直接引起耳蜗形态学改变；RWM瘘孔长期不愈合者，可能存在膜迷路组织病理学改变，结合临床可考虑早期手术干预。
参考文献
1，Choo YB.Microscopic characteristics of round window problems in otology.Laryngoscope，1984；94：1
2，arnes l,Kathleen CM.Chronic Perilymph Fistula in the guiner Pig with implications in the Human.Ann.otol Rhinol Laryngol，1992；101：176
, http://www.100md.com 3，Nishioka I,Yanagihara N.Role of Air Bubbles in the Pherilymphatic as a Cause of Sudden Deafness.Am J otilogy，1986；7：430
4，Nomura Y.Innr ear Morphology of Experimental Perilymphatic Fistula.Am J otology，1992；13(1)：32
5，Bohmer A.On the Pathomechanism of Cochlear Dysfunction in Experimental Perilymph Fistulas.Laryngoscope，1991；101(10)：1307
6，Haruta A,Tono T.Effects of experimental Round windows membrane Laceration on the Free Amino Acid Profile of Perilymph.Acta otolaryngol，1995；115：504
收稿2000-02-21
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单位：吴立连 梁建伟 曾英 吕红 王显红(咸宁医学院附属第一医院耳鼻咽喉科，咸宁 437100)；董民声(河南医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，郑州 450000)
关键词：外淋巴瘘；圆窗；毛细胞；内耳形态学；扫描电镜
咸宁医学院学报000211 摘 要 目的：建立动物模型观察实验性外淋巴瘘(EPLF)对内耳形态学的影响，为临床治疗外淋巴瘘提供实验性依据。方法：24只豚鼠随机分成6组，每组4只，右耳为对照耳。用微型注射器刺破左耳圆窗膜(RWM)，并抽出2～4μl外淋巴液造成EPLF，分别于造瘘后1、2、4、7、14和28天处死，光镜和电镜下观察内耳形态变化。结果：穿孔的RWM大部分(83%)易于愈合。RWM破裂后2～4天穿孔处组织连接，7～14天基本愈合。扫描电镜观察造瘘后4天有毛细胞损伤，瘘口未愈合耳的耳蜗底回毛细胞明显减少。结论：EPLF转归有二，单一RWM穿孔趋向自然修复愈合，其组织形态学变化可逆；未愈合者或病程大于14天者，内耳形态学存在组织病理学改变，病理改变以及病程可作为手术干预的客观指标。
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中图分类号 R764.3 文献标识码 A
文章编号 1008-0635(2000)02-0110-03
Influence of Experimental Perilymphatic Fistula
on the Inner Ear Morphology
WU Lilian LIANG Jianwei ZENG Ying et al
(Department of otolaryngology,the First Affiliated Hospital,Xianning Medical College,Xianning 437100)
OBSTRACT Objective The influence of experimental perilymphatic fistula (EPLF) on inner ear morphology was investigated to establish an experimental model which could offer a warranty for cinical treatment.Methods 24 guinea pigs were randomly divided into 6 groups of 4 animals each (right ear as a control).EPLF was produced by pricking in the left round window membrane (RWM) of the guinea pig and by suctioning 2～4μl of perilymph fluid with a fine needle,than,the animals were killed on 1,2,4,7,14 and 28 days later,respectively.Morphologic changes of the cochlea were observed under a light and scanning electronic microscope.Results Most of the RWM ruptured were easily healed.The RWM perforation had already closed after 2～4 days and largely healed at 7～14 days.Loss of hair cell was immediately occured with causing fistula.Hair cells in the cochlea's basal turn were significantly decreased,particularly under that perforation still unlealed.Conclusion The pathologically morphologic variation exist in inner ear following EPLF.It can be regarded as a objective indication of surgery and a theoretical basis in clinical treatment when the duration of the window membrane ruptured is more than 7～14days.
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KWY WORDS Perilymphatic fistula；Round window；Hair cell；Inner ear morphology；SEM
目前国内关于圆窗膜(RWM)破裂致外淋巴瘘(EPLG)引起的突发性耳聋的实验研究报导甚少。本研究通过豚鼠内耳造模，旨在观察实验性外淋巴瘘对耳蜗形态学结构的影响，为临床提供实验性依据。
1 材料与方法
1.1材料
健康豚鼠24只，体重350～450克，雌雄不拘，鼓膜及耳廓反射正常，随机分为1、2、4、7、14和28天组，每组4只，左耳为实验耳，右耳为对照耳。
1.2 方法
1.2.1 动物模型
, http://www.100md.com
20%乌拉坦8ml/kg腹腔注射麻醉，耳后径路打开听泡，暴露圆窗膜，在解剖显微镜下，用微型注射器在6点位刺破圆窗膜，并抽吸2～4μl清亮外淋巴液，在刺破抽吸过程中避免损伤内耳其它结构。对照耳只打开听泡暴露圆窗膜。
1.2.2 光镜标本
分别在造瘘后各期断头处死动物，快速取出双侧颞骨，用4%甲醛固定，10%EDTA脱钙，石蜡包埋切片，片厚4～6um，每10张捡出1张用苏木素—伊红染色，光学显微镜观察。
1.2.3 扫描电镜标本
断头后，快速取出双侧颞骨，浸于3.5%戊二醛磷酸缓冲液(PBS,pH=7.4)中。在解剖显微镜下取出镫骨，自蜗尖钻一小孔，从孔处灌注3.5%戊二醛5ml，然后放入3.5%戊二醛溶液中固定6小时。10%EDTA脱钙，经PBS漂洗后，50%酒精脱水20分钟，继放入70%酒精中，于解剖显微镜下除去耳蜗骨壳、螺旋韧带、前庭膜，制成耳蜗整体标本，酒精梯度脱水，置入100%醋酸异戊酯过夜。日立HCP-2型临界点干燥器干燥，EiKo IB-3型离子溅射仪喷金。日立S-570型扫描电镜观察。
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2 结 果
对照耳：2天组1耳见耳蜗第一二回前庭阶、鼓阶有少量浆液渗出，中阶、柯替氏器无异常发现，其余各对照组耳无明显形态变化。扫描电镜未观察到任何病理学变化。
实验耳：存活1、2天组，可见RWM穿孔尚未愈合，红细胞聚集在穿孔后淋巴腔，有浆液及纤维素性渗出物，上皮细胞开始向瘘孔边缘伸进；4天组在造孔边缘见纤维肉芽组织和较多间皮细胞增殖，中层有连接。首次观察到有1耳穿孔为凝结团和纤维肉芽组织完全封闭。1耳显示中阶扩大积水，Reissner's膜凸向前庭阶，顶转螺旋器明显受压，毛细胞少部分受损，在第一排与第二排毛细胞间的网状层可见切迹，此处盖膜弯曲(图1)；7天组RWM中外层肉芽组织增生性闭锁瘘孔，间皮组织增殖活跃，更多纤维素渗出物参与，中层纤维组织增殖更明显；14天组RWM穿孔处内层已完全愈合，间皮组织增殖显著(图2)；28天组1耳外毛细胞弯进了柯替氏器隧道，内外柱细胞质肿胀致柯替氏器隧道变窄，三排毛细胞均重度受损，内毛细胞也显现不同程度的破坏，纤毛缺失，Deiter 、Henson氏细胞部分破坏(图3)。发现实验耳RWM瘘孔多能自然愈合，24耳中22耳在7～14天完全愈合(占83%)。愈合时间最快4天，一般为7～14天。从连续观察结果来看，愈合过程中组织修复可归为1～2天、7～14天、28天三个时间段。
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图1 实验耳4天后改变
3 讨 论
国内外学者多采用豚鼠RWM破裂的动物模型研究外淋巴瘘[1]，但文献中报导EPLF后RWM瘘孔早期愈合特征的研究不多。本文连续观察造瘘后1个月内RWM瘘孔愈合过程及相应耳蜗形态学变化，分析其瘘孔愈合过程及可能机理为：①1～2天表现面向鼓室的上皮层开始沿穿孔缘生长，红细胞聚积在鼓阶侧，浆液性及纤维蛋白渗出，间皮组织开始反应；②4～7天RWM外内层上皮与有机化学块使穿孔愈合，表现为间皮下新生血管，间皮组织增殖活跃并释放纤维蛋白，细胞聚集封闭瘘孔。本实验发现，豚鼠RWM瘘孔愈合较快，此特点不同于鼓膜穿孔愈合过程[1]。鼓膜两侧界面与空气接触，而RWM一侧为空气，另一测为外淋巴，镜下所见RWM愈合主要发生在鼓阶，即凝结块形成和纤维蛋白与间皮细胞的增殖不仅来自于毗邻鼓阶的骨膜，而且来自于RWM的内层面，这种活跃的修复证实鼓阶具有很强的防御能力[2]。
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图2 实验耳14天后改变
图3 实验耳28天后改变
实验结果表明，RWM穿孔后外淋巴瘘的转归有不利于耳蜗功能的一面。RWM瘘孔持续2周未能自愈者，可造成耳蜗底回、二回Cortis器损害。14、28天各一耳穿孔未愈合，表现为内、外毛细胞遭到破坏，前庭膜破裂，纤毛缺失，支持细胞受损是为直接的证明。其机理可能为①窗膜破裂导致蜗管膜破裂，内外淋巴液混合，外淋巴被K+污染，造成毛细胞损害[3]；②内外淋巴压力改变的结果。本实验及Nomura[4]都观察到部分动物在前庭膜膨出的同时又伴耳蜗其它回前庭膜的萎陷；③窗膜破裂，空气进入外淋巴腔内抑制了基底膜振动。气体渗透致内淋巴积水，使毛细胞受损，气体泡增加了迷路内压力可致内耳膜破裂[2，3，5]；④穿刺直接损伤基底膜；⑤浆液性或化脓性迷路炎症，本实验未愈合耳鼓阶内大量白细胞聚积为其表现；⑥EPLF外淋巴液中游离氨基酸浓度升高可改变中阶液体的自身平衡引起血管纹和Cortis器结构变性[6]。
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EPLF可能有两种转归，即RWM自然修复愈合和出现不同程度的积水、前庭膜萎陷和破裂、毛细胞变性、缺失等病理变化。单一圆窗膜破裂致外淋巴瘘并不直接引起耳蜗形态学改变；RWM瘘孔长期不愈合者，可能存在膜迷路组织病理学改变，结合临床可考虑早期手术干预。
参考文献
1，Choo YB.Microscopic characteristics of round window problems in otology.Laryngoscope，1984；94：1
2，arnes l,Kathleen CM.Chronic Perilymph Fistula in the guiner Pig with implications in the Human.Ann.otol Rhinol Laryngol，1992；101：176
, http://www.100md.com 3，Nishioka I,Yanagihara N.Role of Air Bubbles in the Pherilymphatic as a Cause of Sudden Deafness.Am J otilogy，1986；7：430
4，Nomura Y.Innr ear Morphology of Experimental Perilymphatic Fistula.Am J otology，1992；13(1)：32
5，Bohmer A.On the Pathomechanism of Cochlear Dysfunction in Experimental Perilymph Fistulas.Laryngoscope，1991；101(10)：1307
6，Haruta A,Tono T.Effects of experimental Round windows membrane Laceration on the Free Amino Acid Profile of Perilymph.Acta otolaryngol，1995；115：504
收稿2000-02-21
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