抗癌药阿霉素磁性蛋白微球的制备及其细胞毒试验*
作者：陶凯雄 陈道达 田源
单位：同济医科大学附属协和医院外科，武汉 430022
关键词：阿霉素；磁性微球；新剂型；抗癌作用
同济医科大学学报990517 摘要 利用加热固化蛋白质原理制备出阿霉素磁性蛋白微球，比色法分析其细胞毒作用。结果显示阿霉素磁性蛋白微球具有磁性药物微球的形态学特征，体外抑制肿瘤细胞生长的能力与阿霉素相似(P>0.05)，提示阿霉素磁性蛋白微球是抗癌药物阿霉素的一种新剂型，该药物剂型的改变未影响其体外药理作用，与磁场联用发挥靶向高效低毒的抗癌作用。
中图法分类号 R979.1， R944
Preparation and Cytotoxic Test of Antitumor Drug Adriamycin
, http://www.100md.com
Megnetic Albumin Microspheres
Tao Kaixiong, Chen Daoda, Tian Yuan
Department of General Surgery, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract The adriamycin magnetic albumin microspheres (ADM-MAMs) were prepared successfully by using the heat-stablized protein methods. Their cytotoxic effects to malignant tumor cells were detected by the colorimetric analysis. The results showed that the ADM-MAMs had the same morphological characters as the magnetic drug microspheres, and the similar antitumor activity against tumor cells to the ADM in vitro (P>0.05). These findings suggested that the ADM-MAM is an altered new dosage form of ADM, in which the pharmacological effects in vitro was resembled to that of ADM, and may produce the targeting, high-effective and low-toxic anticancer effects as combined with the external magnetic fields.
, 百拇医药
Key words adriamycin; magnetic microsphere; new dosage form of drug; antitumor effects
抗癌药物磁性微球的研制是现代肿瘤靶向治疗又一新进展。本文参照国内外有关研究报道[1，2]，利用加热固化蛋白质原理，成功地研制出阿霉素磁性蛋白微球(ADM-MAMs)并对其形态特征及体外药敏试验进行探讨，旨在了解抗癌药物磁性微球的制备方法以及剂型的改变对其体外药理作用的影响。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
①材料：超微磁粉(Fe3O4)n . (Fe2O3)m，颗粒直径5～10 nm，由武汉工业大学提供；铷铁硼磁体(80 mT)，包头市磁性材料厂生产；市售棉籽油。②阿霉素(ADM)及其标准品为意大利爱宝大药厂生产；德国产人血浆白蛋白；RPMI-1640，灭活小牛血清均为Gibco公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品；氢氧化钾、无水氯化钙、乙醚、活性炭均为化学分析纯。③仪器：美国产Model TC-2323型二氧化碳培养箱；Biorad Model-550型酶联检测仪；日产HITACHI S-450型扫描电子显微镜，F-3000型荧光分光光度仪，55P型低温超速离心机，Nikon HFX-DX型多功能显微镜及96孔培养板；国产超声处理机及电动搅拌机。④Walker-256癌肉瘤细胞株由中国医学科学院药物研究所提供。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1ADM-MAMs的制备[3]：①棉籽油的精制：市售棉籽油经加碱(氢氧化钾)中和游离脂肪酸，通蒸汽过滤除臭，无水氯化钙脱水，活性炭脱色等工序制成精制棉籽油，再经150 ℃左右高温处理1～2 h，干热灭菌后用于微球制备。②取200 g/L人白蛋白1 ml(含白蛋白200 mg)，阿霉素10 mg及超微磁粉36 mg加入精制棉籽油30 ml中，超声匀化处理约1 min；另取精制棉籽油100 ml加热至115 ℃，再加上述混匀的蛋白-药物油液，在1 600 r/min下持续搅拌10 min，冷却至室温， 用乙醚洗涤3～4次后离心，在外磁场下弃除上清液(乙醚)，其沉淀物置暗处挥发乙醚，4 ℃干燥即为阿霉素磁性蛋白微球(ADM-MAMs)粉剂，分装于小瓶内无菌保存备用。加入生理盐水即为阿霉素磁液。
1.2.2 ADM-MAMs的理化特征及药物含量检测[4]：①取阿霉素磁性微球粉剂1 mg配成10 ml乙醚悬液，一部分送电镜室进行扫描电镜观测，另一部置于普通培养瓶中，显微镜(20×10)观察微球在外磁场诱导下的分布及运动。②根据不同浓度阿霉素标准品(C)与相应之荧光值(F)，建立荧光值(F)-浓度(C)标准曲线方程：F=2.94×10-3×C+0.048，r=0.998，n=8。取10 mg阿霉素磁性微球粉剂加入10 ml 50 ml/L盐酸乙醇液内，4 ℃冰箱放置24 h后离心，取上清1 ml测定激发/发射波长为502/554 nm的荧光值(F)，通过上述标准曲线方程求出微球中药物含量。根据制作微球时投入的阿霉素量及研制出的磁微球中药物总量计算出该磁性微球药物相对包封率。
, 百拇医药
1.2.3 ADM-MAMs体外的细胞毒作用[5]：取对数生长期肿瘤细胞悬液50 μl(含瘤细胞1×105)分别加入96孔培养板中。按处置条件分为ADM-MAMs组，单纯ADM组及单纯磁性微球组，每种条件重复3～5个孔，每组设置7种不同药物浓度(含ADM浓度μg/ml)：0.04，0.08，0.2，0.4，0.8，2.0，4.0。分别向其中每孔加入20 μl相应浓度的试验药物，再加培养液至200 μl，同时设置正常瘤细胞对照 及完全培养液的空白组各6孔。均置于37 ℃饱和相对湿度50 ml/L(V/V)二氧化碳培养箱中孵育72 h，每孔再加入MTT(5 g/L) 20 μl，继续培养6 h，除去培养液，加入DMSO 150 μl，室温震荡10 min，酶联检测仪测定吸光值(A值)，按下列公式计算抑制率(IR)，根据药物浓度与抑制率的反应曲线，作图法求出半数抑制浓度(IC50)：
, 百拇医药
当抑制率IR≥50%时判断该药敏感。
IC50定义为吸光值降至对照组50%时的药物浓度(μg/ml)。数据统计采用t检验。
2 结果
2.1 ADM-MAMs的成功制备
①微球性状：本品呈红褐色粉末状，光学显微镜下呈散在圆形，其内可见已包裹的黑色磁粉颗粒；扫描电镜下呈现大小相对均匀的圆形球体，直径约3～10 μm，微球表面多孔，见附图。②磁响应性：光学显微镜观察培养瓶ADM-MAMs在乙醚溶液中呈不规则运动，在强度为80 mT的磁场诱导下，向磁铁方向运动，其动作距离为60～80 mm直至瓶壁。③微球药物包封率。应用荧光分光光度法检测磁性微球中阿霉素含量，每mg ADM-MAMs含阿霉素26.7 μg，推算出磁性微球的药物包封率为53.4%。
, 百拇医药
附图 阿霉素磁性蛋白微球扫描电镜形态(×1 000)
2.2 ADM-MAMs体外细胞毒作用
各种浓度的ADM-MAMs及单纯ADM对Walker-256细胞的抑制作用见下表，而不同浓度的不含阿霉素的磁性蛋白微球对肿瘤细胞均无明显抑制作用(A值无明显变化)。
从以上两表可知，在ADM血浆峰值浓度(0.4 μg/ml)时ADM及ADM-MAMs体外对Walker-256细胞抑制作用均敏感，并随着药物浓度增高，抑制作用增强，二者在相应浓度下的抑制率相近，其半数抑制浓度IC50分别为0.321 μg/ml和0.341 μg/ml(磁性微球中ADM含量)，均无显著性差异(P>0.05)。说明ADM-MAMs体外与游离ADM具有同样的抗肿瘤能力。
表1 各种处理条件对Walker-256细胞生长的影响(A值)
, http://www.100md.com
分组
对照
空白
含ADM浓度(μg/ml)
0.04
0.08
0.2
0.4
0.8
2.0
4.0
单纯ADM
ADM-MAMs
, http://www.100md.com
磁性微球
1.84
1.84
1.84
0.13
0.13
0.13
1.65
1.67
1.84
1.44
1.48
1.85
, 百拇医药
1.11
1.14
1.84
0.91
0.92
1.86
0.71
0.73
1.85
0.41
0.45
1.89
0.29
, http://www.100md.com
0.32
1.90
表2 各种处理条件抑制率(IR)及半数抑制浓度(IC50)
分组
不同浓度(μg/ml)下的IR(%)
IC50
(μg/ml)
0.04
0.08
0.2
0.4
, http://www.100md.com 0.8
2.0
4.0
单纯ADM
ADM-MAMs
11.4
10.1
23.7
21.1
42.9
41.1
54.6
53.7
, 百拇医药
66.7
65.1
80.7
78.4
89.5
88.9
0.321
0.341
3 讨论
为了提高抗癌药物的疗效和降低其毒副作用，国内外许多学者都在寻找各种靶向给药新途径。磁性抗癌药物微球作为一种新的靶向给药系统已成为人们研究的热点[2，6]，它是将抗癌药物，磁性超微粒子及骨架材料等经过一定的物理化学过程配制在药物稳定系统中，在足够强的外磁场下，经过血管系统到达滋养肿瘤的组织，并定位于靶区，所载药物得以缓慢定位释放，集中于肿瘤组织，并在细胞或亚细胞水平发挥高效、低毒的药效作用，而对正常组织无太大影响。
, 百拇医药
本实验利用加热固化蛋白质原理将阿霉素(ADM)、超微磁粉、人白蛋白与精制棉籽油混匀经过一系列工序制备出ADM-MAMs。并对其大小、形态特征，载药量及磁响应性等进行初步检测，本组自制ADM磁微球颗粒小(3～10 μm)，易制成混悬液，适用于血管内应用；微球呈圆形，表面多孔，有利于包裹药物的释放，超微磁粉(Fe3O4)n . (Fe2O3)m包裹于微球中央，对外磁场有较好的磁响应性能。磁性微球的药物含量为26.7 mg/g由此推算出药物的包封率为53.4%，与国外报道[4]相近，说明该方法可成功地、稳定地制备出ADM-MAMs。
关于磁性微球的制备，有血清蛋白加热固化法和多孔性聚合物微球磁体接触法等报道。由于在微球的制备过程中涉及许多物理化学过程，其包裹药物的药理作用有可能发生改变。本实验应用改良的MTT法检测自制的ADM-MAMs体外对恶性肿瘤细胞生长的抑制作用，证实ADM-MAMs体外对肿瘤的细胞毒作用与ADM相似。未包裹药物的磁性蛋白微球则无肿瘤活性，说明ADM-MAMs虽然剂型改变，但仍可产生抗肿瘤作用。磁性载体只起药物传递、释放作用，而本身并无独立的抗肿瘤作用。
, 百拇医药
因此，本实验对自制的ADM-MAMs的形态特征及理化性质的检测结果是令人满意的。通过对其体外细胞毒作用及磁响应性能的测试，可预测该磁性抗癌药物微球，在足够强外磁场诱导下，能够滞留于肿瘤区，实现靶向抗癌作用，为体内靶向治疗肿瘤提供了实验依据。
*国家“九五”科技攻关项目(No.96060116)
作者简介:陶凯雄，男，1967年生，主治医师，医学博士。
参考文献
1 王平康，袁青禄，刘岐山等.磁性抗癌药物载体的研制.中国医院药学杂志，1990，10(1)：2
2 Widder K J, Senyei A E, Sears B et al. Experimented methods in cancer therapeutics. J Pharm Sci, 1982,71:379
, 百拇医药
3 Gallo J M, Gupta P K , Perrier D G et al. Evaluation of drug delivery following the administration of magnetic albumin microspheres containing adriamycin to the rat. J Pharm Sci, 1989,78:190
4 Widder K J, Senyei A E, Ranney D F et al. In vitro release of biologically active adriamycin by magnetically responsive albumin microspheres. Cancer Res, 1980,40:3512
5 Sandak V K, Berlelsen C A, Kern D H et al. Evaluation and clinical application of a rapid chemosensitivity assay. Cancer, 1985,55：1367
6 吴传斌，魏树礼.磁性药物微球研究进展.中国药学杂志，1993，28(6)：330
收稿日期:1999-02-04, 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院外科，武汉 430022
关键词：阿霉素；磁性微球；新剂型；抗癌作用
同济医科大学学报990517 摘要 利用加热固化蛋白质原理制备出阿霉素磁性蛋白微球，比色法分析其细胞毒作用。结果显示阿霉素磁性蛋白微球具有磁性药物微球的形态学特征，体外抑制肿瘤细胞生长的能力与阿霉素相似(P>0.05)，提示阿霉素磁性蛋白微球是抗癌药物阿霉素的一种新剂型，该药物剂型的改变未影响其体外药理作用，与磁场联用发挥靶向高效低毒的抗癌作用。
中图法分类号 R979.1， R944
Preparation and Cytotoxic Test of Antitumor Drug Adriamycin
, http://www.100md.com
Megnetic Albumin Microspheres
Tao Kaixiong, Chen Daoda, Tian Yuan
Department of General Surgery, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract The adriamycin magnetic albumin microspheres (ADM-MAMs) were prepared successfully by using the heat-stablized protein methods. Their cytotoxic effects to malignant tumor cells were detected by the colorimetric analysis. The results showed that the ADM-MAMs had the same morphological characters as the magnetic drug microspheres, and the similar antitumor activity against tumor cells to the ADM in vitro (P>0.05). These findings suggested that the ADM-MAM is an altered new dosage form of ADM, in which the pharmacological effects in vitro was resembled to that of ADM, and may produce the targeting, high-effective and low-toxic anticancer effects as combined with the external magnetic fields.
, 百拇医药
Key words adriamycin; magnetic microsphere; new dosage form of drug; antitumor effects
抗癌药物磁性微球的研制是现代肿瘤靶向治疗又一新进展。本文参照国内外有关研究报道[1，2]，利用加热固化蛋白质原理，成功地研制出阿霉素磁性蛋白微球(ADM-MAMs)并对其形态特征及体外药敏试验进行探讨，旨在了解抗癌药物磁性微球的制备方法以及剂型的改变对其体外药理作用的影响。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
①材料：超微磁粉(Fe3O4)n . (Fe2O3)m，颗粒直径5～10 nm，由武汉工业大学提供；铷铁硼磁体(80 mT)，包头市磁性材料厂生产；市售棉籽油。②阿霉素(ADM)及其标准品为意大利爱宝大药厂生产；德国产人血浆白蛋白；RPMI-1640，灭活小牛血清均为Gibco公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品；氢氧化钾、无水氯化钙、乙醚、活性炭均为化学分析纯。③仪器：美国产Model TC-2323型二氧化碳培养箱；Biorad Model-550型酶联检测仪；日产HITACHI S-450型扫描电子显微镜，F-3000型荧光分光光度仪，55P型低温超速离心机，Nikon HFX-DX型多功能显微镜及96孔培养板；国产超声处理机及电动搅拌机。④Walker-256癌肉瘤细胞株由中国医学科学院药物研究所提供。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1ADM-MAMs的制备[3]：①棉籽油的精制：市售棉籽油经加碱(氢氧化钾)中和游离脂肪酸，通蒸汽过滤除臭，无水氯化钙脱水，活性炭脱色等工序制成精制棉籽油，再经150 ℃左右高温处理1～2 h，干热灭菌后用于微球制备。②取200 g/L人白蛋白1 ml(含白蛋白200 mg)，阿霉素10 mg及超微磁粉36 mg加入精制棉籽油30 ml中，超声匀化处理约1 min；另取精制棉籽油100 ml加热至115 ℃，再加上述混匀的蛋白-药物油液，在1 600 r/min下持续搅拌10 min，冷却至室温， 用乙醚洗涤3～4次后离心，在外磁场下弃除上清液(乙醚)，其沉淀物置暗处挥发乙醚，4 ℃干燥即为阿霉素磁性蛋白微球(ADM-MAMs)粉剂，分装于小瓶内无菌保存备用。加入生理盐水即为阿霉素磁液。
1.2.2 ADM-MAMs的理化特征及药物含量检测[4]：①取阿霉素磁性微球粉剂1 mg配成10 ml乙醚悬液，一部分送电镜室进行扫描电镜观测，另一部置于普通培养瓶中，显微镜(20×10)观察微球在外磁场诱导下的分布及运动。②根据不同浓度阿霉素标准品(C)与相应之荧光值(F)，建立荧光值(F)-浓度(C)标准曲线方程：F=2.94×10-3×C+0.048，r=0.998，n=8。取10 mg阿霉素磁性微球粉剂加入10 ml 50 ml/L盐酸乙醇液内，4 ℃冰箱放置24 h后离心，取上清1 ml测定激发/发射波长为502/554 nm的荧光值(F)，通过上述标准曲线方程求出微球中药物含量。根据制作微球时投入的阿霉素量及研制出的磁微球中药物总量计算出该磁性微球药物相对包封率。
, 百拇医药
1.2.3 ADM-MAMs体外的细胞毒作用[5]：取对数生长期肿瘤细胞悬液50 μl(含瘤细胞1×105)分别加入96孔培养板中。按处置条件分为ADM-MAMs组，单纯ADM组及单纯磁性微球组，每种条件重复3～5个孔，每组设置7种不同药物浓度(含ADM浓度μg/ml)：0.04，0.08，0.2，0.4，0.8，2.0，4.0。分别向其中每孔加入20 μl相应浓度的试验药物，再加培养液至200 μl，同时设置正常瘤细胞对照 及完全培养液的空白组各6孔。均置于37 ℃饱和相对湿度50 ml/L(V/V)二氧化碳培养箱中孵育72 h，每孔再加入MTT(5 g/L) 20 μl，继续培养6 h，除去培养液，加入DMSO 150 μl，室温震荡10 min，酶联检测仪测定吸光值(A值)，按下列公式计算抑制率(IR)，根据药物浓度与抑制率的反应曲线，作图法求出半数抑制浓度(IC50)：
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当抑制率IR≥50%时判断该药敏感。
IC50定义为吸光值降至对照组50%时的药物浓度(μg/ml)。数据统计采用t检验。
2 结果
2.1 ADM-MAMs的成功制备
①微球性状：本品呈红褐色粉末状，光学显微镜下呈散在圆形，其内可见已包裹的黑色磁粉颗粒；扫描电镜下呈现大小相对均匀的圆形球体，直径约3～10 μm，微球表面多孔，见附图。②磁响应性：光学显微镜观察培养瓶ADM-MAMs在乙醚溶液中呈不规则运动，在强度为80 mT的磁场诱导下，向磁铁方向运动，其动作距离为60～80 mm直至瓶壁。③微球药物包封率。应用荧光分光光度法检测磁性微球中阿霉素含量，每mg ADM-MAMs含阿霉素26.7 μg，推算出磁性微球的药物包封率为53.4%。
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附图 阿霉素磁性蛋白微球扫描电镜形态(×1 000)
2.2 ADM-MAMs体外细胞毒作用
各种浓度的ADM-MAMs及单纯ADM对Walker-256细胞的抑制作用见下表，而不同浓度的不含阿霉素的磁性蛋白微球对肿瘤细胞均无明显抑制作用(A值无明显变化)。
从以上两表可知，在ADM血浆峰值浓度(0.4 μg/ml)时ADM及ADM-MAMs体外对Walker-256细胞抑制作用均敏感，并随着药物浓度增高，抑制作用增强，二者在相应浓度下的抑制率相近，其半数抑制浓度IC50分别为0.321 μg/ml和0.341 μg/ml(磁性微球中ADM含量)，均无显著性差异(P>0.05)。说明ADM-MAMs体外与游离ADM具有同样的抗肿瘤能力。
表1 各种处理条件对Walker-256细胞生长的影响(A值)
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分组
对照
空白
含ADM浓度(μg/ml)
0.04
0.08
0.2
0.4
0.8
2.0
4.0
单纯ADM
ADM-MAMs
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磁性微球
1.84
1.84
1.84
0.13
0.13
0.13
1.65
1.67
1.84
1.44
1.48
1.85
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1.11
1.14
1.84
0.91
0.92
1.86
0.71
0.73
1.85
0.41
0.45
1.89
0.29
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0.32
1.90
表2 各种处理条件抑制率(IR)及半数抑制浓度(IC50)
分组
不同浓度(μg/ml)下的IR(%)
IC50
(μg/ml)
0.04
0.08
0.2
0.4
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2.0
4.0
单纯ADM
ADM-MAMs
11.4
10.1
23.7
21.1
42.9
41.1
54.6
53.7
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66.7
65.1
80.7
78.4
89.5
88.9
0.321
0.341
3 讨论
为了提高抗癌药物的疗效和降低其毒副作用，国内外许多学者都在寻找各种靶向给药新途径。磁性抗癌药物微球作为一种新的靶向给药系统已成为人们研究的热点[2，6]，它是将抗癌药物，磁性超微粒子及骨架材料等经过一定的物理化学过程配制在药物稳定系统中，在足够强的外磁场下，经过血管系统到达滋养肿瘤的组织，并定位于靶区，所载药物得以缓慢定位释放，集中于肿瘤组织，并在细胞或亚细胞水平发挥高效、低毒的药效作用，而对正常组织无太大影响。
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本实验利用加热固化蛋白质原理将阿霉素(ADM)、超微磁粉、人白蛋白与精制棉籽油混匀经过一系列工序制备出ADM-MAMs。并对其大小、形态特征，载药量及磁响应性等进行初步检测，本组自制ADM磁微球颗粒小(3～10 μm)，易制成混悬液，适用于血管内应用；微球呈圆形，表面多孔，有利于包裹药物的释放，超微磁粉(Fe3O4)n . (Fe2O3)m包裹于微球中央，对外磁场有较好的磁响应性能。磁性微球的药物含量为26.7 mg/g由此推算出药物的包封率为53.4%，与国外报道[4]相近，说明该方法可成功地、稳定地制备出ADM-MAMs。
关于磁性微球的制备，有血清蛋白加热固化法和多孔性聚合物微球磁体接触法等报道。由于在微球的制备过程中涉及许多物理化学过程，其包裹药物的药理作用有可能发生改变。本实验应用改良的MTT法检测自制的ADM-MAMs体外对恶性肿瘤细胞生长的抑制作用，证实ADM-MAMs体外对肿瘤的细胞毒作用与ADM相似。未包裹药物的磁性蛋白微球则无肿瘤活性，说明ADM-MAMs虽然剂型改变，但仍可产生抗肿瘤作用。磁性载体只起药物传递、释放作用，而本身并无独立的抗肿瘤作用。
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因此，本实验对自制的ADM-MAMs的形态特征及理化性质的检测结果是令人满意的。通过对其体外细胞毒作用及磁响应性能的测试，可预测该磁性抗癌药物微球，在足够强外磁场诱导下，能够滞留于肿瘤区，实现靶向抗癌作用，为体内靶向治疗肿瘤提供了实验依据。
*国家“九五”科技攻关项目(No.96060116)
作者简介:陶凯雄，男，1967年生，主治医师，医学博士。
参考文献
1 王平康，袁青禄，刘岐山等.磁性抗癌药物载体的研制.中国医院药学杂志，1990，10(1)：2
2 Widder K J, Senyei A E, Sears B et al. Experimented methods in cancer therapeutics. J Pharm Sci, 1982,71:379
, 百拇医药
3 Gallo J M, Gupta P K , Perrier D G et al. Evaluation of drug delivery following the administration of magnetic albumin microspheres containing adriamycin to the rat. J Pharm Sci, 1989,78:190
4 Widder K J, Senyei A E, Ranney D F et al. In vitro release of biologically active adriamycin by magnetically responsive albumin microspheres. Cancer Res, 1980,40:3512
5 Sandak V K, Berlelsen C A, Kern D H et al. Evaluation and clinical application of a rapid chemosensitivity assay. Cancer, 1985,55：1367
6 吴传斌，魏树礼.磁性药物微球研究进展.中国药学杂志，1993，28(6)：330
收稿日期:1999-02-04, 百拇医药