氧自由基在肝脏保存再灌注损伤中的作用
作者：赵浩亮 武小勇 李正中
单位：赵浩亮(山西医科大学第一临床医学院外科 太原 030001);武小勇(山西医科大学第一临床医学院外科 太原 030001);李正中(山西医科大学第一临床医学院外科 太原 030001)
关键词：肝；再灌注损伤；氧自由基；大鼠
山西医科大学学报000103 摘要： 目的 探讨氧自由基在肝脏保存再灌注损伤(HPRI)中的作用。方法 应用离体大鼠肝脏保存再灌注模型，观察超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，谷草转氨酶(AST)含量以及肝细胞形态学态化。结果 HPRI时，SOD活性显著下降(P<0.05)，MDA 含量和 AST 活性明显升高(P<0.05，P<0.05)，肝细胞形态发生异常变化。结论 氧自由基是导致 HPRI 的重要因素。
中图分类号： R363.1+3 文献标识码： A
, http://www.100md.com
文章编号： 1007-6611(2000)01-0006-02
Role of oxygen free radicals in hepatic preservation-reperfusion injury
Zhao Haoliang, Wu Xiaoyong, Li Zhengzhong
(Dept. of Surgery, 1st Cinical Medical College, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
Abstract： Objective To explore the role of oxygen free radicals (OFR) in hepatic preservation-reperfusion injury (HPRI) of rats. Methods Changes of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and aspartate aminotransferase (AST) as well as morphological changes of hepatocytes were observed during preservation-reperfusion of isolated rat liver. Results SOD activity decreased significantly (P<0.05)，MDA and AST concentration increased remarkably (P<0.05，P<0.05)， and abnormal morphological changes of hepatocytes were obvious during HPRI. Conclusion It is indicate that OFR may be one of the primary causes for HPRI.
, http://www.100md.com
Key words: liver; reperfusioninjury; oxygen free radical; rats
肝脏保存再灌注损伤(hepatic preservation reperfusion injury HPRI)是影响肝移植效果的重要因素[1]，氧自由基损伤可能是 HPRI 的重要机制之一[2]。本研究通过制备离体鼠肝低温保存再灌注模型，观察肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的变化及观察肝功能和肝细胞形态学变化，以探讨氧自由基的损伤作用。
1 材料和方法
1.1 肝脏保存液及灌注液成分 Belzer UW 保存液：购自美国 Dupont pharma 公司(Wilmington Delaware 19880)。自制 KH(krebs-Henseleit)平衡灌注液：每升中含NaCl 1.18 mmol，KCl 4.74 mmol,CaCl2 1.24 mmol，MaSO4 1.18 mmol，KH2PO4 1.19 mmol,NaHCO3 24.9 mmol，葡萄糖 5 mmol，加蒸馏水至1 000 ml, pH 为 7.4。
, http://www.100md.com
1.2 动物模型及分组 健康 Wistar 雄性大鼠 30 只(购自北京医科大学动物中心)。体重 200～250 g，实验分为 5 组，每组 6 只。动物禁食 12 h 后，腹腔注射 3% 戊巴比妥钠 30 mg/kg 施行麻醉，“十”字切口进腹，分离切断肝脏周围韧带，解剖肝门，下腔静脉注入肝素 50 U，游离门静脉、胆总管，肝上下腔静脉，分别插管，右肾静脉平面上结扎切断肝下下腔静脉，经门静脉原位灌注 1 ℃ 乳酸林格液 20 ml，灌注压为 1.96 kPa 迅速切除肝脏。
对照组(保存 0 h 组)：切除肝脏后不保存，立即与灌注系统连接，行离体鼠肝循环再灌注(IPRL)，灌注液为 KH 平衡液，加入新鲜洗涤人红细胞(红细胞比容为15%)，充 100% 纯氧，灌注速度为 1 ml/(min.g)，压力为 1.76～1.96 kPa，灌注温度控制为 37 ℃，灌注时间为 60 min。
保存 8 h 组：切除肝脏后置入 4 ℃ UW 液中保存 8 h，保存结束行 IPRL。保存 16 h：方法同保存 8 小时组。保存 24 h 组：方法同上。保存 32 h 组：方法同上。
, http://www.100md.com
各组分别于再灌注中 10、30和60 min 采集灌注流出液 2 ml，备肝功能测定，IPRL 结束后取肝左叶组织 100 mg 制成匀浆，测定氧自由基，另取少许肝左中叶组织行光镜电镜观察。
1.3 观察项目与方法 ①肝灌注流出液谷草转氨酶(AST)测定，采用赖氏法。②肝组织 SOD 测定，采用黄嘌呤氧化酶法(试剂购自南京建成生物工程研究所)。③肝组织 MOD 测定，采用改良的八木国夫法(试剂购自四川迈克科技有限公司)。④肝组织的光镜与电镜观察。
1.4 实验数据统计处理 数据均以
±s表示，采用 t 检验判断差异显著性。
2 结果
2.1 对照组与肝保存不同时间组灌注液AST含量变化 保存 8 h 组与对照组相比，AST 含量无明显差异，保存 16 h 组，AST 含量增高，与对照组相比有显著差异(P<0.05)，而且随保存和灌注时间延长 AST 含量呈进行性增高，说明肝损伤呈进行性加重(见表1)。
, 百拇医药
表1 各组肝灌注流出液 AST 含量变化(U/L,±s) 组别
灌注时间 (t/min)
10
30
60
对照组(保存 0 h)
24.88±3.45
29.01±3.35
31.17±3.88
保存 8 h 组
, 百拇医药
27.06±3.96
28.95±4.17
32.09±3.60
保存 16 h 组
79.02±3.97△
89.84±2.73△
109.73±4.31△
保存 24 h 组
94.29±3.34△
140.34±3.30△
, 百拇医药
180.74±3.22△
保存 32 h 组
105.38±4.60△
164.03±8.59△
201.04±9.01△
△与对照组比较 P<0.05
2.2 对照组与不同保存时间组肝组织 SOD 和MDA 含量的变化 保存 8 h 组与对照组相比，SOD 和 MDA 含量无明显差异，保存 16 h 组与对照组相比，SOD 含量下降，MDA 含量增高，差异均有显著性(P<0.05)，随保存时间延长，SOD 含量进行性下降，伴随 MDA 含量的不断增高(见表2)。
, http://www.100md.com
表2 各组肝组织 SOD 和 MDA 含量的变化(±s) 组别
SOD(U/g)
MDA(μmol/g)
对照组(保存 0 h)
12.638±0.434
0.496±0.019
保存 8 h 组
10.625±1.433
0.587±0.074
保存 16 h 组
, 百拇医药
7.521±1.699△
0.892±0.056△
保存 24 h 组
3.759±0.668△
1.076±0.038△
保存 32 h 组
1.344±0.332△
3.257±0.025△
△与对照组比较 P<0.05
, http://www.100md.com
2.3 肝细胞形态学改变
2.3.1 光镜下所见 对照组和保存 8 h 组肝细胞形态基本正常，保存 16 h 组肝细胞出现肿胀，脂肪变性，空泡变性及点状坏死，而且随肝保存时间延长，肝细胞肿胀，变性和坏死的程度和范围加重。
2.3.2 电镜下所见 对照组和保存 8 h 组肝细胞超微结构基本正常；保存 16 h 组出现线粒体和内质网肿胀，毛细胆管内微绒毛变少；随肝保存时间延长，微绒毛形态异常、数量稀少，线粒体和内质网肿胀加重。
3 讨论
肝脏保存再灌注损伤(HPRI)是导致肝移植术后早期肝功能低下和原发性无功能的重要因素，氧自由基可能是 HPRI 的重要机制之一。在肝脏低温保存再灌注中，可通过多种途径产生大量氧自由基，对肝细胞膜双键不饱和脂肪酸进行氧化，引起脂质过氧化反应，导致肝细胞损伤[3，4]。氧自由清除剂 SOD 和脂质过氧化反应代谢产物 MDA 是目前公认的能较好地反映体内氧自由基水平及脂质过氧化损伤程度的间接指标。本实验结果显示：随肝脏保存和再灌注时间延长，肝组织 SOD 活性显著下降，MDA 水平明显增高，与此同时伴有肝灌流液中 AST 含量的进行性增高及肝组织学和超微结构的异常变化。资料统计还显示：MDA 水平与 AST 值的变化呈显著正相关(r＝0.463 P<0.05)，表明肝保存再灌注时由于氧化系统被激活，抗氧化系统受抑制，从而氧自由基大量生成而清除减少，体内氧自由基水平升高，引起脂质过氧化反应，而导致 HPRI。由此可见，氧自由基及其引发的脂质过氧化反应是引起 HPRI 的重要因素之一，这为预防 HPRI，提高肝保存移植成功率，提供了理论依据。
, http://www.100md.com
作者简介： 赵浩亮，男，1959年6月生，博士，副教授
参考文献：
[1] Jassem W, Roake J. The molecular and cellular basis of reperfusion injury following organ transplantation[J]. Trans Plantation Review, 1998, 12: 14～13.
[2] Ursula R, Irith R, Anke F, et al. Oxygen free radical mediated injury to cultured rat hepatocytes during cold incubation in preservation solution[J]. Hepatology, 1997, 26: 353～357.
, 百拇医药
[3] Lemasters JJ, Thurman RG. The many facts of reperfusion injury[J]. Gastroenterology, 1995, 108: 1317～1320.
[4] Brass CA, Robers TG. Hepatic free radical production after cold storage: Kupffer cell-dependent and independent mechanisms in rats[J]. Gastroenterology, 1995, 108: 1167～1175.
[收稿日期： 1999-05-17], 百拇医药
单位：赵浩亮(山西医科大学第一临床医学院外科 太原 030001);武小勇(山西医科大学第一临床医学院外科 太原 030001);李正中(山西医科大学第一临床医学院外科 太原 030001)
关键词：肝；再灌注损伤；氧自由基；大鼠
山西医科大学学报000103 摘要： 目的 探讨氧自由基在肝脏保存再灌注损伤(HPRI)中的作用。方法 应用离体大鼠肝脏保存再灌注模型，观察超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，谷草转氨酶(AST)含量以及肝细胞形态学态化。结果 HPRI时，SOD活性显著下降(P<0.05)，MDA 含量和 AST 活性明显升高(P<0.05，P<0.05)，肝细胞形态发生异常变化。结论 氧自由基是导致 HPRI 的重要因素。
中图分类号： R363.1+3 文献标识码： A
, http://www.100md.com
文章编号： 1007-6611(2000)01-0006-02
Role of oxygen free radicals in hepatic preservation-reperfusion injury
Zhao Haoliang, Wu Xiaoyong, Li Zhengzhong
(Dept. of Surgery, 1st Cinical Medical College, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
Abstract： Objective To explore the role of oxygen free radicals (OFR) in hepatic preservation-reperfusion injury (HPRI) of rats. Methods Changes of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and aspartate aminotransferase (AST) as well as morphological changes of hepatocytes were observed during preservation-reperfusion of isolated rat liver. Results SOD activity decreased significantly (P<0.05)，MDA and AST concentration increased remarkably (P<0.05，P<0.05)， and abnormal morphological changes of hepatocytes were obvious during HPRI. Conclusion It is indicate that OFR may be one of the primary causes for HPRI.
, http://www.100md.com
Key words: liver; reperfusioninjury; oxygen free radical; rats
肝脏保存再灌注损伤(hepatic preservation reperfusion injury HPRI)是影响肝移植效果的重要因素[1]，氧自由基损伤可能是 HPRI 的重要机制之一[2]。本研究通过制备离体鼠肝低温保存再灌注模型，观察肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的变化及观察肝功能和肝细胞形态学变化，以探讨氧自由基的损伤作用。
1 材料和方法
1.1 肝脏保存液及灌注液成分 Belzer UW 保存液：购自美国 Dupont pharma 公司(Wilmington Delaware 19880)。自制 KH(krebs-Henseleit)平衡灌注液：每升中含NaCl 1.18 mmol，KCl 4.74 mmol,CaCl2 1.24 mmol，MaSO4 1.18 mmol，KH2PO4 1.19 mmol,NaHCO3 24.9 mmol，葡萄糖 5 mmol，加蒸馏水至1 000 ml, pH 为 7.4。
, http://www.100md.com
1.2 动物模型及分组 健康 Wistar 雄性大鼠 30 只(购自北京医科大学动物中心)。体重 200～250 g，实验分为 5 组，每组 6 只。动物禁食 12 h 后，腹腔注射 3% 戊巴比妥钠 30 mg/kg 施行麻醉，“十”字切口进腹，分离切断肝脏周围韧带，解剖肝门，下腔静脉注入肝素 50 U，游离门静脉、胆总管，肝上下腔静脉，分别插管，右肾静脉平面上结扎切断肝下下腔静脉，经门静脉原位灌注 1 ℃ 乳酸林格液 20 ml，灌注压为 1.96 kPa 迅速切除肝脏。
对照组(保存 0 h 组)：切除肝脏后不保存，立即与灌注系统连接，行离体鼠肝循环再灌注(IPRL)，灌注液为 KH 平衡液，加入新鲜洗涤人红细胞(红细胞比容为15%)，充 100% 纯氧，灌注速度为 1 ml/(min.g)，压力为 1.76～1.96 kPa，灌注温度控制为 37 ℃，灌注时间为 60 min。
保存 8 h 组：切除肝脏后置入 4 ℃ UW 液中保存 8 h，保存结束行 IPRL。保存 16 h：方法同保存 8 小时组。保存 24 h 组：方法同上。保存 32 h 组：方法同上。
, http://www.100md.com
各组分别于再灌注中 10、30和60 min 采集灌注流出液 2 ml，备肝功能测定，IPRL 结束后取肝左叶组织 100 mg 制成匀浆，测定氧自由基，另取少许肝左中叶组织行光镜电镜观察。
1.3 观察项目与方法 ①肝灌注流出液谷草转氨酶(AST)测定，采用赖氏法。②肝组织 SOD 测定，采用黄嘌呤氧化酶法(试剂购自南京建成生物工程研究所)。③肝组织 MOD 测定，采用改良的八木国夫法(试剂购自四川迈克科技有限公司)。④肝组织的光镜与电镜观察。
1.4 实验数据统计处理 数据均以
±s表示，采用 t 检验判断差异显著性。2 结果
2.1 对照组与肝保存不同时间组灌注液AST含量变化 保存 8 h 组与对照组相比，AST 含量无明显差异，保存 16 h 组，AST 含量增高，与对照组相比有显著差异(P<0.05)，而且随保存和灌注时间延长 AST 含量呈进行性增高，说明肝损伤呈进行性加重(见表1)。
, 百拇医药
表1 各组肝灌注流出液 AST 含量变化(U/L,
±s) 组别灌注时间 (t/min)
10
30
60
对照组(保存 0 h)
24.88±3.45
29.01±3.35
31.17±3.88
保存 8 h 组
, 百拇医药
27.06±3.96
28.95±4.17
32.09±3.60
保存 16 h 组
79.02±3.97△
89.84±2.73△
109.73±4.31△
保存 24 h 组
94.29±3.34△
140.34±3.30△
, 百拇医药
180.74±3.22△
保存 32 h 组
105.38±4.60△
164.03±8.59△
201.04±9.01△
△与对照组比较 P<0.05
2.2 对照组与不同保存时间组肝组织 SOD 和MDA 含量的变化 保存 8 h 组与对照组相比，SOD 和 MDA 含量无明显差异，保存 16 h 组与对照组相比，SOD 含量下降，MDA 含量增高，差异均有显著性(P<0.05)，随保存时间延长，SOD 含量进行性下降，伴随 MDA 含量的不断增高(见表2)。
, http://www.100md.com
表2 各组肝组织 SOD 和 MDA 含量的变化(
±s) 组别SOD(U/g)
MDA(μmol/g)
对照组(保存 0 h)
12.638±0.434
0.496±0.019
保存 8 h 组
10.625±1.433
0.587±0.074
保存 16 h 组
, 百拇医药
7.521±1.699△
0.892±0.056△
保存 24 h 组
3.759±0.668△
1.076±0.038△
保存 32 h 组
1.344±0.332△
3.257±0.025△
△与对照组比较 P<0.05
, http://www.100md.com
2.3 肝细胞形态学改变
2.3.1 光镜下所见 对照组和保存 8 h 组肝细胞形态基本正常，保存 16 h 组肝细胞出现肿胀，脂肪变性，空泡变性及点状坏死，而且随肝保存时间延长，肝细胞肿胀，变性和坏死的程度和范围加重。
2.3.2 电镜下所见 对照组和保存 8 h 组肝细胞超微结构基本正常；保存 16 h 组出现线粒体和内质网肿胀，毛细胆管内微绒毛变少；随肝保存时间延长，微绒毛形态异常、数量稀少，线粒体和内质网肿胀加重。
3 讨论
肝脏保存再灌注损伤(HPRI)是导致肝移植术后早期肝功能低下和原发性无功能的重要因素，氧自由基可能是 HPRI 的重要机制之一。在肝脏低温保存再灌注中，可通过多种途径产生大量氧自由基，对肝细胞膜双键不饱和脂肪酸进行氧化，引起脂质过氧化反应，导致肝细胞损伤[3，4]。氧自由清除剂 SOD 和脂质过氧化反应代谢产物 MDA 是目前公认的能较好地反映体内氧自由基水平及脂质过氧化损伤程度的间接指标。本实验结果显示：随肝脏保存和再灌注时间延长，肝组织 SOD 活性显著下降，MDA 水平明显增高，与此同时伴有肝灌流液中 AST 含量的进行性增高及肝组织学和超微结构的异常变化。资料统计还显示：MDA 水平与 AST 值的变化呈显著正相关(r＝0.463 P<0.05)，表明肝保存再灌注时由于氧化系统被激活，抗氧化系统受抑制，从而氧自由基大量生成而清除减少，体内氧自由基水平升高，引起脂质过氧化反应，而导致 HPRI。由此可见，氧自由基及其引发的脂质过氧化反应是引起 HPRI 的重要因素之一，这为预防 HPRI，提高肝保存移植成功率，提供了理论依据。
, http://www.100md.com
作者简介： 赵浩亮，男，1959年6月生，博士，副教授
参考文献：
[1] Jassem W, Roake J. The molecular and cellular basis of reperfusion injury following organ transplantation[J]. Trans Plantation Review, 1998, 12: 14～13.
[2] Ursula R, Irith R, Anke F, et al. Oxygen free radical mediated injury to cultured rat hepatocytes during cold incubation in preservation solution[J]. Hepatology, 1997, 26: 353～357.
, 百拇医药
[3] Lemasters JJ, Thurman RG. The many facts of reperfusion injury[J]. Gastroenterology, 1995, 108: 1317～1320.
[4] Brass CA, Robers TG. Hepatic free radical production after cold storage: Kupffer cell-dependent and independent mechanisms in rats[J]. Gastroenterology, 1995, 108: 1167～1175.
[收稿日期： 1999-05-17], 百拇医药