二甲基-氨氯吡咪和牛黄酸对大鼠心室肌细胞Na+/Ca2+交换电流的影响
作者：武冬梅 吕吉元 吴博威
单位：武冬梅(山西医科大学生理教研室 太原 030001);吕吉元(山西医科大学生理教研室 太原 030001);吴博威(山西医科大学生理教研室 太原 030001)
关键词：二甲基-氨氯吡咪；牛黄酸；膜片钳技术；心肌Na+/Ca2+交换电流
山西医科大学学报000101 摘要： 利用全细胞膜片钳技术，采用胶原酶 B 急性分离的大鼠心室肌细胞，研究了牛黄酸和二甲基-氨氯吡咪对心肌细胞膜 Na+/Ca2+交换电流的影响。结果表明，10 μmol, 20 μmol 和 40 μmol 的二甲基-氨氯吡咪可使 Ni2+ 敏感电流浓度依赖性地增加；膜电位为 +50 mV 时分别增加 (27±7)%，(121±43)%，和 (173±68)%；膜电位为 -100 mV 时分别增加(110±52)%，(221±88)%和(281±80)%。牛黄酸对 Na+/Ca2+交换的内向和外向电流均无影响。
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中图分类号： R331.3+8 文献标识码： A
文章编号： 1007-6611(2000)01-0001-03
Effects of 5-(N,N-dimethyl)-amiloride (DMA) and taurine on Na+/Ca2+ exchange current in rat ventricular myocytes
Wu Dongmei， Lü Jiyuan， Wu Bowei
(Dept.of Physiology,Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
Abstract： Using the whole cell patch-clamp technique to study effects of taurine and 5-(N,N-dimethyl)-amiloride (DMA) on Na+/Ca2+ exchange current in rat ventricular myocytes. The results showed that at membrane potential of +50 mV and -100 mV, DMA 10 μmol, 20 μmol and 40 μmol increased the Ni2+-sensitive current by (27±7)%，(121±43)%，(173±68)%；and (110±52)%,(221±88)%,(281±80)%,respectively.DMA increases the Na+/Ca2+ exchange current in a dose-dependent manner while taurine has no effect on Na+/Ca2+ exchange current.
, 百拇医药
Key words： 5-(N,N-dimethy1)-amiloride; taurine; patch clamp technique; myocardium; Na+/Ca2+ exchange current
目前研究表明，心肌缺血再灌注损伤的中心环节和最终的共同通路是钙超载，而大量的实验研究证明钙超载的形成涉及 Na+/Ca2+ 交换[1]，而Na+/Ca2+交换体在调节心室肌细胞钙转运中起着非常重要的作用[2]。该电流呈双向性，不仅排出在兴奋-收缩偶联时经钙通道进入细胞的钙，而且还转运钙进入细胞内，激活肌浆网的释放钙反应，进而触发兴奋-收缩偶联[3]。Na+/H+交换抑制剂 DMA 可改善缺血后心缩力的恢复，保护细胞微结构的完整性，减少 Na+ 和 Ca2+ 的超载，对心肌缺血再灌注损伤有保护作用[4]。牛黄酸是目前研究较多的一种内源性细胞保护物质，已有大量报道说明牛黄酸具有多方面的抗缺血再灌注损伤的作用[5]，我室在这方面也做了系列工作，证明 DMA 合用牛黄酸在离体心脏灌流中可显著减轻心肌缺血再灌注损伤(未发表)。但详细机制还不十分清楚。为了深入研究它们的作用机制，本工作利用膜片钳全细胞记录方式，观察这两种药物对Na+/Ca2+交换电流的影响。
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1 材料和方法
1.1 单个心室肌细胞制备 实验选用大鼠，体重 200～250 g，雌雄不拘。经 Langendorff 灌流心脏，采用胶原酶(collegnase B, Boehringer Mannheim;0.3 g/L 德国)和高钾 KB 液保护的分离技术[6]，制备单个心室肌细胞。
1.2 全细胞膜片钳技术 应用全细胞钳制方法记录膜电流，使用膜片钳放大器(Axopatch 200A,Axon instruments, Inc. 美国)和 PCLAMP 5.51 微机程序，细胞封接在倒置显微镜(XDP-1，上海光学仪器厂)及与其相联的微操纵器(MO-203，Narishige Co., Japan)上进行。电极阻抗为 2～3 MΩ，测定钠/钙交换电流时细胞外灌流液加入 Nicardipine 1 μmol，哇巴因 20 μmol，BaCl2 1 μmol，分别阻断钙通道，Na+/K+ 泵和内向整流钾通道；电极内液加入四乙胺阻断其他钾通道。
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1.3 溶液 台氏液成分(mmol/L)：NaCl 135.0，KCl 5.4, CaCl2 1.8,MgCl2 1.0,NaH2PO4 0.33，HEPES 10 和萄葡糖10，用 NaOH 调酸度至 pH 7.4。无钙台氏液除不含CaCl2外，其余与台氏液成分相同。电极内液成分(mmol/L)：KCl 140.0，HEPES 5.0， EGTA 10.0，Na2ATP 2.0，MgCl2 1.0，用 KOH 调酸度至 pH 7.3。KB 液成分 (mmol/L)：KOH 85，L-天冬氨酸 50.0，KCl 30.0，牛黄酸 20.0，KH2PO2 30.0, MgCl2 1.0，HEPES 10.0，葡萄糖 10.0 和EGTA 0.5。用 KOH 调酸度至 pH 7.4。
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A a.对照； b.40 μmol/L DMA; c.5mmol/L NiCl2
B a-c.Ni2+敏感Na+/Ca2+交换电流；b-c.DMA增强Na+/Ca2+交换电流
图1 二甲基-氨氯吡咪(DMA)对大鼠心室肌细胞
Na+/Ca2+ 交换电流的影响
1.4 试剂 牛黄酸，二甲基-氨氯吡咪(DMA)，哇巴因，四乙胺和氢氧化铯均为 Sigma 产品；尼卡地平来自 Ludwing-Shafen (德国)；其他试剂为国产分析纯产品。
1.5 统计 数据以均数±标准差(
±s)表示，采用配对t检验。
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2 结果
2.1 Na+/Ca2+交换电流的测定 运用锯齿电压程序记录电流-电压关系曲线，维持电压 -40 mV，锯齿脉冲从 -120 mV 以 90 mV/s 的速率去极化至 +60 mV，刺激频率为 0.06 Hz。Ni2+可特异性地阻断 Na+/Ca2+交换电流，利用 Ni2+ 阻断前后的电流差，得到 Ni2+ 敏感电流即为 Na+/Ca2+ 交换电流[7](Fig.1B:a-c)。
2.2 牛黄酸和 DMA 对 Na+/Ca2+ 交换电流的作用 DMA 可剂量依赖性地增加大鼠心室肌细胞的 Na+/Ca2+ 交换电流，浓度为 10 μmol/L，20 μmol/L 和 40 μmol/L 的 DMA 平均使 Ni2+敏感外向电流从对照组的(63±18)pA 分别增加到 (80±26)，(113±19)和(163±22)pA，内向电流从对照组的 125±27 pA 分别增中到(252±22)，(383±21) 和 (445±27)pA(图1，表1)。牛黄酸对 Na+/Ca2+ 交换电流无影响(P>0.05)。
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表1 二甲基-氨氯吡咪(DMA)和牛黄酸对大鼠心室肌细胞 Na+/Ca2+交换电流的影响 组别
n
膜电流(pA)
+50 mV
变化百分率(%)
膜电流(pA)
-100 mV
变化百分率(%)
给药前
给药后
给药前
, 百拇医药
给药后
DMA 组
(μmol/L)
10
4
63±18
80±26
27±7
125±27
252±22*
110±52
20
4
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63±18
133±19*
121±43
125±27
383±21*
221±88
40
4
63±18
163±22*
173±68
125±27
, 百拇医药
445±27*
281±80
牛黄酸组
(mmol/L)
20
4
65±19
68±21
2.8±1.4
130±71
132±75
1.1±0.8
, 百拇医药
对照组∶给药前； 给药后∶对照组 *P<0.01
3 讨论
本实验首次证明 DMA 对大鼠心肌细胞的钠钙交换有激动作用。内向电流显著大于外内向电流。增强内向电流可使 Ca2+ 通过钠/钙交换系统外排加强，进一步降低细胞内 Ca2+ 浓度，使舒张更彻底。刺激外向电流，通过钠/钙交换进入心肌内的 Ca2+增加，激发肌浆网释放更多 Ca2+，从而使收缩加强。DMA 为内向电流的作用更显著，10 μmol 可使内向电流绝对值增加 127 pA,而使外向电流的绝对值仅增加 17 pA,说明 DMA 可降低细胞内 Ca2+浓度，使舒张得到加强。牛黄酸对大鼠心室肌细胞 Na+/Ca2+ 交换电流无作用。
作者简介： 武冬梅，女，1952年11月生，博士，副教授
, 百拇医药
参考文献：
[1] Mary LLM,Sanjiv M, Li GH, Marris K. Sodium-hydrogen exchange inhibitors improve postischemic recovery of function in the perfused rabbit heart[J]. Cardiovasc Res, 1995, 29: 209～214.
[2] Reeves JP. Cardiac sodium-calcium exchange system.In:Spere laik N,ed. Physiology and Pathophysiology of the heart[M]. 3th ed. Boston: Kluger Academic Publ, 1995. 315～317.
[3] Schulze D, Kofuji P,Hadley R, et al.Sodium/calcium exchanger in heart muscle: molecular biology, cellular function, and its special role in excitation-contraction coupling[J]. Cardiovasc Res, 1993, 27: 1726～1734.
, 百拇医药
[4] Meng H, Pierce GN. Protective effects of 5-(N,N-dimethy1)-amiloride on ischemia-reperfusion injury in hearts[J]. Am J Physiol 1990, 258(Heart Circ Physiol 27) H 1615～1619.
[5] 石湘云，姚松朝. 牛磺酸的心肌保护作用[J].中国药学通报, 1995, 11 (2): 106～109.
[6] Mubagwa K, Stang1 M, Flameng W. Extracellular divalent cations block an action-nonselective conductance unrelated to calcium channels in cardiac cells[J]. J Physiol(Lond),1997,502: 235～237.
[7] Ehara T, Matsuoka S, Noma A. Measurement of reversal potential of Na+/Ca2+ exchange current in single guinea-pig ventricular cells[J]. J Physiol (Lond) 1989, 410: 227～249.
[收稿日期： 1999-10-08], http://www.100md.com
单位：武冬梅(山西医科大学生理教研室 太原 030001);吕吉元(山西医科大学生理教研室 太原 030001);吴博威(山西医科大学生理教研室 太原 030001)
关键词：二甲基-氨氯吡咪；牛黄酸；膜片钳技术；心肌Na+/Ca2+交换电流
山西医科大学学报000101 摘要： 利用全细胞膜片钳技术，采用胶原酶 B 急性分离的大鼠心室肌细胞，研究了牛黄酸和二甲基-氨氯吡咪对心肌细胞膜 Na+/Ca2+交换电流的影响。结果表明，10 μmol, 20 μmol 和 40 μmol 的二甲基-氨氯吡咪可使 Ni2+ 敏感电流浓度依赖性地增加；膜电位为 +50 mV 时分别增加 (27±7)%，(121±43)%，和 (173±68)%；膜电位为 -100 mV 时分别增加(110±52)%，(221±88)%和(281±80)%。牛黄酸对 Na+/Ca2+交换的内向和外向电流均无影响。
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中图分类号： R331.3+8 文献标识码： A
文章编号： 1007-6611(2000)01-0001-03
Effects of 5-(N,N-dimethyl)-amiloride (DMA) and taurine on Na+/Ca2+ exchange current in rat ventricular myocytes
Wu Dongmei， Lü Jiyuan， Wu Bowei
(Dept.of Physiology,Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
Abstract： Using the whole cell patch-clamp technique to study effects of taurine and 5-(N,N-dimethyl)-amiloride (DMA) on Na+/Ca2+ exchange current in rat ventricular myocytes. The results showed that at membrane potential of +50 mV and -100 mV, DMA 10 μmol, 20 μmol and 40 μmol increased the Ni2+-sensitive current by (27±7)%，(121±43)%，(173±68)%；and (110±52)%,(221±88)%,(281±80)%,respectively.DMA increases the Na+/Ca2+ exchange current in a dose-dependent manner while taurine has no effect on Na+/Ca2+ exchange current.
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Key words： 5-(N,N-dimethy1)-amiloride; taurine; patch clamp technique; myocardium; Na+/Ca2+ exchange current
目前研究表明，心肌缺血再灌注损伤的中心环节和最终的共同通路是钙超载，而大量的实验研究证明钙超载的形成涉及 Na+/Ca2+ 交换[1]，而Na+/Ca2+交换体在调节心室肌细胞钙转运中起着非常重要的作用[2]。该电流呈双向性，不仅排出在兴奋-收缩偶联时经钙通道进入细胞的钙，而且还转运钙进入细胞内，激活肌浆网的释放钙反应，进而触发兴奋-收缩偶联[3]。Na+/H+交换抑制剂 DMA 可改善缺血后心缩力的恢复，保护细胞微结构的完整性，减少 Na+ 和 Ca2+ 的超载，对心肌缺血再灌注损伤有保护作用[4]。牛黄酸是目前研究较多的一种内源性细胞保护物质，已有大量报道说明牛黄酸具有多方面的抗缺血再灌注损伤的作用[5]，我室在这方面也做了系列工作，证明 DMA 合用牛黄酸在离体心脏灌流中可显著减轻心肌缺血再灌注损伤(未发表)。但详细机制还不十分清楚。为了深入研究它们的作用机制，本工作利用膜片钳全细胞记录方式，观察这两种药物对Na+/Ca2+交换电流的影响。
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1 材料和方法
1.1 单个心室肌细胞制备 实验选用大鼠，体重 200～250 g，雌雄不拘。经 Langendorff 灌流心脏，采用胶原酶(collegnase B, Boehringer Mannheim;0.3 g/L 德国)和高钾 KB 液保护的分离技术[6]，制备单个心室肌细胞。
1.2 全细胞膜片钳技术 应用全细胞钳制方法记录膜电流，使用膜片钳放大器(Axopatch 200A,Axon instruments, Inc. 美国)和 PCLAMP 5.51 微机程序，细胞封接在倒置显微镜(XDP-1，上海光学仪器厂)及与其相联的微操纵器(MO-203，Narishige Co., Japan)上进行。电极阻抗为 2～3 MΩ，测定钠/钙交换电流时细胞外灌流液加入 Nicardipine 1 μmol，哇巴因 20 μmol，BaCl2 1 μmol，分别阻断钙通道，Na+/K+ 泵和内向整流钾通道；电极内液加入四乙胺阻断其他钾通道。
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1.3 溶液 台氏液成分(mmol/L)：NaCl 135.0，KCl 5.4, CaCl2 1.8,MgCl2 1.0,NaH2PO4 0.33，HEPES 10 和萄葡糖10，用 NaOH 调酸度至 pH 7.4。无钙台氏液除不含CaCl2外，其余与台氏液成分相同。电极内液成分(mmol/L)：KCl 140.0，HEPES 5.0， EGTA 10.0，Na2ATP 2.0，MgCl2 1.0，用 KOH 调酸度至 pH 7.3。KB 液成分 (mmol/L)：KOH 85，L-天冬氨酸 50.0，KCl 30.0，牛黄酸 20.0，KH2PO2 30.0, MgCl2 1.0，HEPES 10.0，葡萄糖 10.0 和EGTA 0.5。用 KOH 调酸度至 pH 7.4。
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A a.对照； b.40 μmol/L DMA; c.5mmol/L NiCl2
B a-c.Ni2+敏感Na+/Ca2+交换电流；b-c.DMA增强Na+/Ca2+交换电流
图1 二甲基-氨氯吡咪(DMA)对大鼠心室肌细胞
Na+/Ca2+ 交换电流的影响
1.4 试剂 牛黄酸，二甲基-氨氯吡咪(DMA)，哇巴因，四乙胺和氢氧化铯均为 Sigma 产品；尼卡地平来自 Ludwing-Shafen (德国)；其他试剂为国产分析纯产品。
1.5 统计 数据以均数±标准差(
±s)表示，采用配对t检验。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 Na+/Ca2+交换电流的测定 运用锯齿电压程序记录电流-电压关系曲线，维持电压 -40 mV，锯齿脉冲从 -120 mV 以 90 mV/s 的速率去极化至 +60 mV，刺激频率为 0.06 Hz。Ni2+可特异性地阻断 Na+/Ca2+交换电流，利用 Ni2+ 阻断前后的电流差，得到 Ni2+ 敏感电流即为 Na+/Ca2+ 交换电流[7](Fig.1B:a-c)。
2.2 牛黄酸和 DMA 对 Na+/Ca2+ 交换电流的作用 DMA 可剂量依赖性地增加大鼠心室肌细胞的 Na+/Ca2+ 交换电流，浓度为 10 μmol/L，20 μmol/L 和 40 μmol/L 的 DMA 平均使 Ni2+敏感外向电流从对照组的(63±18)pA 分别增加到 (80±26)，(113±19)和(163±22)pA，内向电流从对照组的 125±27 pA 分别增中到(252±22)，(383±21) 和 (445±27)pA(图1，表1)。牛黄酸对 Na+/Ca2+ 交换电流无影响(P>0.05)。
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表1 二甲基-氨氯吡咪(DMA)和牛黄酸对大鼠心室肌细胞 Na+/Ca2+交换电流的影响 组别
n
膜电流(pA)
+50 mV
变化百分率(%)
膜电流(pA)
-100 mV
变化百分率(%)
给药前
给药后
给药前
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给药后
DMA 组
(μmol/L)
10
4
63±18
80±26
27±7
125±27
252±22*
110±52
20
4
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63±18
133±19*
121±43
125±27
383±21*
221±88
40
4
63±18
163±22*
173±68
125±27
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445±27*
281±80
牛黄酸组
(mmol/L)
20
4
65±19
68±21
2.8±1.4
130±71
132±75
1.1±0.8
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对照组∶给药前； 给药后∶对照组 *P<0.01
3 讨论
本实验首次证明 DMA 对大鼠心肌细胞的钠钙交换有激动作用。内向电流显著大于外内向电流。增强内向电流可使 Ca2+ 通过钠/钙交换系统外排加强，进一步降低细胞内 Ca2+ 浓度，使舒张更彻底。刺激外向电流，通过钠/钙交换进入心肌内的 Ca2+增加，激发肌浆网释放更多 Ca2+，从而使收缩加强。DMA 为内向电流的作用更显著，10 μmol 可使内向电流绝对值增加 127 pA,而使外向电流的绝对值仅增加 17 pA,说明 DMA 可降低细胞内 Ca2+浓度，使舒张得到加强。牛黄酸对大鼠心室肌细胞 Na+/Ca2+ 交换电流无作用。
作者简介： 武冬梅，女，1952年11月生，博士，副教授
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参考文献：
[1] Mary LLM,Sanjiv M, Li GH, Marris K. Sodium-hydrogen exchange inhibitors improve postischemic recovery of function in the perfused rabbit heart[J]. Cardiovasc Res, 1995, 29: 209～214.
[2] Reeves JP. Cardiac sodium-calcium exchange system.In:Spere laik N,ed. Physiology and Pathophysiology of the heart[M]. 3th ed. Boston: Kluger Academic Publ, 1995. 315～317.
[3] Schulze D, Kofuji P,Hadley R, et al.Sodium/calcium exchanger in heart muscle: molecular biology, cellular function, and its special role in excitation-contraction coupling[J]. Cardiovasc Res, 1993, 27: 1726～1734.
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[4] Meng H, Pierce GN. Protective effects of 5-(N,N-dimethy1)-amiloride on ischemia-reperfusion injury in hearts[J]. Am J Physiol 1990, 258(Heart Circ Physiol 27) H 1615～1619.
[5] 石湘云，姚松朝. 牛磺酸的心肌保护作用[J].中国药学通报, 1995, 11 (2): 106～109.
[6] Mubagwa K, Stang1 M, Flameng W. Extracellular divalent cations block an action-nonselective conductance unrelated to calcium channels in cardiac cells[J]. J Physiol(Lond),1997,502: 235～237.
[7] Ehara T, Matsuoka S, Noma A. Measurement of reversal potential of Na+/Ca2+ exchange current in single guinea-pig ventricular cells[J]. J Physiol (Lond) 1989, 410: 227～249.
[收稿日期： 1999-10-08], http://www.100md.com