肿瘤坏死因子基因和蛋白及受体在子宫内膜组织的表达
作者：丁守怡 吴 荣 纪祥瑞 朱宗令 赵文翠
单位：青岛医学院(青岛 266021)；丁守怡 吴 荣 纪祥瑞 朱宗令 病理学教研室；赵文翠 附属医院妇产科
关键词：肿瘤坏死因子；子宫肿瘤；杂交；免疫组织化学
青岛医学院学报990104 【摘要】 ①目的 探讨子宫内膜癌组织肿瘤坏死因子(TNF)基因和蛋白及受体的表达及意义。②方法 分别采用非同位素原位杂交方法、免疫组化方法对48例子宫内膜癌组织TNF mRNA, TNF蛋白及TNF受体(TNFR)的表达进行检测。③结果 子宫内膜癌组织中16例TNF mRNA呈阳性表达,均为间质的单个核细胞和平滑肌细胞,腺癌细胞无阳性表达,对照组未见阳性表达。15例病人TNF蛋白呈阳性表达，25例TNFR呈阳性表达，对照组子宫内膜腺体也有TNFR阳性表达，两组比较差异无显著性(χ2=2.45, P>0.05)。TNF mRNA与TNF蛋白表达存在不一致性,TNF与TNFR表达与组织学分化及肌层浸润深度差异均无显著性(χ2=2.17, 0.81，P>0.05);TNFR蛋白表达明显高于TNF，两者比较差异有极显著性(χ2=4.29, P<0.05)； TNFR在正常内膜表达与子宫内膜癌表达差异无显著性(χ2=2.45,P>0.05)。④结论 子宫内膜癌间质细胞能够表达TNF mRNA，并产生TNF蛋白。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R737.33
EXPRESSIONS OF GENE, PROTEIN AND RECEPTOR PROTEIN OF TUMOR NECROSIS FACTOR IN ENDOMETRIAL TISSUES
Ding Shouyi,Wu Rong,Ji Xiangrui，et al
Department of Pathology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To observe the expressions and distributions of tumor necrosis factor (TNF) mRNA, TNF protien and TNF receptor(TNFR) in endometrial carcinomas and investigate their clinicopathological significance. Methods The expressions of TNF mRNA, TNF protein and TNFR in 48 cases of endometrial carcinoma were studied by in situ hybridization and immunohistochemical techniques. Results TNF mRNA expression was detected in the stroma such as mononuclear cells and smooth muscles in 16 cases of endometrial carcinoma. There was no TNF mRNA expression in the carcinoma cells and controls. TNF protein was positive in 15 cases of endometrial carcinoma. TNFR expression was detected both in endometrial carcinomas(25 cases) and controls(18 cases), the differences was not significant (χ2=2.45, P>0.05). The expressions of TNF and TNFR in cases of different histologic grades and depth of invasion were not significantly different(χ2=2.17, P>0.05). TNFR expression in endometrial carcinoma was higher than that of TNF(χ2=4.29, P<0.05). The expression of TNFR in normal endometrium and endometrial carcinoma was not significantly defferent(χ2=2.45, P>0.05). Conclusion The stroma cells in endometrial carcinoma were capable of expressing TNF mRNA and producing TNF protein.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 tumor necrosis factor; endometrial carcinoma; hybridization; immunohistochemistry
随着分子生物学的发展,肿瘤坏死因子(TNF) 基因治疗正从实验室走向临床, TNF基因转染的肿瘤细胞体内免疫后均能诱导出一定程度的抗肿瘤免疫反应。TNF对肿瘤生长兼有正负调控的功能,可能与细胞 TNF基因表达及受体等因素有关〔1〕。本文对48例子宫内膜癌进行了TNF mRNA, TNF蛋白产物及受体 (TNFR)蛋白表达的检测 ,以探讨其临床病理意义。
1 材料与方法
1.1 材料
收集我院1991～1994年间妇科手术切除、常规石蜡包埋的48例子宫内膜癌组织切片。另选择正常增殖期内膜 7例、分泌期内膜10例、子宫肌腺病10例标本为对照组。子宫内膜癌病人年龄为34～73岁，平均56岁。病理分型为腺癌45例，腺鳞癌2例，透明细胞癌1例。组织学分级为高分化12例，中分化20例，低分化16例 ,其中21例侵及浅肌层 ,27例侵及深肌层。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 原位杂交 TNF探针为长度1 000 bp的纯化DNA，通过对含TNF cDNA的质粒pGEM3(Promega)常规扩增及酶切(EcoR I)而得。在T7RNA多聚酶作用下,从启动子部位开始以cDNA为模板进行体外转录制成地高辛(Dip)标记的TNF-RNA探针。SP6多聚酶作为对照。组织标本按照常规方法脱蜡入水,蛋白酶K(25mg/L)消化15min,PBS冲洗后,干燥备用。将探针杂交液滴在标本上,加盖硅化的盖玻片,周围以液体石蜡封片, 45℃温箱过夜。SSC/SDS多次反复冲洗。加入碱性磷酸酶(AP)结合的抗体复合物(抗Dig-AP)单抗(1∶300)37℃温育30 min. Tris缓冲液(pH9.5)冲洗，加显色剂NBT/BCIP,室温下显色后流水冲洗。
1.2.2 免疫组化检测 使用LSAB法检测特异性TNF蛋白及受体。抗人TNF单抗购自Boehringer Mannheim公司,稀释度1∶100；抗人TNFR单抗购自R&D公司,稀释度1∶100.LSAB为DAKO公司产品,稀释度1∶100,显色剂为DAB.
, 百拇医药
2 结 果
在48例子宫内膜癌病人组织中,未见有TNF mRNA表达,16例组织中间质部分单个核细胞和平滑肌细胞呈阳性表达。对照组均呈阴性。TNF蛋白位于细胞浆内,阳性细胞整个细胞均染成棕黄色。TNF蛋白阳性表达细胞呈片状或散在分布。48例子宫内膜癌中,15例TNF蛋白呈阳性表达。对照组均呈阴性。6例TNF mRNA阳性表达而TNF蛋白阴性表达,5例TNF mRNA未见表达而TNF蛋白为阳性表达。
TNFR蛋白均位于细胞膜上,阳性细胞呈片状或散在分布,48例子宫内膜癌中有25例阳性表达,对照组阳性表达18例。子宫内膜癌与对照组TNFR表达无显著性差异(χ2=2.45,P>0.05)。TNF及TNFR在不同组织学分化程度组织和不同浸润深度组织表达差异无显著性。子宫内膜癌TNF表达15例,TNFR蛋白表达25例,两者比较差异有显著性(χ2=4.29,P<0.05)。见表1，2.
, 百拇医药
表1 TNF,TNFR表达与子宫内膜癌组织分化的关系 组织分化
n
TNF
TNFR
阳性
阴性
阳性
阴性
高
12
5
7
6
, 百拇医药
6
中
20
9
11
14
6
低
16
3
13
5
11
表2 TNF，TNFR表达与子宫内膜癌肌层浸润的关系 浸润深度
, 百拇医药
n
TNF
TNFR
阳性
阴性
阳性
阴性
浅肌层
21
8
13
14
7
深肌层
, 百拇医药
27
7
20
11
16
3 讨 论
研究表明,TNF表达与临床分期、淋巴细胞浸润程度、肿瘤的坏死程度均无明显关系〔2〕。间质中表达TNF的细胞为
细胞〔3〕。Beissert等〔4〕对结直肠癌的研究发现，TNF mRNA阳性主要见于浸润性单个核细胞,仅0.3%的细胞免疫组化TNF蛋白呈阳性表达。且转染TNF基因的仓鼠卵巢细胞在裸鼠体内能促使肿瘤细胞浸润,并使其转移能力增加〔5〕。但其机制极为复杂,有关的组织学检查可显示血管和结缔组织增生。Spriggs等〔6〕对传代的上皮性瘤细胞系进行TNF的表达,14个细胞系中11个对TNF的生长抑制作用不敏感,其中3个细胞系可表达TNF mRNA,但在使用蛋白合成抑制物时,则均能表达TNF mRNA.我们以往的研究结果显示,宫颈上皮肉瘤变组织TNF mRNA呈阳性表达,上皮和间质细胞均为TNF形成细胞。本文结果显示子宫内膜癌细胞无TNF mRNA表达,仅部分间质细胞有表达,少数病人有基因表达而无蛋白表达,或有蛋白表达而无基因表达,提示基因激活、信使转录、蛋白合成的过程中可能有多种调控机制存在,同时也提示TNF对子宫内膜癌可能具有抗瘤作用。
, http://www.100md.com
研究表明,卵巢癌细胞系能表达TNFR,TNF介导的细胞溶解与TNFR的存在有关〔8〕。TNF的敏感性与靶细胞表面TNFR的质和量有关。TNF发挥生物学效应时必须先与靶细胞上的TNFR结合。TNFR存在于多种正常细胞及肿瘤细胞表面。不同类型的细胞,在体外受刺激后均可表达TNFR.TNFR可能与TNF上第11～20位和第121～126位的氨基酸残基部位结合。FNF与TNFR有较高的结合力,一般每个细胞TNFR数目为1 000～10 000.不同细胞表面TNFR的数目和亲和力有很大差异,而且细胞上受体数目与该细胞对TNF的敏感性不呈平行关系。TNF与受体结合后信号传递的机理尚不清楚,可能与活性蛋白激酶C催化受体蛋白磷酸化有关〔9〕。但本文结果表明，TNFR在正常内膜中表达与子宫内膜癌无显著性差异,尚需进一步研究。
本文为卫生部科研基金资助课题(批准号：94-1-341)参考文献
1 Kronke M, Schurich P. Tumor necrosis factor: signal transduction and TNF-responsive genes. In: Aggarwal BB, Vilcek J, ed.Tumor necrosis factor: structure, function and mechanism of action. New York: Marcel Dekker Publishers, 1991.189～216
, 百拇医药
2 Naylor MS, Stamp GWH, Balkwill VR. Investigation of cytokine gene expression in human colorectal cancer. Cancer Res,1990,50:4436
3 Naylor MS,Malik STA,Stampt GWH,et al.In situ detection of tumor necrosis factor in human ovarian cancer specimens. Eur J Cancer,1990,26:1027
4 Beissert S, Bergholz M, Waase I, et al. Regulation of tumor necrosis factor gene expression in colorectal adenocarcinoma:in vivo analysis by in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:5064
, 百拇医药
5 Malik STA, Naylor MS, East N, et al. Cells secreting tumor necrosis factor show enhanced metastasis in nude mice. Eur J Cancer,1990,26:1031
6 Spriggs DR,Imamura K, Rodriguez C, et al. Tumor necrosis factor expression in human epithelial tumor cell lines. J Clin Invest, 1988,81:455
7 吴 荣,Coleman N, Stanley M. 肿瘤坏死因子在子宫颈细胞及组织的定位表达.中华妇产科杂志,1995,30:693
8 Kost ED,Herzog TJ,Adler LM, et al. The role of tumor necrosis factor receptors in tumor necrosis factor-α-mediated cytolysis of ovarian cancer cell lines. Am J Obstet Gynecol,1996,174:145
9 Tartaglia LA,Goeddel DV. Two TNF receptors. Immuno Today, 1992,13:151
(1998-03-05收稿 1998-12-20修回), http://www.100md.com
单位：青岛医学院(青岛 266021)；丁守怡 吴 荣 纪祥瑞 朱宗令 病理学教研室；赵文翠 附属医院妇产科
关键词：肿瘤坏死因子；子宫肿瘤；杂交；免疫组织化学
青岛医学院学报990104 【摘要】 ①目的 探讨子宫内膜癌组织肿瘤坏死因子(TNF)基因和蛋白及受体的表达及意义。②方法 分别采用非同位素原位杂交方法、免疫组化方法对48例子宫内膜癌组织TNF mRNA, TNF蛋白及TNF受体(TNFR)的表达进行检测。③结果 子宫内膜癌组织中16例TNF mRNA呈阳性表达,均为间质的单个核细胞和平滑肌细胞,腺癌细胞无阳性表达,对照组未见阳性表达。15例病人TNF蛋白呈阳性表达，25例TNFR呈阳性表达，对照组子宫内膜腺体也有TNFR阳性表达，两组比较差异无显著性(χ2=2.45, P>0.05)。TNF mRNA与TNF蛋白表达存在不一致性,TNF与TNFR表达与组织学分化及肌层浸润深度差异均无显著性(χ2=2.17, 0.81，P>0.05);TNFR蛋白表达明显高于TNF，两者比较差异有极显著性(χ2=4.29, P<0.05)； TNFR在正常内膜表达与子宫内膜癌表达差异无显著性(χ2=2.45,P>0.05)。④结论 子宫内膜癌间质细胞能够表达TNF mRNA，并产生TNF蛋白。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R737.33
EXPRESSIONS OF GENE, PROTEIN AND RECEPTOR PROTEIN OF TUMOR NECROSIS FACTOR IN ENDOMETRIAL TISSUES
Ding Shouyi,Wu Rong,Ji Xiangrui，et al
Department of Pathology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To observe the expressions and distributions of tumor necrosis factor (TNF) mRNA, TNF protien and TNF receptor(TNFR) in endometrial carcinomas and investigate their clinicopathological significance. Methods The expressions of TNF mRNA, TNF protein and TNFR in 48 cases of endometrial carcinoma were studied by in situ hybridization and immunohistochemical techniques. Results TNF mRNA expression was detected in the stroma such as mononuclear cells and smooth muscles in 16 cases of endometrial carcinoma. There was no TNF mRNA expression in the carcinoma cells and controls. TNF protein was positive in 15 cases of endometrial carcinoma. TNFR expression was detected both in endometrial carcinomas(25 cases) and controls(18 cases), the differences was not significant (χ2=2.45, P>0.05). The expressions of TNF and TNFR in cases of different histologic grades and depth of invasion were not significantly different(χ2=2.17, P>0.05). TNFR expression in endometrial carcinoma was higher than that of TNF(χ2=4.29, P<0.05). The expression of TNFR in normal endometrium and endometrial carcinoma was not significantly defferent(χ2=2.45, P>0.05). Conclusion The stroma cells in endometrial carcinoma were capable of expressing TNF mRNA and producing TNF protein.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 tumor necrosis factor; endometrial carcinoma; hybridization; immunohistochemistry
随着分子生物学的发展,肿瘤坏死因子(TNF) 基因治疗正从实验室走向临床, TNF基因转染的肿瘤细胞体内免疫后均能诱导出一定程度的抗肿瘤免疫反应。TNF对肿瘤生长兼有正负调控的功能,可能与细胞 TNF基因表达及受体等因素有关〔1〕。本文对48例子宫内膜癌进行了TNF mRNA, TNF蛋白产物及受体 (TNFR)蛋白表达的检测 ,以探讨其临床病理意义。
1 材料与方法
1.1 材料
收集我院1991～1994年间妇科手术切除、常规石蜡包埋的48例子宫内膜癌组织切片。另选择正常增殖期内膜 7例、分泌期内膜10例、子宫肌腺病10例标本为对照组。子宫内膜癌病人年龄为34～73岁，平均56岁。病理分型为腺癌45例，腺鳞癌2例，透明细胞癌1例。组织学分级为高分化12例，中分化20例，低分化16例 ,其中21例侵及浅肌层 ,27例侵及深肌层。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 原位杂交 TNF探针为长度1 000 bp的纯化DNA，通过对含TNF cDNA的质粒pGEM3(Promega)常规扩增及酶切(EcoR I)而得。在T7RNA多聚酶作用下,从启动子部位开始以cDNA为模板进行体外转录制成地高辛(Dip)标记的TNF-RNA探针。SP6多聚酶作为对照。组织标本按照常规方法脱蜡入水,蛋白酶K(25mg/L)消化15min,PBS冲洗后,干燥备用。将探针杂交液滴在标本上,加盖硅化的盖玻片,周围以液体石蜡封片, 45℃温箱过夜。SSC/SDS多次反复冲洗。加入碱性磷酸酶(AP)结合的抗体复合物(抗Dig-AP)单抗(1∶300)37℃温育30 min. Tris缓冲液(pH9.5)冲洗，加显色剂NBT/BCIP,室温下显色后流水冲洗。
1.2.2 免疫组化检测 使用LSAB法检测特异性TNF蛋白及受体。抗人TNF单抗购自Boehringer Mannheim公司,稀释度1∶100；抗人TNFR单抗购自R&D公司,稀释度1∶100.LSAB为DAKO公司产品,稀释度1∶100,显色剂为DAB.
, 百拇医药
2 结 果
在48例子宫内膜癌病人组织中,未见有TNF mRNA表达,16例组织中间质部分单个核细胞和平滑肌细胞呈阳性表达。对照组均呈阴性。TNF蛋白位于细胞浆内,阳性细胞整个细胞均染成棕黄色。TNF蛋白阳性表达细胞呈片状或散在分布。48例子宫内膜癌中,15例TNF蛋白呈阳性表达。对照组均呈阴性。6例TNF mRNA阳性表达而TNF蛋白阴性表达,5例TNF mRNA未见表达而TNF蛋白为阳性表达。
TNFR蛋白均位于细胞膜上,阳性细胞呈片状或散在分布,48例子宫内膜癌中有25例阳性表达,对照组阳性表达18例。子宫内膜癌与对照组TNFR表达无显著性差异(χ2=2.45,P>0.05)。TNF及TNFR在不同组织学分化程度组织和不同浸润深度组织表达差异无显著性。子宫内膜癌TNF表达15例,TNFR蛋白表达25例,两者比较差异有显著性(χ2=4.29,P<0.05)。见表1，2.
, 百拇医药
表1 TNF,TNFR表达与子宫内膜癌组织分化的关系 组织分化
n
TNF
TNFR
阳性
阴性
阳性
阴性
高
12
5
7
6
, 百拇医药
6
中
20
9
11
14
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低
16
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表2 TNF，TNFR表达与子宫内膜癌肌层浸润的关系 浸润深度
, 百拇医药
n
TNF
TNFR
阳性
阴性
阳性
阴性
浅肌层
21
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深肌层
, 百拇医药
27
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16
3 讨 论
研究表明,TNF表达与临床分期、淋巴细胞浸润程度、肿瘤的坏死程度均无明显关系〔2〕。间质中表达TNF的细胞为
细胞〔3〕。Beissert等〔4〕对结直肠癌的研究发现，TNF mRNA阳性主要见于浸润性单个核细胞,仅0.3%的细胞免疫组化TNF蛋白呈阳性表达。且转染TNF基因的仓鼠卵巢细胞在裸鼠体内能促使肿瘤细胞浸润,并使其转移能力增加〔5〕。但其机制极为复杂,有关的组织学检查可显示血管和结缔组织增生。Spriggs等〔6〕对传代的上皮性瘤细胞系进行TNF的表达,14个细胞系中11个对TNF的生长抑制作用不敏感,其中3个细胞系可表达TNF mRNA,但在使用蛋白合成抑制物时,则均能表达TNF mRNA.我们以往的研究结果显示,宫颈上皮肉瘤变组织TNF mRNA呈阳性表达,上皮和间质细胞均为TNF形成细胞。本文结果显示子宫内膜癌细胞无TNF mRNA表达,仅部分间质细胞有表达,少数病人有基因表达而无蛋白表达,或有蛋白表达而无基因表达,提示基因激活、信使转录、蛋白合成的过程中可能有多种调控机制存在,同时也提示TNF对子宫内膜癌可能具有抗瘤作用。, http://www.100md.com
研究表明,卵巢癌细胞系能表达TNFR,TNF介导的细胞溶解与TNFR的存在有关〔8〕。TNF的敏感性与靶细胞表面TNFR的质和量有关。TNF发挥生物学效应时必须先与靶细胞上的TNFR结合。TNFR存在于多种正常细胞及肿瘤细胞表面。不同类型的细胞,在体外受刺激后均可表达TNFR.TNFR可能与TNF上第11～20位和第121～126位的氨基酸残基部位结合。FNF与TNFR有较高的结合力,一般每个细胞TNFR数目为1 000～10 000.不同细胞表面TNFR的数目和亲和力有很大差异,而且细胞上受体数目与该细胞对TNF的敏感性不呈平行关系。TNF与受体结合后信号传递的机理尚不清楚,可能与活性蛋白激酶C催化受体蛋白磷酸化有关〔9〕。但本文结果表明，TNFR在正常内膜中表达与子宫内膜癌无显著性差异,尚需进一步研究。
本文为卫生部科研基金资助课题(批准号：94-1-341)参考文献
1 Kronke M, Schurich P. Tumor necrosis factor: signal transduction and TNF-responsive genes. In: Aggarwal BB, Vilcek J, ed.Tumor necrosis factor: structure, function and mechanism of action. New York: Marcel Dekker Publishers, 1991.189～216
, 百拇医药
2 Naylor MS, Stamp GWH, Balkwill VR. Investigation of cytokine gene expression in human colorectal cancer. Cancer Res,1990,50:4436
3 Naylor MS,Malik STA,Stampt GWH,et al.In situ detection of tumor necrosis factor in human ovarian cancer specimens. Eur J Cancer,1990,26:1027
4 Beissert S, Bergholz M, Waase I, et al. Regulation of tumor necrosis factor gene expression in colorectal adenocarcinoma:in vivo analysis by in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:5064
, 百拇医药
5 Malik STA, Naylor MS, East N, et al. Cells secreting tumor necrosis factor show enhanced metastasis in nude mice. Eur J Cancer,1990,26:1031
6 Spriggs DR,Imamura K, Rodriguez C, et al. Tumor necrosis factor expression in human epithelial tumor cell lines. J Clin Invest, 1988,81:455
7 吴 荣,Coleman N, Stanley M. 肿瘤坏死因子在子宫颈细胞及组织的定位表达.中华妇产科杂志,1995,30:693
8 Kost ED,Herzog TJ,Adler LM, et al. The role of tumor necrosis factor receptors in tumor necrosis factor-α-mediated cytolysis of ovarian cancer cell lines. Am J Obstet Gynecol,1996,174:145
9 Tartaglia LA,Goeddel DV. Two TNF receptors. Immuno Today, 1992,13:151
(1998-03-05收稿 1998-12-20修回), http://www.100md.com