抗供体移植物特异性抗体与肾移植排斥的相关性研究
作者：郝萍 唐睿珠 李继梅 陆信 郝青林
单位：(昆明医学院第一附属医院，昆明 650032)
关键词：HLAⅡ类抗体/抗移植物特异性抗体；肾移植；排斥反应；ELISA-L AT
昆明医学院学报000206 摘要：为探讨抗供体特异性抗体与同种异体肾移植间移植物排斥的关系 ， 用HLA位点氨基酸残基配对检测法(ELISA-LAT-M和ELISA-LAT-ID)，对166例血清分为AR，CR 和正常对照共3组进行筛选测定.按LAT酶联检测试剂盒要求操作，抗体特异性的确定根据阳 性结果的反应格局综合判断，结果显示抗HLAⅡ类IgG抗体阳性率分别为AR 38%，CR 37%，正 常2.3%(P<0.01).提示HLAⅡ类抗体与急、慢性排斥反应有明显相关性.进一步抗体定 位并与其错配位点比较，抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体阳性率AR 34%(9例移植物丢失) ，CR 64%(1例移植物丢失).提示抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体是影响移植物存活和排斥反 应的 重要因素，且可能在AR中起着更重要的作用.
, http://www.100md.com
中图分类号：Q 226 文献标识码：A 文章编号 ：1003-4706(2000)02-0022-04
Relevance of Donor-Specific Anti-HLA Antibodies
Following Renal Transplantation
HAO Ping，TANG Rui-zhu，LI Ji-mei，FENG Zhong-tang，LU Xin
(the First Affiliated Hospital of Kunming Medical Colle ge,Kunming 650031)
Abstract：To explore the correlation between the donor-specific an ti-HLA antibodies posttransplant and the incidence of both severe acute rejectio n and chronic rejection, we analyzed. sera in these groups of AR, CR and normal control by HLA antibodies specificity LAT-Mixed to determine the presence or abs ence of anti-HLA class I or class II antibodies of the IgG isotype. Of these 123 recipients, 46 (37%) had class II-directed Abs. Positive samples were reanalyze d by an LAT-Id to verify the presence and Donor-specificity of the antibody. All 11 of AR recipients experienced at least 9 grafts loss. All 14 with CR also had 9 (64%) class II donor-specific antibodies. The results suggest that this techn ique identifies recipients with class I or class II donor antigen-specific antib odies and are at the significantly higher risk for AR and CR.
, 百拇医药
Key words：HLA II antibody/donor-specific anti-HLA antibodies ；Renal transplantation；Rejection；ELISA-LAT
为进一步探讨抗供体特异性抗体与同种异体肾移植间移植物排斥的关系， 我 们用HLA位点氨基酸残基配对检测法(ELISA-LAT-M和ELISA-LAT-ID)，对上百例血清样品进行 了分析测定，现报道如下.
1 材料和方法
1.1 样本
血清样品166例，分为3组，包括肾移植后经活检确诊的急性排斥反应(acute rejection，AR ).患者血清85份、慢性排斥反应(chronic rejection，CR)患者血清38份 、正常对照(Norma l即Norm)血清43份.所有肾移植患者血清用抗人球蛋白法增加介导的补体依赖性细胞毒-群 体反应性抗体法测定(AHG-CDC-PRA)结果均为0%.且所有肾移植患者均为HLA-A，B，DR，DQ一 个以上错配.
, 百拇医药
1.2 HLA特异性抗体酶联检测试剂盒(ELISA-LAT-M.ELISA-LAT-ID Kit)
试剂盒由One Lambda公司提供，包括用于检测HLA-IgG抗体微板、阳性对照、阴性对照、酶 联检测所需试剂等.96孔分类微板每块可检测20份样本，每份样本包括4孔，每二孔分别被 高亲和纯度可溶性HLAⅠ类及Ⅱ类抗原包被.96孔定位微板可检测的特异性抗体包括A1～A80 共21个，B7～B82共41个，DR1～DR53共18个，DQ2～DQ9共7个.
1.3 测量方法
主要步骤包括：按1∶3用样本稀释液稀释血清样本(25 μL血清加50 μL稀释液)配制阳性对照和阴性对照； 每板分类微板第1排A～B和第2排C～E加阴性对照，第一排C～H加阳性对照并保留第2排A～B 及F～H为空白.其他3～12排加样本、室温反应1 h后洗板，再加交 联液，室温40 min，洗板.最后加入底物，避光显色，12 min后终止反应.自动微板读数仪LA T-MTM程序读数.对HLA-Ⅰ类及Ⅱ类抗体阳性结果血清将按1∶3(275 μL血清+550 μL 稀释液)稀释并进一步检测其特异性抗体，方法与分类检测相同，仅终止反应后用LAT-1260 程序读数，波长480～630 nm.
, 百拇医药
1.4 结果判断(根据试剂盒规定)
(1)有效测量判断：①每孔阳性对照(PR)必须≥2.0，每孔阴性对照(NR)必须<1.0，计 算6 个阳性对照的平均值(MPR)必须大于或等于10.0；②计算阈值(cut-off)=MPR×0.45；③计 算每份样本每孔的△值=每孔A值-空白孔的平均A值.
(2)阳性、阴性结果判断：如△值大于阈值，此孔含HLA-IgG抗体，如△值小于阈值，此孔不 含IgG抗体.
(3)致敏程度判断：PRA(%)=阳性结果孔数÷80×100%.PRA<10%为阴性，11%～20%为弱阳性 或阴性，21%～50%为阳性，51%～80%强阳性，81～100为极强阳性.
(4)抗体特异性判断：根据阳性结果所在孔的分布格局综合判断抗体的特异性.根据其HLA错 配位点以确认是否为抗移植物特异性抗体.
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2 结果
2.1 正常人血清测定结果
43份正常血清HLA抗体分类测定Ⅰ类抗体IgG全部阴性，Ⅱ类抗体1例阳性，(Norm.=2.3%)但 未检出抗HLA特异性抗体.
2.2 患者血清测定结果
在所测定的123例肾移植患者血清中仅有2例HLA-IgGⅠ类抗体阳性(AR=2.3%)，且其中1例HL A-IgGⅠ类及Ⅱ类抗体均为阳性.2例Ⅰ类抗体阳性者均未检出Ⅰ类特异性抗体.
急性排斥反应患者血清(n=85)，其中32例HLA-IgGⅡ类抗体强阳性及以上(AR=38%)，慢 性 排斥反应患者血清(N=38)，有14例HLA-IgGⅡ类抗体强阳性或极强阳性(CR=37%).两者与正常 对照比较有显著差异(P<0.01)，对HLA-IgGⅡ类抗体强阳性样品(n=46)，行特异 性抗体定位测定，结果见表1.
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表1 急、慢性排斥患者HLAⅡ类-IgG抗体测定 组别
检测例数
HLA Ⅱ 类抗体
阳性例数
阳性率
AR
85
32
38%**
CR
38
14
, 百拇医药
37%**
正常对照
43
1
2.3%
**P<0.01，与正常对照比较.
所有经特异性抗体定位测定的患者，HLA-IgGⅡ类抗体强阳性血情中均100%检测出不同程度 表达HLA-DR及DQ特异性抗体，进一步与其错配位点比较，抗移植物特异性抗体检出率AR为34 %，CR为64%，见表2.
表2 HLAⅡ类抗体阳性患者抗移植物特异性HLA-IgG抗体检测 组别
检测例数
, http://www.100md.com
抗移植 物特异性
抗体阳性例数
阳性率
AR
32
11
34%
CR
14
9
64%
3 讨论
尽管HLA同种抗原诱导潜在抗体反应以及抗HLA抗体在急慢性排斥反应中的角色地位仍有争论 ，但高滴度抗移植物特异性HLA IgG抗体将导致移植物早期丢失已有明确定论[1～3] ，并且这类IgG抗体及同种IgM自身抗体危险性也与其滴度水平呈正比[4～6]，最近 研究表明抗HLAⅡ类特异性抗体与移植物排斥密切相关，单纯抗HLAⅡ类抗体阳性者较抗HLA Ⅰ类及Ⅱ类抗体均阴性者移植物丢失率高出30%[7～9].
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本文研究结果表明：HLAⅡ类抗体在CR及AR患者中的阳性检出率(37%，38%)远远高于正常对 照组(2.3%)(P<0.01)，提示HLAⅡ类抗体与急、慢性排斥反应有明显相关性.HLAⅡ 类抗原是HLA家族中最为复杂及最具多态性的基因区，由于其在细胞因子或其它因素刺激下 可 以诱导出异常组织表达[10]，使得HLAⅡ类特异性抗体在移植物存活中占有举足轻 重的地位[9].本文报道的11例抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体阳性的AR患者中， 有9例因移植肾失功恢复血透，而9例抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体阳性的CR患者，仅1例 移 植物丢失再血透，这些结果提示抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体是影响移植物存活和排斥反 应的重要因素，且可能在AR中起着更重要的作用.值得一提的是，本实验中所有AR和CR患者 抗 移植物特异性HLAⅠ类IgG抗体检出率均为0，AR患者的抗移植物特异性Ⅱ类抗体检出率较CR 患者低.我们认为可能因AR患者正处于OKT3治疗期间，CD3McAb通过与CD3分子结合占 据TCR 部分区域而有效地阻断T细胞正常信号的诱导，导致T细胞“失活”而“无能”，便难以检出 可测定水平的抗体.CR患者抗移植物特异抗体阳性率64%略低于有关报道[11]，可 能因患者均不同程度使用过FK506，抑制T辅助细胞(ThC)从而间接抑制抗体分泌，故未能被 检出.
, 百拇医药
基金项目：中美科技协作基金资助(UCST99867)
作者简介：郝萍(1958～)，女，医学学士，主治医师，主要从事肿瘤免疫及遗传免 疫学研究.
参 考 文 献
[1] PATEL R,TERASAKI P I.Significance of the positive crosshatch test in kidney transplantation[J].N Eng1 J Med,1969,280:737
[2] WILLIAMS G M,HUME D M,HUDSON R P,et al.Hyperacute renal homograft rejection in man[J].N Eng1 J Med,1968,279:611
[3] SORNIK J C,LEFOR W M,CICCIARELLI J C,et al.Hyperacute and acute ki d ney graft rejection dut to antibodies against B cells[J].Tranplantation,1992,5 4:61
, 百拇医药
[4] BRYAN C F,AEDER M I,HELLING T S,et al.Clinical relevance of a posi tive B-cell crosshatch on renal transplantation:a multi-transplant center evalua tion[J].Transplant Proc,1993,25:247
[5] OGURA K,TERASAKI P I,JOHNSON C,et al.The significance of a positiv e flow cytometry crosshatch test in primary[J].Kidney Transplantation,1993,56: 294
[6] TERHOOR G M,COOPMANS M,ALLELES W A.Specificity and Ig class of pr eformed alloantibodies causing a positive crosshatch in renal transplantation:Th e implications for graft survival[J].Transplantation,1993,56:298
, 百拇医药
[7] Lederer S R,Schneeberger H,Albert E,et al.Early renal graft dysfun citon[J].Transplantation,1996,61:313
[8] KOTB M,RUSSEL W,OHMAN M,et al.Clinical implications of flow c ytome try B cell crosshatching in renal transplantation[J].Transplant Proc,1997,29:1 430
[9] WORTHINGTON J E,LAUGHTON A,LIGGETT H,et al.A novel strategy for th r detection and definition of HLA-specific antibodies in patients awaiting renal transplantation[J].Transpl ant,1998,11(Suppl.1):S372
[10] 陈实主编.移植免疫学[M].武汉：湖北科学技术出版社，1998.41～41
[11] PAUL TERASAKI.Increasd risk of acutc and chronic rejection in sen sitized kidney recipients with HLA class Ⅱ-disedted donor antigen-specific ant ibodies[J].Unos,1999,84(9):3575
(2000-03-10收稿), 百拇医药
单位：(昆明医学院第一附属医院，昆明 650032)
关键词：HLAⅡ类抗体/抗移植物特异性抗体；肾移植；排斥反应；ELISA-L AT
昆明医学院学报000206 摘要：为探讨抗供体特异性抗体与同种异体肾移植间移植物排斥的关系 ， 用HLA位点氨基酸残基配对检测法(ELISA-LAT-M和ELISA-LAT-ID)，对166例血清分为AR，CR 和正常对照共3组进行筛选测定.按LAT酶联检测试剂盒要求操作，抗体特异性的确定根据阳 性结果的反应格局综合判断，结果显示抗HLAⅡ类IgG抗体阳性率分别为AR 38%，CR 37%，正 常2.3%(P<0.01).提示HLAⅡ类抗体与急、慢性排斥反应有明显相关性.进一步抗体定 位并与其错配位点比较，抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体阳性率AR 34%(9例移植物丢失) ，CR 64%(1例移植物丢失).提示抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体是影响移植物存活和排斥反 应的 重要因素，且可能在AR中起着更重要的作用.
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中图分类号：Q 226 文献标识码：A 文章编号 ：1003-4706(2000)02-0022-04
Relevance of Donor-Specific Anti-HLA Antibodies
Following Renal Transplantation
HAO Ping，TANG Rui-zhu，LI Ji-mei，FENG Zhong-tang，LU Xin
(the First Affiliated Hospital of Kunming Medical Colle ge,Kunming 650031)
Abstract：To explore the correlation between the donor-specific an ti-HLA antibodies posttransplant and the incidence of both severe acute rejectio n and chronic rejection, we analyzed. sera in these groups of AR, CR and normal control by HLA antibodies specificity LAT-Mixed to determine the presence or abs ence of anti-HLA class I or class II antibodies of the IgG isotype. Of these 123 recipients, 46 (37%) had class II-directed Abs. Positive samples were reanalyze d by an LAT-Id to verify the presence and Donor-specificity of the antibody. All 11 of AR recipients experienced at least 9 grafts loss. All 14 with CR also had 9 (64%) class II donor-specific antibodies. The results suggest that this techn ique identifies recipients with class I or class II donor antigen-specific antib odies and are at the significantly higher risk for AR and CR.
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Key words：HLA II antibody/donor-specific anti-HLA antibodies ；Renal transplantation；Rejection；ELISA-LAT
为进一步探讨抗供体特异性抗体与同种异体肾移植间移植物排斥的关系， 我 们用HLA位点氨基酸残基配对检测法(ELISA-LAT-M和ELISA-LAT-ID)，对上百例血清样品进行 了分析测定，现报道如下.
1 材料和方法
1.1 样本
血清样品166例，分为3组，包括肾移植后经活检确诊的急性排斥反应(acute rejection，AR ).患者血清85份、慢性排斥反应(chronic rejection，CR)患者血清38份 、正常对照(Norma l即Norm)血清43份.所有肾移植患者血清用抗人球蛋白法增加介导的补体依赖性细胞毒-群 体反应性抗体法测定(AHG-CDC-PRA)结果均为0%.且所有肾移植患者均为HLA-A，B，DR，DQ一 个以上错配.
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1.2 HLA特异性抗体酶联检测试剂盒(ELISA-LAT-M.ELISA-LAT-ID Kit)
试剂盒由One Lambda公司提供，包括用于检测HLA-IgG抗体微板、阳性对照、阴性对照、酶 联检测所需试剂等.96孔分类微板每块可检测20份样本，每份样本包括4孔，每二孔分别被 高亲和纯度可溶性HLAⅠ类及Ⅱ类抗原包被.96孔定位微板可检测的特异性抗体包括A1～A80 共21个，B7～B82共41个，DR1～DR53共18个，DQ2～DQ9共7个.
1.3 测量方法
主要步骤包括：按1∶3用样本稀释液稀释血清样本(25 μL血清加50 μL稀释液)配制阳性对照和阴性对照； 每板分类微板第1排A～B和第2排C～E加阴性对照，第一排C～H加阳性对照并保留第2排A～B 及F～H为空白.其他3～12排加样本、室温反应1 h后洗板，再加交 联液，室温40 min，洗板.最后加入底物，避光显色，12 min后终止反应.自动微板读数仪LA T-MTM程序读数.对HLA-Ⅰ类及Ⅱ类抗体阳性结果血清将按1∶3(275 μL血清+550 μL 稀释液)稀释并进一步检测其特异性抗体，方法与分类检测相同，仅终止反应后用LAT-1260 程序读数，波长480～630 nm.
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1.4 结果判断(根据试剂盒规定)
(1)有效测量判断：①每孔阳性对照(PR)必须≥2.0，每孔阴性对照(NR)必须<1.0，计 算6 个阳性对照的平均值(MPR)必须大于或等于10.0；②计算阈值(cut-off)=MPR×0.45；③计 算每份样本每孔的△值=每孔A值-空白孔的平均A值.
(2)阳性、阴性结果判断：如△值大于阈值，此孔含HLA-IgG抗体，如△值小于阈值，此孔不 含IgG抗体.
(3)致敏程度判断：PRA(%)=阳性结果孔数÷80×100%.PRA<10%为阴性，11%～20%为弱阳性 或阴性，21%～50%为阳性，51%～80%强阳性，81～100为极强阳性.
(4)抗体特异性判断：根据阳性结果所在孔的分布格局综合判断抗体的特异性.根据其HLA错 配位点以确认是否为抗移植物特异性抗体.
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2 结果
2.1 正常人血清测定结果
43份正常血清HLA抗体分类测定Ⅰ类抗体IgG全部阴性，Ⅱ类抗体1例阳性，(Norm.=2.3%)但 未检出抗HLA特异性抗体.
2.2 患者血清测定结果
在所测定的123例肾移植患者血清中仅有2例HLA-IgGⅠ类抗体阳性(AR=2.3%)，且其中1例HL A-IgGⅠ类及Ⅱ类抗体均为阳性.2例Ⅰ类抗体阳性者均未检出Ⅰ类特异性抗体.
急性排斥反应患者血清(n=85)，其中32例HLA-IgGⅡ类抗体强阳性及以上(AR=38%)，慢 性 排斥反应患者血清(N=38)，有14例HLA-IgGⅡ类抗体强阳性或极强阳性(CR=37%).两者与正常 对照比较有显著差异(P<0.01)，对HLA-IgGⅡ类抗体强阳性样品(n=46)，行特异 性抗体定位测定，结果见表1.
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表1 急、慢性排斥患者HLAⅡ类-IgG抗体测定 组别
检测例数
HLA Ⅱ 类抗体
阳性例数
阳性率
AR
85
32
38%**
CR
38
14
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37%**
正常对照
43
1
2.3%
**P<0.01，与正常对照比较.
所有经特异性抗体定位测定的患者，HLA-IgGⅡ类抗体强阳性血情中均100%检测出不同程度 表达HLA-DR及DQ特异性抗体，进一步与其错配位点比较，抗移植物特异性抗体检出率AR为34 %，CR为64%，见表2.
表2 HLAⅡ类抗体阳性患者抗移植物特异性HLA-IgG抗体检测 组别
检测例数
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抗移植 物特异性
抗体阳性例数
阳性率
AR
32
11
34%
CR
14
9
64%
3 讨论
尽管HLA同种抗原诱导潜在抗体反应以及抗HLA抗体在急慢性排斥反应中的角色地位仍有争论 ，但高滴度抗移植物特异性HLA IgG抗体将导致移植物早期丢失已有明确定论[1～3] ，并且这类IgG抗体及同种IgM自身抗体危险性也与其滴度水平呈正比[4～6]，最近 研究表明抗HLAⅡ类特异性抗体与移植物排斥密切相关，单纯抗HLAⅡ类抗体阳性者较抗HLA Ⅰ类及Ⅱ类抗体均阴性者移植物丢失率高出30%[7～9].
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本文研究结果表明：HLAⅡ类抗体在CR及AR患者中的阳性检出率(37%，38%)远远高于正常对 照组(2.3%)(P<0.01)，提示HLAⅡ类抗体与急、慢性排斥反应有明显相关性.HLAⅡ 类抗原是HLA家族中最为复杂及最具多态性的基因区，由于其在细胞因子或其它因素刺激下 可 以诱导出异常组织表达[10]，使得HLAⅡ类特异性抗体在移植物存活中占有举足轻 重的地位[9].本文报道的11例抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体阳性的AR患者中， 有9例因移植肾失功恢复血透，而9例抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体阳性的CR患者，仅1例 移 植物丢失再血透，这些结果提示抗移植物特异性HLAⅡ类IgG抗体是影响移植物存活和排斥反 应的重要因素，且可能在AR中起着更重要的作用.值得一提的是，本实验中所有AR和CR患者 抗 移植物特异性HLAⅠ类IgG抗体检出率均为0，AR患者的抗移植物特异性Ⅱ类抗体检出率较CR 患者低.我们认为可能因AR患者正处于OKT3治疗期间，CD3McAb通过与CD3分子结合占 据TCR 部分区域而有效地阻断T细胞正常信号的诱导，导致T细胞“失活”而“无能”，便难以检出 可测定水平的抗体.CR患者抗移植物特异抗体阳性率64%略低于有关报道[11]，可 能因患者均不同程度使用过FK506，抑制T辅助细胞(ThC)从而间接抑制抗体分泌，故未能被 检出.
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基金项目：中美科技协作基金资助(UCST99867)
作者简介：郝萍(1958～)，女，医学学士，主治医师，主要从事肿瘤免疫及遗传免 疫学研究.
参 考 文 献
[1] PATEL R,TERASAKI P I.Significance of the positive crosshatch test in kidney transplantation[J].N Eng1 J Med,1969,280:737
[2] WILLIAMS G M,HUME D M,HUDSON R P,et al.Hyperacute renal homograft rejection in man[J].N Eng1 J Med,1968,279:611
[3] SORNIK J C,LEFOR W M,CICCIARELLI J C,et al.Hyperacute and acute ki d ney graft rejection dut to antibodies against B cells[J].Tranplantation,1992,5 4:61
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[4] BRYAN C F,AEDER M I,HELLING T S,et al.Clinical relevance of a posi tive B-cell crosshatch on renal transplantation:a multi-transplant center evalua tion[J].Transplant Proc,1993,25:247
[5] OGURA K,TERASAKI P I,JOHNSON C,et al.The significance of a positiv e flow cytometry crosshatch test in primary[J].Kidney Transplantation,1993,56: 294
[6] TERHOOR G M,COOPMANS M,ALLELES W A.Specificity and Ig class of pr eformed alloantibodies causing a positive crosshatch in renal transplantation:Th e implications for graft survival[J].Transplantation,1993,56:298
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[7] Lederer S R,Schneeberger H,Albert E,et al.Early renal graft dysfun citon[J].Transplantation,1996,61:313
[8] KOTB M,RUSSEL W,OHMAN M,et al.Clinical implications of flow c ytome try B cell crosshatching in renal transplantation[J].Transplant Proc,1997,29:1 430
[9] WORTHINGTON J E,LAUGHTON A,LIGGETT H,et al.A novel strategy for th r detection and definition of HLA-specific antibodies in patients awaiting renal transplantation[J].Transpl ant,1998,11(Suppl.1):S372
[10] 陈实主编.移植免疫学[M].武汉：湖北科学技术出版社，1998.41～41
[11] PAUL TERASAKI.Increasd risk of acutc and chronic rejection in sen sitized kidney recipients with HLA class Ⅱ-disedted donor antigen-specific ant ibodies[J].Unos,1999,84(9):3575
(2000-03-10收稿), 百拇医药