丰宫并殖吸虫后尾蚴、成虫及小睾并殖吸虫成虫的蛋白电泳分析
作者：王文林 夏代光 雷霖 周本江
单位：(昆明医学院寄生虫学教研室，昆明 650031)
关键词：丰宫并殖吸虫；后尾蚴；小睾并殖吸虫；IEF；蛋白质
昆明医学院学报000204 摘要：应用IEF技术对丰宫并殖吸虫后尾蚴的可溶性蛋白进行分 析，并 同丰宫并殖吸虫成虫、小睾并殖吸虫成虫电泳结果进行比较.IEF结果显示：丰宫并殖吸虫 后尾蚴显带11条，主带6条(3～4，6，8～10)；成虫显带17条，主带7条(4～7，12～14)；小 睾并殖吸虫成虫显带13条，主带5条(6～7，10～12).丰宫并殖吸虫后尾蚴和成虫、小睾并殖 吸虫成虫的电泳图谱及主带分布既有显著差别也有一些相似之处.
中图分类号：R 532.2 文献标识码：A 文章编号：1003-4706(2000)-02-0015-03
, 百拇医药
Primary Analysis of Proteins in Excysted
Metacercariae and Adult of Paragonimus Proliferus
and Adult of Paragonimus Microrchis by Electrophores
WANG Wen-lin，XIA Dai-guang，LEI Lin，ZHOU Ben-jiang
(Department of Parasitology, Kunming Medical College, Kunming 650031)
Abstract：The excysted metacercariae of Paragonimus proliferus (P. p) are separated from the isolapotamon mostly, the experiment firstly describe t he study on the soluble proteins from the excysted metacercariae of P.p. with IE F technique and compare to the electrophoretic results of adult worms of P.p. an d Paragonimus microrchis(P.m.). The results of IEF show 11 bands in excysted met acercariae, 6 major bands (band 3～4, 6.8～10). 17 bands in adult worms of P.p. , 7 major bands (band4～7, 12～14). 13 bands in adult worms of P.m, 5 major band s(band6～7, 10～12).
, http://www.100md.com
There are both dominant differences and some resemblances among excysted metacer cariae and adult worms of P.p. and P.m. in the protein electrophoresis patterns and the distribution of major bands.
Key words：Paragonimus proliferus；Excysted metacercariae；Pa ragonimus microrchis；IEF；Protein
对于并殖吸虫生活史各个时期的抗原性研究已有许多报道，Indrawati I等 将异盘并殖吸虫成虫用蒸馏水制备匀浆，通过Sephadex G-200得到3个组分，其中F1组 分 中的35kda蛋白抗原为特异性抗原，具有很高的敏感性和特异性[1].王文林等应用 Disc-PAGE分析了丰宫并殖吸虫成虫粗抗原，再采用特异性抗原蛋白5成分用于ELISA诊断并 殖吸虫病[2].蒋作君等证实了卫氏并殖吸虫成虫和囊蚴存在共同抗原和期特异抗原 ，成虫和囊 蚴在理化性质方面存在许多相似组分和少数特征组分，期特异抗原大多数含有糖脂蛋白，部 分期特异抗原为主要血清学抗原[3].随后冯笑川等应用囊蚴期抗原免疫家兔获得 抗卫氏并殖吸虫囊蚴抗体，用于并殖吸虫感染早期诊断有很好价值[4].由于并殖 吸虫感染早期或并殖吸虫肺外型寄生者大多为未成熟虫体，因此对囊蚴、童虫的期特异性抗 原的研究已受到许多学者的重视[5].
, http://www.100md.com
丰宫并殖吸虫的囊蚴是现在所知的各种并殖吸虫囊蚴中的最大者，具有完整囊壁的囊蚴不易 见到，绝大多数情况下从石蟹体内分离得到的是已脱囊的后尾蚴.本研究应用IEF对丰宫并 殖吸虫后尾蚴的可溶性蛋白进行分析，并同丰宫并殖吸虫成虫、小睾并殖吸虫成虫的电泳结 果进行比较，以便进一步应用后尾蚴抗原于丰宫并殖吸虫病的早期诊断.
1 材料与方法
1.1 实验动物及动物感染
Wistar大鼠35只，体重250～350 g，经3 d连续粪检阴性确认无并殖吸虫感染后随机分为丰 宫并殖吸虫感染组和小睾并殖吸虫感染组.将从云南景洪采回的石蟹轻轻捣碎外骨骼后，过 滤，以自然沉淀法在解剖镜下分离得到丰宫并殖吸虫后尾蚴及小睾并殖吸虫囊蚴.后尾幼和 囊蚴分别经腹腔注射接种于丰宫并殖吸虫感染组21只大鼠(每鼠8个后尾蚴)和小睾并殖吸虫 感染组14只大鼠(每鼠15个囊蚴).自感染后第45 d起，用集卵沉淀法粪检，第100 d分别解 剖大鼠，从肺脏获取丰宫、小睾并殖吸虫成虫.
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1.2 粗抗原的制备
将丰宫、小睾并殖吸虫新鲜成虫分别用生理盐水冲洗干净后，37℃孵育30 min，换生理盐水 再置室温下数小时，使虫体排出虫卵，吐出宿主物质，以0.01 mol/L pH 7.4 PBS缓冲液 冲洗成虫若干遍，再以“1 mL PBS+1.5 g鲜虫”比例进行超声粉碎(振幅20 μm,1 min×3) ，置冰箱反复冻融、冷浸，经3 000 r/min低温离心30 min，取上清液于无菌试管，测得丰 宫并殖吸虫成虫抗原蛋白含量为7.013 g/L，小睾并殖吸虫成虫抗原蛋白含量为5.741 g/L (Lowry等法测定)[6].
丰宫并殖吸虫后尾蚴粗抗原的制备以100个后尾蚴加0.5 mL生理盐水研成匀浆，方法同成虫 抗原的制备，测得其蛋白浓度为3.170 g/L.
1.3 IEF分离并殖吸虫粗抗原
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IEF按常规进行.电泳后凝胶柱用12.5%三氯乙酸固定10 min，再分别用考马斯亮蓝染蛋白 质，并计算每条带距凝胶柱正极端的平均长度(以Lp值表示).这里的Lp值是指在同等条件下 所观察的12支凝胶各区带的平均值.
2 结果
经考马斯亮蓝染色后，丰宫并殖吸虫后尾蚴显示11条蛋白带，主带6条(带3～4，6，8～10染 色较深)；成虫显示17条蛋白带，主带7条(带4～7，12～14染色较深)；小睾并殖吸虫成虫显 示13条蛋白带，主带5条(带6～7，10～12染色较深).丰宫并殖吸虫后尾蚴带1～3，6，8～9 和成虫带5，8～10，13～14的Lp值均彼此对应(6对)相等，占后尾蚴的55%，占成虫35%；后 尾蚴带4～5和小睾并殖吸虫成虫带6～7的Lp值彼此对应(2对)相等，占后尾蚴18%，占小睾并 殖吸虫成虫15%；丰宫并殖吸虫成虫带4，7，16和小睾并殖吸虫成虫带2，5，13的Lp值彼此 对应(3对)相等，占丰宫并殖吸虫成虫18%，占小睾并殖吸虫成虫23%.
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3 讨论
应用IEF对并殖吸虫后尾蚴、成虫蛋白质组成比较研究的报道尚未见到.本实验建立了丰宫 并殖吸虫后尾蚴、成虫和小睾并殖吸虫成虫的IEF图谱.用考马斯亮蓝染色结果显示，丰宫 并殖吸虫虫体发育阶段不同其蛋白质组成及主带分布是有差别的，成虫蛋白的组成较为复杂 ，图谱区带数目多，染色深的主带成份也比后尾蚴多，两者存在6对电泳带Lp值彼此对应相 等，提示后尾蚴和成虫既有期特异性抗原也有较多的共同抗原成份.此结果与蒋作君等报道 的卫氏并殖吸虫囊蚴与成虫存在多数共同抗原和少数期特异性抗原相似[3].丰宫并 殖吸虫后尾蚴同小睾并殖吸虫成虫比较，有2对电泳带Lp值彼此对应相等，提示了在并殖吸 虫虫种间不同的发育阶段也可能存在共同抗原成份.丰宫并殖吸虫成虫同小睾并殖吸虫成虫 相比较，两者有3对电泳带Lp值彼此对应相等，提示存在共同抗原和种特异抗原.
由于并殖吸虫的致病作用主要由虫体(童虫、成虫)所引起，若能够早期诊断，就有可能将并 殖吸虫杀灭在童虫期移行过程中.早期进行免疫学诊断的特异性主要又取决于诊断抗原的特 异性.冯笑川等应用针对囊蚴、童虫期特异的抗卫氏并殖吸虫囊蚴抗体早期诊断犬的卫氏并 殖吸虫病取得较好效果[4].本实验结果表明丰宫并殖吸虫后尾蚴经IEF电泳后显示1 1条蛋白区带，其中有6条(带3～4，6，8～10)带经考马斯亮蓝染色较深，对这6条区带经过 筛选出特异性较高的诊断抗原，应用于早期诊断丰宫并殖吸虫病仍是今后继续研究的课题.
, 百拇医药
基金项目：云南省应用基础研究基金资助课题(1999C0017Q)
作者简介：王文林(1964～)，男，甘肃泾川人，硕士，讲师，主要从事寄生虫学与 寄生虫病研究.
参 考 文 献
[1] INDRAWATI I S N A,CHAICUMPA W,SETASUBAN P,et al.Studies on immunodiag nosis of human paragonimiasis and specific antigen of Paragonimus heterotr emus[J].J Parasitology,1991,21(4):395
[2] 王文林，夏代光.应用纯化抗原和ELISA诊断大鼠丰宫并殖吸虫病[J].昆 明医学院学报，1999，20(2B)：22
, 百拇医药
[3] 蒋作君，沈一平，蔡士椿，等.卫氏并殖吸虫成虫和囊蚴抗原分析[J]. 上海免疫学杂志，1986，6(3)：133
[4] 冯笑川，沈一平，蔡士椿.感染卫氏并殖吸虫的犬和大白鼠循环抗原动态观 察[J].上海免疫学杂志，1989，9(5)：267
[5] KONG Y,CHUNG J Y,YUN D H,et al.Variation of antigenic proteins of eggs and developmental stages of Paragonimus westermani[J].Korean J Parasitol, 1997,35(3):197
[6] LOWRY O H,RESEBROUGH N J,FARR A L,et al.Protein measurement with F olin phenol reagent[J].J Biol Chem,1951,193:265
(2000-01-25收稿), http://www.100md.com
单位：(昆明医学院寄生虫学教研室，昆明 650031)
关键词：丰宫并殖吸虫；后尾蚴；小睾并殖吸虫；IEF；蛋白质
昆明医学院学报000204 摘要：应用IEF技术对丰宫并殖吸虫后尾蚴的可溶性蛋白进行分 析，并 同丰宫并殖吸虫成虫、小睾并殖吸虫成虫电泳结果进行比较.IEF结果显示：丰宫并殖吸虫 后尾蚴显带11条，主带6条(3～4，6，8～10)；成虫显带17条，主带7条(4～7，12～14)；小 睾并殖吸虫成虫显带13条，主带5条(6～7，10～12).丰宫并殖吸虫后尾蚴和成虫、小睾并殖 吸虫成虫的电泳图谱及主带分布既有显著差别也有一些相似之处.
中图分类号：R 532.2 文献标识码：A 文章编号：1003-4706(2000)-02-0015-03
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Primary Analysis of Proteins in Excysted
Metacercariae and Adult of Paragonimus Proliferus
and Adult of Paragonimus Microrchis by Electrophores
WANG Wen-lin，XIA Dai-guang，LEI Lin，ZHOU Ben-jiang
(Department of Parasitology, Kunming Medical College, Kunming 650031)
Abstract：The excysted metacercariae of Paragonimus proliferus (P. p) are separated from the isolapotamon mostly, the experiment firstly describe t he study on the soluble proteins from the excysted metacercariae of P.p. with IE F technique and compare to the electrophoretic results of adult worms of P.p. an d Paragonimus microrchis(P.m.). The results of IEF show 11 bands in excysted met acercariae, 6 major bands (band 3～4, 6.8～10). 17 bands in adult worms of P.p. , 7 major bands (band4～7, 12～14). 13 bands in adult worms of P.m, 5 major band s(band6～7, 10～12).
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There are both dominant differences and some resemblances among excysted metacer cariae and adult worms of P.p. and P.m. in the protein electrophoresis patterns and the distribution of major bands.
Key words：Paragonimus proliferus；Excysted metacercariae；Pa ragonimus microrchis；IEF；Protein
对于并殖吸虫生活史各个时期的抗原性研究已有许多报道，Indrawati I等 将异盘并殖吸虫成虫用蒸馏水制备匀浆，通过Sephadex G-200得到3个组分，其中F1组 分 中的35kda蛋白抗原为特异性抗原，具有很高的敏感性和特异性[1].王文林等应用 Disc-PAGE分析了丰宫并殖吸虫成虫粗抗原，再采用特异性抗原蛋白5成分用于ELISA诊断并 殖吸虫病[2].蒋作君等证实了卫氏并殖吸虫成虫和囊蚴存在共同抗原和期特异抗原 ，成虫和囊 蚴在理化性质方面存在许多相似组分和少数特征组分，期特异抗原大多数含有糖脂蛋白，部 分期特异抗原为主要血清学抗原[3].随后冯笑川等应用囊蚴期抗原免疫家兔获得 抗卫氏并殖吸虫囊蚴抗体，用于并殖吸虫感染早期诊断有很好价值[4].由于并殖 吸虫感染早期或并殖吸虫肺外型寄生者大多为未成熟虫体，因此对囊蚴、童虫的期特异性抗 原的研究已受到许多学者的重视[5].
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丰宫并殖吸虫的囊蚴是现在所知的各种并殖吸虫囊蚴中的最大者，具有完整囊壁的囊蚴不易 见到，绝大多数情况下从石蟹体内分离得到的是已脱囊的后尾蚴.本研究应用IEF对丰宫并 殖吸虫后尾蚴的可溶性蛋白进行分析，并同丰宫并殖吸虫成虫、小睾并殖吸虫成虫的电泳结 果进行比较，以便进一步应用后尾蚴抗原于丰宫并殖吸虫病的早期诊断.
1 材料与方法
1.1 实验动物及动物感染
Wistar大鼠35只，体重250～350 g，经3 d连续粪检阴性确认无并殖吸虫感染后随机分为丰 宫并殖吸虫感染组和小睾并殖吸虫感染组.将从云南景洪采回的石蟹轻轻捣碎外骨骼后，过 滤，以自然沉淀法在解剖镜下分离得到丰宫并殖吸虫后尾蚴及小睾并殖吸虫囊蚴.后尾幼和 囊蚴分别经腹腔注射接种于丰宫并殖吸虫感染组21只大鼠(每鼠8个后尾蚴)和小睾并殖吸虫 感染组14只大鼠(每鼠15个囊蚴).自感染后第45 d起，用集卵沉淀法粪检，第100 d分别解 剖大鼠，从肺脏获取丰宫、小睾并殖吸虫成虫.
, 百拇医药
1.2 粗抗原的制备
将丰宫、小睾并殖吸虫新鲜成虫分别用生理盐水冲洗干净后，37℃孵育30 min，换生理盐水 再置室温下数小时，使虫体排出虫卵，吐出宿主物质，以0.01 mol/L pH 7.4 PBS缓冲液 冲洗成虫若干遍，再以“1 mL PBS+1.5 g鲜虫”比例进行超声粉碎(振幅20 μm,1 min×3) ，置冰箱反复冻融、冷浸，经3 000 r/min低温离心30 min，取上清液于无菌试管，测得丰 宫并殖吸虫成虫抗原蛋白含量为7.013 g/L，小睾并殖吸虫成虫抗原蛋白含量为5.741 g/L (Lowry等法测定)[6].
丰宫并殖吸虫后尾蚴粗抗原的制备以100个后尾蚴加0.5 mL生理盐水研成匀浆，方法同成虫 抗原的制备，测得其蛋白浓度为3.170 g/L.
1.3 IEF分离并殖吸虫粗抗原
, http://www.100md.com
IEF按常规进行.电泳后凝胶柱用12.5%三氯乙酸固定10 min，再分别用考马斯亮蓝染蛋白 质，并计算每条带距凝胶柱正极端的平均长度(以Lp值表示).这里的Lp值是指在同等条件下 所观察的12支凝胶各区带的平均值.
2 结果
经考马斯亮蓝染色后，丰宫并殖吸虫后尾蚴显示11条蛋白带，主带6条(带3～4，6，8～10染 色较深)；成虫显示17条蛋白带，主带7条(带4～7，12～14染色较深)；小睾并殖吸虫成虫显 示13条蛋白带，主带5条(带6～7，10～12染色较深).丰宫并殖吸虫后尾蚴带1～3，6，8～9 和成虫带5，8～10，13～14的Lp值均彼此对应(6对)相等，占后尾蚴的55%，占成虫35%；后 尾蚴带4～5和小睾并殖吸虫成虫带6～7的Lp值彼此对应(2对)相等，占后尾蚴18%，占小睾并 殖吸虫成虫15%；丰宫并殖吸虫成虫带4，7，16和小睾并殖吸虫成虫带2，5，13的Lp值彼此 对应(3对)相等，占丰宫并殖吸虫成虫18%，占小睾并殖吸虫成虫23%.
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3 讨论
应用IEF对并殖吸虫后尾蚴、成虫蛋白质组成比较研究的报道尚未见到.本实验建立了丰宫 并殖吸虫后尾蚴、成虫和小睾并殖吸虫成虫的IEF图谱.用考马斯亮蓝染色结果显示，丰宫 并殖吸虫虫体发育阶段不同其蛋白质组成及主带分布是有差别的，成虫蛋白的组成较为复杂 ，图谱区带数目多，染色深的主带成份也比后尾蚴多，两者存在6对电泳带Lp值彼此对应相 等，提示后尾蚴和成虫既有期特异性抗原也有较多的共同抗原成份.此结果与蒋作君等报道 的卫氏并殖吸虫囊蚴与成虫存在多数共同抗原和少数期特异性抗原相似[3].丰宫并 殖吸虫后尾蚴同小睾并殖吸虫成虫比较，有2对电泳带Lp值彼此对应相等，提示了在并殖吸 虫虫种间不同的发育阶段也可能存在共同抗原成份.丰宫并殖吸虫成虫同小睾并殖吸虫成虫 相比较，两者有3对电泳带Lp值彼此对应相等，提示存在共同抗原和种特异抗原.
由于并殖吸虫的致病作用主要由虫体(童虫、成虫)所引起，若能够早期诊断，就有可能将并 殖吸虫杀灭在童虫期移行过程中.早期进行免疫学诊断的特异性主要又取决于诊断抗原的特 异性.冯笑川等应用针对囊蚴、童虫期特异的抗卫氏并殖吸虫囊蚴抗体早期诊断犬的卫氏并 殖吸虫病取得较好效果[4].本实验结果表明丰宫并殖吸虫后尾蚴经IEF电泳后显示1 1条蛋白区带，其中有6条(带3～4，6，8～10)带经考马斯亮蓝染色较深，对这6条区带经过 筛选出特异性较高的诊断抗原，应用于早期诊断丰宫并殖吸虫病仍是今后继续研究的课题.
, 百拇医药
基金项目：云南省应用基础研究基金资助课题(1999C0017Q)
作者简介：王文林(1964～)，男，甘肃泾川人，硕士，讲师，主要从事寄生虫学与 寄生虫病研究.
参 考 文 献
[1] INDRAWATI I S N A,CHAICUMPA W,SETASUBAN P,et al.Studies on immunodiag nosis of human paragonimiasis and specific antigen of Paragonimus heterotr emus[J].J Parasitology,1991,21(4):395
[2] 王文林，夏代光.应用纯化抗原和ELISA诊断大鼠丰宫并殖吸虫病[J].昆 明医学院学报，1999，20(2B)：22
, 百拇医药
[3] 蒋作君，沈一平，蔡士椿，等.卫氏并殖吸虫成虫和囊蚴抗原分析[J]. 上海免疫学杂志，1986，6(3)：133
[4] 冯笑川，沈一平，蔡士椿.感染卫氏并殖吸虫的犬和大白鼠循环抗原动态观 察[J].上海免疫学杂志，1989，9(5)：267
[5] KONG Y,CHUNG J Y,YUN D H,et al.Variation of antigenic proteins of eggs and developmental stages of Paragonimus westermani[J].Korean J Parasitol, 1997,35(3):197
[6] LOWRY O H,RESEBROUGH N J,FARR A L,et al.Protein measurement with F olin phenol reagent[J].J Biol Chem,1951,193:265
(2000-01-25收稿), http://www.100md.com