淋病奈瑟菌PCR检测的临床应用研究
作者：张景生 肖白 谭淑珍 严敬丽 蔡有龄 刘敬忠
单位：首都医科大学附属北京红十字朝阳医院皮肤科
关键词：淋病奈瑟菌；聚合酶链反应；临床应用
首都医科大学学报990111 提要： 为评价淋病奈瑟菌PCR检测的临床效果，建立了对标准淋病奈瑟菌的DNA PCR检测技术。结果显示，NG-PCR技术的灵敏度约为3个菌的基因组拷贝。对8种菌株进行NG-PCR，只有标准淋病奈瑟菌显示阳性，其余7株非淋球菌菌株均阴性，说明有很好的特异性。对49例淋病患者同时进行涂片镜检法、细菌培养法和PCR法检测的比较，其阳性检出率分别为76.6%、52.2%和95.9%。提示NG-PCR方法比涂片和培养法更为敏感，且特异性强，在淋病的诊断，特别是早期诊断中有重要参考价值。
中图分类号： R759.22
, http://www.100md.com
Clinical Application of PCR Assay for Detection of Neisseria gonorrhoeae
Zhang Jingsheng, Xiao Bai, Tan Shuzhen, Yan Jingli, Cai Youling, Liu Jingzhong
Department of Dermatology, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences
Abstract: Inder to evaluate the clinical application of PCR assay for the detection of Neisseria gonorrhoeae. Genitourinary specimens were obtained from NG patients and Neisseria gonorrhoeae was detected with a number of tests including Gram′s stain of smears, culture and PCR assay. The sensitivity and specificity of the NG-PCR assay were evaluated with 8 bacterial strains. The NG-PCR assay had a detection limit of 3 copies of NG genomic DNA. In the specificity of the PCR assay, the standard Neisseria gonorrheae was positive, but no PCR product could be visualized in 7 nongonorrhoeae strains. PCR results of 47 NG patients were compared with those obtained by Gram′s smear and culture. The positive rates for smear, culture and PCR were 76.6%, 52.2% and 95.9%, respectively. Of 82 normal controls, 1 specimen was PCR positive. The false positive rate of the PCR assay was about 1.2%. The PCR assay is a satisfactory diagnostic tool for the detection of Neisseria gonorrhoeae in clinical specimens.
, 百拇医药
Key words: Neisseria gonorrhoeae; PCR; clinical applying
淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是性传播疾病中泌尿生殖道感染的主要病原体之一，经典的检测方法有分泌物涂片镜检法和细菌培养法。近年发展起来的PCR方法与传统方法相比具有灵敏度高，特异性强，且简便省时等特点，正不断应用于临床标本的检测。我们对淋病奈瑟菌PCR检测法的敏感性、特异性进行了研究，并与涂片法和培养法的检测结果进行了分析比较。
1 材料和方法
1.1 临床资料
急性淋病病人49例，选自1996年1月至1997年12月在我院皮科、泌尿科、妇产科门诊就诊的患者。其中男38例，女11例，年龄18～60岁。诊断标准为：①具有典型不洁性交史；②具有典型症状：尿频、尿急、尿痛，尿道有脓性分泌物或有脓性白带；③尿道或宫颈分泌物涂片镜检、培养或PCR检测至少1项阳性；④经治疗明显好转。
, http://www.100md.com
随机人群82例作为对照，选自我院产科1997年7月至12月住院的产妇，年龄23～31岁。无羊膜早破，胎儿无异常。
1.2 试验菌株
淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、大肠艾希菌、痢疾杆菌、伤寒沙门菌、绿脓假单胞菌、变形杆菌，均由中国药品生物制品检定所提供。
1.3 实验方法
分泌物镜检按常规操作，细胞内见革兰阴性双球菌为阳性。
细菌培养按常规操作。
PCR检测采用中山医科大学达安基因诊断中心淋球菌(NG)PCR检测试剂盒，标本DNA提取和PCR扩增均按试剂盒说明书进行。对标本的采集、预处理、PCR操作及电泳等各个环节均注意防止对待检标本的污染，以尽量消除PCR结果的假阳性。主要步骤为：分泌物标本加入DNA提取液煮沸10 min后离心，取上清2 μL加入PCR反应管，93 ℃3 min预变性，然后按93 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物片段的长度为391 bp，经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色，在UVP 7500凝胶成像仪上观察结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 灵敏度实验
将淋病奈瑟菌标准DNA模板做连续10倍稀释，得到10-1～10-9 9个稀释度，PCR检测结果表明，可检出的最高稀释度，即最少为18 fg模板DNA，约为3个菌的基因组拷贝。
2.2 特异性实验
标准淋病奈瑟菌NG-PCR显示为阳性，而7株非淋球菌菌株(脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、大肠艾希菌、痢疾杆菌、伤寒沙门菌、绿脓假单胞菌、变形杆菌)均为阴性。即使具同源性的脑膜炎球菌也无扩增产物出现，说明本试验具有高度特异性。
2.3 临床标本检测结果
急性淋病患者3种淋球菌检测方法结果比较见表1、2。
, 百拇医药
表1 PCR、涂片、培养法检测淋病奈瑟菌结果 方法
总例数
阳性例数
敏感性/%
涂片
47
36
76.6
培养
23
12
52.2
PCR
, 百拇医药
49
47
95.9
表2 PCR、涂片、培养法检测淋病奈瑟菌的比较 方法
涂片
培养
+
-
+
-
PCR +
34
11
, 百拇医药
12
10
PCR -
2
0
0
1
随机人群NG-PCR检测结果：NG-PCR检测阳性1例，阳性率1.2%。此项检测为双盲试验，该阳性病例既往无性病史，9个月后复查，NG-DNA阴性，病人否认经过治疗。不能排除假阳性的可能。
3 讨论
淋病是目前最常见的性传播疾病之一。据《世界卫生组织简报》1997年第11期介绍，1996年淋病奈瑟菌感染升至第10位病因，全世界总病例数达2 300万。据广州1996年调查，随机抽取产前常规检查的孕妇，以淋球菌培养阳性为标准，孕妇中淋病的患病率为0.5%[1]。
, 百拇医药
应用PCR方法检测淋球菌在国内外均有大量研究。特别是应用多重PCR方法联合检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体等多种病原体[2～7]。Wong等的研究表明[2]，临床标本NG-PCR阳性检出率与酶免疫方法无差异。Crotchfelt对尿和拭子标本共536例进行NG-PCR检测，敏感性和特异性均达到90%以上[3]。Herrmann采用单管巢式NG-PCR法检测空气干燥的标本，在室温下储存1年的玻片标本的检测敏感性仍不降低[4]；而棉拭子标本在室温下仅能检出储存4周以内的。Mahony将200份标本同时进行NG-PCR和培养[5]，NG-PCR的敏感性为92.3%，特异性为100%；培养法的敏感性为84.6%，特异性为100%。
根据淋球菌标准DNA模板稀释试验，最高稀释度可达18 fg DNA，约为3个菌体的基因组拷贝。如此少量的菌体，镜检是不能发现的。本组11例涂片阴性者，8人有明显症状及不洁性交史，3人有不洁性交史，但无明显临床症状，涂片仅见少量白细胞，但PCR阳性。证实PCR的敏感性是很高的。另有2例患者尿道有脓性分泌物，涂片阳性，但PCR阴性。说明PCR检测的敏感性虽明显高于涂片和培养法，高达95.9%，但仍有假阴性，尚需进一步提高其敏感性。有关文献报道的运用荧光标记探针的定量PCR技术即是一种很有前途的新技术。
, 百拇医药
在性病诊断上，某些病原体如淋球菌、衣原体、支原体及乳头瘤病毒的检查及培养有相当的难度，特别是当革兰阴性双球菌在细胞外时，淋病的诊断相当困难。现在由于PCR技术的应用，方便了这些疾病的诊断。
像其他生物技术一样，PCR技术需要规范化、标准化。在临床应用中应该有质控标准。标本的处理、DNA的提取、器具的操作及工作间的安排要严格杜绝DNA的污染，以防止错误的产生。在操作中要设置阳性及阴性对照。本研究是在一个合理安排的实验室中进行的，在实验中注意了严格的操作，严格选择PCR试剂，但仍在82例随机人群对照标本中检出1例NG阳性，即可能的假阳性率约为1.2%。
综上所述，运用PCR技术检测淋球菌具有操作简便、快速，敏感性和特异性高等特点，是一种良好的值得临床推广应用的分子生物学检测方法。
参考文献
1 符玉良,黄以宁,张维森,等.孕妇性传播疾病高危因素评分系统模式的建立.中华医学杂志,1997,77(2):87～90
, 百拇医药
2 Wong K C, Ho B S, Egglestone S I, et al. Duplex PCR system for simultaneous detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in clinical specimens. J Clin Pathol, 1995,48:101～104
3 Crotchfelt K A, Welsh L E, DeBonville D, et al. Detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in genitourinary specimens from men and women by a coamplification PCR assay. J Clin Microbiol, 1997, 35(6):1536～1540
4 Herrmann B, Nystrom T, Wessel H. Detection of Neisseria gonorrhoeae from air-dried genital samples by singletube nested PCR. J Clin Microbiol, 1996, 34(10):2548～2551
, http://www.100md.com
5 Mahony J B, Luinstra K E, Tyndall M, et al. Multiplex PCR for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genitourinary specimens. J Clin Microbiol, 1995, 33(11):3049～3053
6 郑兴武,肖桂元,戴盛明,等.多重聚合酶链反应检测淋病奈瑟菌等多种菌感染.中华医学检验杂志,1996,19(3):176～178
7 卢和琨,谢礼豪,黄澍杰,等.淋病患者合并衣原体和支原体感染.中华皮肤科杂志,1997,30(3):189
收稿日期：1998-03-25, http://www.100md.com
单位：首都医科大学附属北京红十字朝阳医院皮肤科
关键词：淋病奈瑟菌；聚合酶链反应；临床应用
首都医科大学学报990111 提要： 为评价淋病奈瑟菌PCR检测的临床效果，建立了对标准淋病奈瑟菌的DNA PCR检测技术。结果显示，NG-PCR技术的灵敏度约为3个菌的基因组拷贝。对8种菌株进行NG-PCR，只有标准淋病奈瑟菌显示阳性，其余7株非淋球菌菌株均阴性，说明有很好的特异性。对49例淋病患者同时进行涂片镜检法、细菌培养法和PCR法检测的比较，其阳性检出率分别为76.6%、52.2%和95.9%。提示NG-PCR方法比涂片和培养法更为敏感，且特异性强，在淋病的诊断，特别是早期诊断中有重要参考价值。
中图分类号： R759.22
, http://www.100md.com
Clinical Application of PCR Assay for Detection of Neisseria gonorrhoeae
Zhang Jingsheng, Xiao Bai, Tan Shuzhen, Yan Jingli, Cai Youling, Liu Jingzhong
Department of Dermatology, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences
Abstract: Inder to evaluate the clinical application of PCR assay for the detection of Neisseria gonorrhoeae. Genitourinary specimens were obtained from NG patients and Neisseria gonorrhoeae was detected with a number of tests including Gram′s stain of smears, culture and PCR assay. The sensitivity and specificity of the NG-PCR assay were evaluated with 8 bacterial strains. The NG-PCR assay had a detection limit of 3 copies of NG genomic DNA. In the specificity of the PCR assay, the standard Neisseria gonorrheae was positive, but no PCR product could be visualized in 7 nongonorrhoeae strains. PCR results of 47 NG patients were compared with those obtained by Gram′s smear and culture. The positive rates for smear, culture and PCR were 76.6%, 52.2% and 95.9%, respectively. Of 82 normal controls, 1 specimen was PCR positive. The false positive rate of the PCR assay was about 1.2%. The PCR assay is a satisfactory diagnostic tool for the detection of Neisseria gonorrhoeae in clinical specimens.
, 百拇医药
Key words: Neisseria gonorrhoeae; PCR; clinical applying
淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是性传播疾病中泌尿生殖道感染的主要病原体之一，经典的检测方法有分泌物涂片镜检法和细菌培养法。近年发展起来的PCR方法与传统方法相比具有灵敏度高，特异性强，且简便省时等特点，正不断应用于临床标本的检测。我们对淋病奈瑟菌PCR检测法的敏感性、特异性进行了研究，并与涂片法和培养法的检测结果进行了分析比较。
1 材料和方法
1.1 临床资料
急性淋病病人49例，选自1996年1月至1997年12月在我院皮科、泌尿科、妇产科门诊就诊的患者。其中男38例，女11例，年龄18～60岁。诊断标准为：①具有典型不洁性交史；②具有典型症状：尿频、尿急、尿痛，尿道有脓性分泌物或有脓性白带；③尿道或宫颈分泌物涂片镜检、培养或PCR检测至少1项阳性；④经治疗明显好转。
, http://www.100md.com
随机人群82例作为对照，选自我院产科1997年7月至12月住院的产妇，年龄23～31岁。无羊膜早破，胎儿无异常。
1.2 试验菌株
淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、大肠艾希菌、痢疾杆菌、伤寒沙门菌、绿脓假单胞菌、变形杆菌，均由中国药品生物制品检定所提供。
1.3 实验方法
分泌物镜检按常规操作，细胞内见革兰阴性双球菌为阳性。
细菌培养按常规操作。
PCR检测采用中山医科大学达安基因诊断中心淋球菌(NG)PCR检测试剂盒，标本DNA提取和PCR扩增均按试剂盒说明书进行。对标本的采集、预处理、PCR操作及电泳等各个环节均注意防止对待检标本的污染，以尽量消除PCR结果的假阳性。主要步骤为：分泌物标本加入DNA提取液煮沸10 min后离心，取上清2 μL加入PCR反应管，93 ℃3 min预变性，然后按93 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物片段的长度为391 bp，经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色，在UVP 7500凝胶成像仪上观察结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 灵敏度实验
将淋病奈瑟菌标准DNA模板做连续10倍稀释，得到10-1～10-9 9个稀释度，PCR检测结果表明，可检出的最高稀释度，即最少为18 fg模板DNA，约为3个菌的基因组拷贝。
2.2 特异性实验
标准淋病奈瑟菌NG-PCR显示为阳性，而7株非淋球菌菌株(脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、大肠艾希菌、痢疾杆菌、伤寒沙门菌、绿脓假单胞菌、变形杆菌)均为阴性。即使具同源性的脑膜炎球菌也无扩增产物出现，说明本试验具有高度特异性。
2.3 临床标本检测结果
急性淋病患者3种淋球菌检测方法结果比较见表1、2。
, 百拇医药
表1 PCR、涂片、培养法检测淋病奈瑟菌结果 方法
总例数
阳性例数
敏感性/%
涂片
47
36
76.6
培养
23
12
52.2
PCR
, 百拇医药
49
47
95.9
表2 PCR、涂片、培养法检测淋病奈瑟菌的比较 方法
涂片
培养
+
-
+
-
PCR +
34
11
, 百拇医药
12
10
PCR -
2
0
0
1
随机人群NG-PCR检测结果：NG-PCR检测阳性1例，阳性率1.2%。此项检测为双盲试验，该阳性病例既往无性病史，9个月后复查，NG-DNA阴性，病人否认经过治疗。不能排除假阳性的可能。
3 讨论
淋病是目前最常见的性传播疾病之一。据《世界卫生组织简报》1997年第11期介绍，1996年淋病奈瑟菌感染升至第10位病因，全世界总病例数达2 300万。据广州1996年调查，随机抽取产前常规检查的孕妇，以淋球菌培养阳性为标准，孕妇中淋病的患病率为0.5%[1]。
, 百拇医药
应用PCR方法检测淋球菌在国内外均有大量研究。特别是应用多重PCR方法联合检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体等多种病原体[2～7]。Wong等的研究表明[2]，临床标本NG-PCR阳性检出率与酶免疫方法无差异。Crotchfelt对尿和拭子标本共536例进行NG-PCR检测，敏感性和特异性均达到90%以上[3]。Herrmann采用单管巢式NG-PCR法检测空气干燥的标本，在室温下储存1年的玻片标本的检测敏感性仍不降低[4]；而棉拭子标本在室温下仅能检出储存4周以内的。Mahony将200份标本同时进行NG-PCR和培养[5]，NG-PCR的敏感性为92.3%，特异性为100%；培养法的敏感性为84.6%，特异性为100%。
根据淋球菌标准DNA模板稀释试验，最高稀释度可达18 fg DNA，约为3个菌体的基因组拷贝。如此少量的菌体，镜检是不能发现的。本组11例涂片阴性者，8人有明显症状及不洁性交史，3人有不洁性交史，但无明显临床症状，涂片仅见少量白细胞，但PCR阳性。证实PCR的敏感性是很高的。另有2例患者尿道有脓性分泌物，涂片阳性，但PCR阴性。说明PCR检测的敏感性虽明显高于涂片和培养法，高达95.9%，但仍有假阴性，尚需进一步提高其敏感性。有关文献报道的运用荧光标记探针的定量PCR技术即是一种很有前途的新技术。
, 百拇医药
在性病诊断上，某些病原体如淋球菌、衣原体、支原体及乳头瘤病毒的检查及培养有相当的难度，特别是当革兰阴性双球菌在细胞外时，淋病的诊断相当困难。现在由于PCR技术的应用，方便了这些疾病的诊断。
像其他生物技术一样，PCR技术需要规范化、标准化。在临床应用中应该有质控标准。标本的处理、DNA的提取、器具的操作及工作间的安排要严格杜绝DNA的污染，以防止错误的产生。在操作中要设置阳性及阴性对照。本研究是在一个合理安排的实验室中进行的，在实验中注意了严格的操作，严格选择PCR试剂，但仍在82例随机人群对照标本中检出1例NG阳性，即可能的假阳性率约为1.2%。
综上所述，运用PCR技术检测淋球菌具有操作简便、快速，敏感性和特异性高等特点，是一种良好的值得临床推广应用的分子生物学检测方法。
参考文献
1 符玉良,黄以宁,张维森,等.孕妇性传播疾病高危因素评分系统模式的建立.中华医学杂志,1997,77(2):87～90
, 百拇医药
2 Wong K C, Ho B S, Egglestone S I, et al. Duplex PCR system for simultaneous detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in clinical specimens. J Clin Pathol, 1995,48:101～104
3 Crotchfelt K A, Welsh L E, DeBonville D, et al. Detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in genitourinary specimens from men and women by a coamplification PCR assay. J Clin Microbiol, 1997, 35(6):1536～1540
4 Herrmann B, Nystrom T, Wessel H. Detection of Neisseria gonorrhoeae from air-dried genital samples by singletube nested PCR. J Clin Microbiol, 1996, 34(10):2548～2551
, http://www.100md.com
5 Mahony J B, Luinstra K E, Tyndall M, et al. Multiplex PCR for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genitourinary specimens. J Clin Microbiol, 1995, 33(11):3049～3053
6 郑兴武,肖桂元,戴盛明,等.多重聚合酶链反应检测淋病奈瑟菌等多种菌感染.中华医学检验杂志,1996,19(3):176～178
7 卢和琨,谢礼豪,黄澍杰,等.淋病患者合并衣原体和支原体感染.中华皮肤科杂志,1997,30(3):189
收稿日期：1998-03-25, http://www.100md.com