银杏叶注射液对实验性大鼠局灶性脑缺血的保护作用
作者：马怡 黑爱莲 金有豫 胡小敏
单位：首都医科大学药理学教研室
关键词：银杏叶注射液；局部脑缺血；脑梗死范围；行为评分
首都医科大学学报990106 提要： 以行为障碍、脑梗死范围、脑含水量、脑组织病理改变为观察指标，研究银杏叶注射液(GBE)对大鼠大脑中动脉闭塞所致局部脑缺血的防治作用。结果表明，GBE 20、40 mg/kg静脉注射可显著降低大鼠脑梗死范围和脑含水量，改善行为障碍。脑组织形态学检查显示，GBE 40 mg/kg组动物脑组织缺血病变较轻。提示GBE对局灶性脑缺血具有保护作用。
中图分类号： R931.5
Beneficial Effects of Ginkgo Bilboa Injection on Experimental Focal Cerebral Ischemia in Rats
, 百拇医药
Ma Yi, Hei Ailian, Jin Youyu, Hu Xiaomin
Department of Pharmacology, Capital University of Medical Sciences
Abstract: Ginkgo bilboa injection, is extracted from ginkgo leaf. The protective effects of ginkgo bilboa extract (GBE) on focal cerebral ischemic injury were studied. Focal cerebral ischemia was produced by permanent occlusion of the proximal portion of the right middle cerebral artery (MCA) with the technique of Tamura. The neurologic status of each rat was carefully evaluated at 8 and 24 h after surgery. The cerebral infarction and water content were measured. The histological changes of brain tissue after MCAO in rats were also studied. Treatment with GBE 20 or 40 mg/kg iv was shown to significantly reduce the cerebral infarction and water content, attenuate neurological deficits. The degree of inhibition of cerebral infarction were 24.4% (P<0.05 ) and 34.7% (P<0.01 ), respectively. In pathological examination, the extent of tissue ischemia in the group of treatment with GBE 40 mg/kg was much less than that of control. These results indicate that GBE protects rats from ischemic neurological damage.
, 百拇医药
Key words: GBE; focal cerebral ischemia; infarct size; neurological deficits
近年来的实验和临床研究表明银杏叶制剂具有改善脑循环障碍和脑神经元功能的作用[1]。但这些制剂大都为口服制剂，有关银杏叶注射液的作用研究尚未见报道。银杏叶注射液(ginkgo bilboa extract for iv, GBE)为高纯度的银杏叶提取物，主要含有银杏黄酮及总内酯。本研究用大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型研究GBE对大鼠局灶性脑缺血的防治作用。
1 材料和方法
Wistar大鼠，雄性，体质量220～270 g，由首都医科大学实验动物中心提供。将动物随机分为5组，即假手术对照组、MCAO模型组、GBE 20 mg/kg组、GBE 40 mg/kg组、金纳多20 mg/kg组。在术前2 min和术后12 h各经舌下静脉给药1次，其中假手术组和MCAO模型组静脉注射等量的山梨醇溶媒(0.2 mL/鼠)。
, 百拇医药
GBE由北京第四制药厂提供，以山梨醇为溶媒；金纳多注射液(ginaton injectionDR○ )由德国舒培大药厂生产，批号0310496；红四氮唑(TTC)为北京化工厂生产。
近端大脑中动脉阻断术：大鼠用12%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。按Tamura等的方法[2]，在大鼠右外耳道与眼外眦连线中点处垂直切开皮肤，逐层分离肌肉，除去颧弓，暴露颞前窝，在颧骨和鳞状骨接合处的前下方约2 mm处钻一小颅窗，暴露右侧MCA近端，以细针挑起、电凝阻断大脑下静脉下缘处的MCA。然后逐层缝合伤口，回笼饲养。假手术组除不阻断MCA外，其余手术步骤同模型组。
行为检测：在术后不同时间(8、24 h)，按Bederson等的方法并加以改进[3]，对动物进行行为评分。标准如下：①提鼠尾离开地面约30 cm，左前肢表现为腕屈曲、肘屈曲、肩内旋或兼而有之者，计1～4分；②将动物置于光滑平面上，轻推肩部使其向对侧移动，检查阻力情况，降低者根据程度不同计1～3分；③根据左前肢肌张力下降程度的差异，计1～3分；④动物有无向一侧不停转圈现象(1分)。满分为11分，分数越高，动物的行为障碍越严重。
, 百拇医药
脑梗死范围的测定：动物经末次行为评分后，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分冠状切成5片，置于5 mL 含60 mg TTC及22.8 mg K2HPO4 的染液中，37 ℃避光温孵30 min。正常组织染成红色，梗死组织呈白色[4]。将白色组织仔细挖下称质量，以梗死组织质量占总脑质量百分比作为脑梗死范围。
脑组织水含量的测定：术后24 h断头取脑，参照Hallenbeck法[5]，切取大脑前极到视交叉处的脑片，分别称量左右脑片的湿质量。105 ℃烘烤48 h至恒质量，计算含水量〔水%=(湿质量-干质量)/湿质量×100%〕。
病理检查：术后24 h，断头取脑，以10%甲醛固定，取视交叉前后脑片，经脱水包埋切片等步骤后作HE染色，在光镜下观察脑组织形态变化。
统计学方法：采用未配对样本的t检验进行组间差异比较。
, 百拇医药
2 结果
2.1 GBE对大鼠行为缺陷程度的影响
MCAO模型组大鼠在术后8、24 h均出现明显的行为改变，主要表现为手术对侧前肢内收，肩内旋，前肢肌张力降低，肩抗力下降。GBE大、小剂量组及金纳多组的大鼠在术后8、24 h，其神经症状均有不同程度的改善。与模型组比较差异显著(P<0.01，P<0.05)。假手术组未见行为异常改变(表1)。
表1 GBE和金纳多对MCAO大鼠行为缺陷程度和脑梗死范围的影响 组别
n
行为评分值
脑梗死范围/%
8 h
, http://www.100md.com
24 h
假手术组
8
0
0
0
MCAO模型组
9
6.8±1.6
5.9±1.4
9.33±2.22
GBE组
20 mg.kg-1
, 百拇医药
9
5.0±1.9*
4.3±1.7*
7.05±2.04*
40 mg.kg-1
9
4.2±1.7**
3.7±1.5**
6.09±2.19**
金纳多组/20 mg.kg-1
, 百拇医药
8
4.4±1.8*
3.9±1.6*
6.27±2.00**
与MCAO模型组比较*P<0.05，**P<0.01
2.2 GBE对大鼠脑梗死范围的影响
术后24 h，除假手术组外，其他各组大鼠大脑皮质均出现明显的梗死灶。GBE 20、40 mg/kg及金纳多20 mg/kg均可显著降低脑梗死范围；与模型组比较分别降低24.4%、34.7%和32.8%(表1)。
2.3 GBE对大鼠脑组织含水量的影响
, http://www.100md.com
假手术组未出现脑水肿，其他各组病灶侧半球含水量明显增加，与对侧半球比较P<0.01。GBE 20、40 mg/kg组及金纳多组的动物，脑水肿程度较模型组明显降低(P<0.01，表2)。
表2 GBE和金纳多对MCAO大鼠脑组织含水量的影响 组别
脑组织含水量/%
左侧半球
右侧半球
假手术组
77.80±0.58
77.66±0.56**
MCAO模型组
, 百拇医药
78.14±0.89
79.81±0.75△△
GBE组
20 mg.kg-1
78.21±0.41
78.97±0.32**△△
40 mg.kg-1
78.21±0.31
78.90±0.22**△△
金纳多组/20 mg.kg-1
, http://www.100md.com
78.17±0.27
78.92±0.45**△△
各组n=10；**与MCAO模型组比较P<0.01；
△△与左侧半球比较P<0.01
2.4 GBE对大鼠脑组织形态学变化的影响
MCAO后24 h，模型组大鼠病灶侧半球MCA供血区苍白、无光泽，脑表面血管较对侧充血。脑病理切片显示，假手术组神经细胞数量多，胞浆丰富，核质细，核仁清楚。模型组前脑皮质神经细胞稀疏，可见大量变性及坏死的神经细胞，表现为胞体皱缩，核固缩深染。GBE 40 mg/kg组仅见少量神经细胞变性坏死，胞体变形缩小，表明脑缺血程度明显轻于模型组。
3 讨论
, 百拇医药
为评价药物对脑缺血的疗效，建立一个接近临床病人且重复性好的动物模型是非常必要的。既往关于银杏叶制剂对缺血性脑损伤的保护作用有过研究，但以大脑中动脉凝闭所致局灶性脑缺血模型来研究银杏叶制剂的作用还未见报道。根据Tamura等人的方法[2]，本研究采用电凝闭造成大鼠单侧大脑中动脉阻断模型，手术创伤小，成功率高，接近临床脑梗死的形成，且重复性好。
本研究发现术后8 h，MCAO大鼠手术对侧前肢均出现明显的运动障碍，24 h后略有改善。提示大脑中动脉阻断后皮质运动区或纹状体产生缺血性损伤。形态学研究表明，MCAO后24 h，颞侧皮质出现明显的梗死灶，光镜下可见大量的神经细胞变性坏死，呈现胞体皱缩，核固缩深染，为行为改变提供了病理学依据。静注GBE后神经症状明显减轻，组织学结果显示，脑梗死范围减小，细胞损伤程度减轻。同时还能一定程度地改善脑水肿，表明GBE对局灶性脑缺血损伤具有保护作用。
银杏叶注射液主要含有银杏黄酮及总内酯，据文献报道黄酮甙具有清除氧自由基的作用，银杏总内酯是专一的血小板活化因子(PAF)的拮抗剂[6]。GBE对脑缺血性损伤的保护作用是否与此有关，其作用机制有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 陈维洲,芮耀诚.脑血管疾病基础与临床研究.济南:山东科技出版社,1993.153
2 Tamura A, Graham D I, McCulluoch J, et al. Focal cerebral ischemia in the rat. 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab, 1981,1:53
3 Bederson J B, Pitts L H, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: Evaluation of the mode and development of a neurologic examination. Stroke,1986,17:472
, 百拇医药
4 Lundy E F. Solik B S, Frank R S, et al. Morphometric evaluation of brain infarcts in rats and gerbils. J Pharmacol Methods, 1986,16:201
5 Hallenbeck J M. The amount of circumscribed brain edema and the degree of post-ischemic neuronal recovery do not correlative well. Stroke, 1982,13:797
6 Braquet P. The ginkgolides: Potent PAF antagonists isolated from Ginkgo bilboa: Chemistry, pharmacology, and clinical applications. Drugs Fut, 1987,12:643
收稿日期：1998-03-26, http://www.100md.com
单位：首都医科大学药理学教研室
关键词：银杏叶注射液；局部脑缺血；脑梗死范围；行为评分
首都医科大学学报990106 提要： 以行为障碍、脑梗死范围、脑含水量、脑组织病理改变为观察指标，研究银杏叶注射液(GBE)对大鼠大脑中动脉闭塞所致局部脑缺血的防治作用。结果表明，GBE 20、40 mg/kg静脉注射可显著降低大鼠脑梗死范围和脑含水量，改善行为障碍。脑组织形态学检查显示，GBE 40 mg/kg组动物脑组织缺血病变较轻。提示GBE对局灶性脑缺血具有保护作用。
中图分类号： R931.5
Beneficial Effects of Ginkgo Bilboa Injection on Experimental Focal Cerebral Ischemia in Rats
, 百拇医药
Ma Yi, Hei Ailian, Jin Youyu, Hu Xiaomin
Department of Pharmacology, Capital University of Medical Sciences
Abstract: Ginkgo bilboa injection, is extracted from ginkgo leaf. The protective effects of ginkgo bilboa extract (GBE) on focal cerebral ischemic injury were studied. Focal cerebral ischemia was produced by permanent occlusion of the proximal portion of the right middle cerebral artery (MCA) with the technique of Tamura. The neurologic status of each rat was carefully evaluated at 8 and 24 h after surgery. The cerebral infarction and water content were measured. The histological changes of brain tissue after MCAO in rats were also studied. Treatment with GBE 20 or 40 mg/kg iv was shown to significantly reduce the cerebral infarction and water content, attenuate neurological deficits. The degree of inhibition of cerebral infarction were 24.4% (P<0.05 ) and 34.7% (P<0.01 ), respectively. In pathological examination, the extent of tissue ischemia in the group of treatment with GBE 40 mg/kg was much less than that of control. These results indicate that GBE protects rats from ischemic neurological damage.
, 百拇医药
Key words: GBE; focal cerebral ischemia; infarct size; neurological deficits
近年来的实验和临床研究表明银杏叶制剂具有改善脑循环障碍和脑神经元功能的作用[1]。但这些制剂大都为口服制剂，有关银杏叶注射液的作用研究尚未见报道。银杏叶注射液(ginkgo bilboa extract for iv, GBE)为高纯度的银杏叶提取物，主要含有银杏黄酮及总内酯。本研究用大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型研究GBE对大鼠局灶性脑缺血的防治作用。
1 材料和方法
Wistar大鼠，雄性，体质量220～270 g，由首都医科大学实验动物中心提供。将动物随机分为5组，即假手术对照组、MCAO模型组、GBE 20 mg/kg组、GBE 40 mg/kg组、金纳多20 mg/kg组。在术前2 min和术后12 h各经舌下静脉给药1次，其中假手术组和MCAO模型组静脉注射等量的山梨醇溶媒(0.2 mL/鼠)。
, 百拇医药
GBE由北京第四制药厂提供，以山梨醇为溶媒；金纳多注射液(ginaton injectionDR○ )由德国舒培大药厂生产，批号0310496；红四氮唑(TTC)为北京化工厂生产。
近端大脑中动脉阻断术：大鼠用12%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。按Tamura等的方法[2]，在大鼠右外耳道与眼外眦连线中点处垂直切开皮肤，逐层分离肌肉，除去颧弓，暴露颞前窝，在颧骨和鳞状骨接合处的前下方约2 mm处钻一小颅窗，暴露右侧MCA近端，以细针挑起、电凝阻断大脑下静脉下缘处的MCA。然后逐层缝合伤口，回笼饲养。假手术组除不阻断MCA外，其余手术步骤同模型组。
行为检测：在术后不同时间(8、24 h)，按Bederson等的方法并加以改进[3]，对动物进行行为评分。标准如下：①提鼠尾离开地面约30 cm，左前肢表现为腕屈曲、肘屈曲、肩内旋或兼而有之者，计1～4分；②将动物置于光滑平面上，轻推肩部使其向对侧移动，检查阻力情况，降低者根据程度不同计1～3分；③根据左前肢肌张力下降程度的差异，计1～3分；④动物有无向一侧不停转圈现象(1分)。满分为11分，分数越高，动物的行为障碍越严重。
, 百拇医药
脑梗死范围的测定：动物经末次行为评分后，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分冠状切成5片，置于5 mL 含60 mg TTC及22.8 mg K2HPO4 的染液中，37 ℃避光温孵30 min。正常组织染成红色，梗死组织呈白色[4]。将白色组织仔细挖下称质量，以梗死组织质量占总脑质量百分比作为脑梗死范围。
脑组织水含量的测定：术后24 h断头取脑，参照Hallenbeck法[5]，切取大脑前极到视交叉处的脑片，分别称量左右脑片的湿质量。105 ℃烘烤48 h至恒质量，计算含水量〔水%=(湿质量-干质量)/湿质量×100%〕。
病理检查：术后24 h，断头取脑，以10%甲醛固定，取视交叉前后脑片，经脱水包埋切片等步骤后作HE染色，在光镜下观察脑组织形态变化。
统计学方法：采用未配对样本的t检验进行组间差异比较。
, 百拇医药
2 结果
2.1 GBE对大鼠行为缺陷程度的影响
MCAO模型组大鼠在术后8、24 h均出现明显的行为改变，主要表现为手术对侧前肢内收，肩内旋，前肢肌张力降低，肩抗力下降。GBE大、小剂量组及金纳多组的大鼠在术后8、24 h，其神经症状均有不同程度的改善。与模型组比较差异显著(P<0.01，P<0.05)。假手术组未见行为异常改变(表1)。
表1 GBE和金纳多对MCAO大鼠行为缺陷程度和脑梗死范围的影响 组别
n
行为评分值
脑梗死范围/%
8 h
, http://www.100md.com
24 h
假手术组
8
0
0
0
MCAO模型组
9
6.8±1.6
5.9±1.4
9.33±2.22
GBE组
20 mg.kg-1
, 百拇医药
9
5.0±1.9*
4.3±1.7*
7.05±2.04*
40 mg.kg-1
9
4.2±1.7**
3.7±1.5**
6.09±2.19**
金纳多组/20 mg.kg-1
, 百拇医药
8
4.4±1.8*
3.9±1.6*
6.27±2.00**
与MCAO模型组比较*P<0.05，**P<0.01
2.2 GBE对大鼠脑梗死范围的影响
术后24 h，除假手术组外，其他各组大鼠大脑皮质均出现明显的梗死灶。GBE 20、40 mg/kg及金纳多20 mg/kg均可显著降低脑梗死范围；与模型组比较分别降低24.4%、34.7%和32.8%(表1)。
2.3 GBE对大鼠脑组织含水量的影响
, http://www.100md.com
假手术组未出现脑水肿，其他各组病灶侧半球含水量明显增加，与对侧半球比较P<0.01。GBE 20、40 mg/kg组及金纳多组的动物，脑水肿程度较模型组明显降低(P<0.01，表2)。
表2 GBE和金纳多对MCAO大鼠脑组织含水量的影响 组别
脑组织含水量/%
左侧半球
右侧半球
假手术组
77.80±0.58
77.66±0.56**
MCAO模型组
, 百拇医药
78.14±0.89
79.81±0.75△△
GBE组
20 mg.kg-1
78.21±0.41
78.97±0.32**△△
40 mg.kg-1
78.21±0.31
78.90±0.22**△△
金纳多组/20 mg.kg-1
, http://www.100md.com
78.17±0.27
78.92±0.45**△△
各组n=10；**与MCAO模型组比较P<0.01；
△△与左侧半球比较P<0.01
2.4 GBE对大鼠脑组织形态学变化的影响
MCAO后24 h，模型组大鼠病灶侧半球MCA供血区苍白、无光泽，脑表面血管较对侧充血。脑病理切片显示，假手术组神经细胞数量多，胞浆丰富，核质细，核仁清楚。模型组前脑皮质神经细胞稀疏，可见大量变性及坏死的神经细胞，表现为胞体皱缩，核固缩深染。GBE 40 mg/kg组仅见少量神经细胞变性坏死，胞体变形缩小，表明脑缺血程度明显轻于模型组。
3 讨论
, 百拇医药
为评价药物对脑缺血的疗效，建立一个接近临床病人且重复性好的动物模型是非常必要的。既往关于银杏叶制剂对缺血性脑损伤的保护作用有过研究，但以大脑中动脉凝闭所致局灶性脑缺血模型来研究银杏叶制剂的作用还未见报道。根据Tamura等人的方法[2]，本研究采用电凝闭造成大鼠单侧大脑中动脉阻断模型，手术创伤小，成功率高，接近临床脑梗死的形成，且重复性好。
本研究发现术后8 h，MCAO大鼠手术对侧前肢均出现明显的运动障碍，24 h后略有改善。提示大脑中动脉阻断后皮质运动区或纹状体产生缺血性损伤。形态学研究表明，MCAO后24 h，颞侧皮质出现明显的梗死灶，光镜下可见大量的神经细胞变性坏死，呈现胞体皱缩，核固缩深染，为行为改变提供了病理学依据。静注GBE后神经症状明显减轻，组织学结果显示，脑梗死范围减小，细胞损伤程度减轻。同时还能一定程度地改善脑水肿，表明GBE对局灶性脑缺血损伤具有保护作用。
银杏叶注射液主要含有银杏黄酮及总内酯，据文献报道黄酮甙具有清除氧自由基的作用，银杏总内酯是专一的血小板活化因子(PAF)的拮抗剂[6]。GBE对脑缺血性损伤的保护作用是否与此有关，其作用机制有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 陈维洲,芮耀诚.脑血管疾病基础与临床研究.济南:山东科技出版社,1993.153
2 Tamura A, Graham D I, McCulluoch J, et al. Focal cerebral ischemia in the rat. 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab, 1981,1:53
3 Bederson J B, Pitts L H, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: Evaluation of the mode and development of a neurologic examination. Stroke,1986,17:472
, 百拇医药
4 Lundy E F. Solik B S, Frank R S, et al. Morphometric evaluation of brain infarcts in rats and gerbils. J Pharmacol Methods, 1986,16:201
5 Hallenbeck J M. The amount of circumscribed brain edema and the degree of post-ischemic neuronal recovery do not correlative well. Stroke, 1982,13:797
6 Braquet P. The ginkgolides: Potent PAF antagonists isolated from Ginkgo bilboa: Chemistry, pharmacology, and clinical applications. Drugs Fut, 1987,12:643
收稿日期：1998-03-26, http://www.100md.com