石蜡包埋组织中结核菌抗酸染色与PCR检测意义的探讨
作者：陈元栋 曹留斌 陈同钰
单位：苏州医学院附属三院，常州，213003
关键词：结核菌；抗酸染色；PCR检测
苏州医学院学报991114 摘要 对61例拟诊为结核病和10例正常胎儿肺组织的石蜡包埋组织分别进行组织化学方法(抗酸染色)和PCR检测结果，结核组61例中，抗酸染色阳性28例，阳性率为45.9%；PCR检测阳性40例，阳性率为65.6%。两种方法阳性检出率差异显著(P<0.005)。对照组10例，两种方法检测均为阴性。结果表明，PCR检测石蜡组织中的结核菌，具有较高的灵敏度和特异性。
中图法分类 R52.04； R446.8
石蜡包埋组织中结核的病理检测，是结核病临床诊断的主要手段之一。随着分子生物学的发展，结核病原学检查不断出现突破性进展。近年来，我们对石蜡包埋组织中的结核菌，同时进行抗酸染色和PCR扩增技术检测，以探讨其在临床医学诊断中的意义。
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1 材料、方法与结果
1.1 组织标本：1995～1998年的石蜡包埋组织61例，其中男28例，女33例，年龄5～75岁。颈部淋巴结26例，胸膜10例，支气管粘膜10例，乳房脓肿4例，肾脏7例，肠粘膜3例，鼻腔粘膜1例。另选10例正常胎儿肺组织作为对照。
1.2 仪器：澳大利亚PTs320型自动热循环仪，紫外反射透射仪，高速离心机，电泳仪等。
1.3 引物序列：①5′-TCC GCT GCC AGT CGT CTT CC-3′；②5′-GTC CTC GCG AGT CTA GGC CA-3′。由军事医学科学院放射医学研究所提供。
1.4 Ziehl-Neelsen氏石炭酸品红抗酸杆菌染色：石蜡切片脱蜡至水洗后，将Ziehl-Neelsen氏石炭酸品红染液滴加于切片上，微火加热至有蒸气出现约5min，用0.5%盐酸酒精液分化至无红色染料留下为止约1min，水洗1～2min；用0.5%美蓝水溶液作对比染色20～60s，水洗1～2min；用95%酒精分化数秒钟，然后无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结核杆菌呈亮红色，其它组织呈浅蓝色。
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1.5 TB-DNA的提取：取5～8张厚4μm的石蜡切片置Eppendorf管内加入二甲苯溶液1ml，混匀，加盖加温于55℃ 15min，以1200r/min离心5min，除上清后，再用棉棒吸干，重复2次。沉淀加入1ml无水乙醇，翻转混匀，加温55℃ 15min以1400r/min离心5min，除上清后，再用棉棒吸干，重复两次，畅盖置于70℃水浴中10min，组织集成块状、变硬即可，加入100μl裂解液I，置于55℃水浴过夜。次日加100μl裂解液II和200μl氯仿异戊醇(24∶1)混合液，翻转混匀，振荡5min后，以1500r/min离心10min，取上清约250μl，置于另一个Eppendorf管内。加入-20℃无水乙醇800μl，翻转混匀，置于-28℃冰箱内30min，然后1500r/min离心10min，弃上清，用棉棒吸干。加入-20℃的75%酒精800μl，翻转混匀置于-28℃冰箱内30min，以1500r/min离心10min，弃上清，用棉棒吸干，此过程重复两次，畅盖置于70℃水浴蒸发至组织呈粉末状。
, http://www.100md.com 1.6 TB-DNA的扩增：用澳大利亚PTs320型自动热循环仪进行PCR扩增，在0.5ml Eppendorf管内加入反应试剂(内含引物、酶缓冲液、dNTPs及无菌双蒸水)20μl，加入膜板DNA 5μl，同时设阳性、阴性及无模板对照，20μl无菌石蜡油封面，稍离心后，按以下条件扩增：第一次循环94℃ 30s,70℃ 45s,共10次；第二次循环94℃ 30s，55℃ 30s,72℃ 60s，共30次。取扩增产物15μl，在1.5%琼脂糖凝胶板上电泳30min(5V/cm)(含0.5mg/L溴化乙淀)，置于反射紫外灯下观察结果，凝胶在254bp处出现橙色荧光带者为阳性，反之为阴性。
1.7 结果：经Zihehl-Neelsen氏石炭酸品红抗酸杆菌染色的61例结核病标本中，结核杆菌阳性28例，阴性33例。而以PCR扩增后，结核菌PCR阳性40例，阴性21例。抗酸染色阳性者，PCR检测均为阳性。另10例正常胎儿肺组织均为阴性。
2 讨论
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结核病的诊断常根据临床情况、X线检查、直接涂片镜检、细菌培养及病理切片等传统检查方法，但敏感性低，特异性差，常延误治疗时机。本文40例结核菌PCR阳性者，由于诊断明确，及时给予抗痨治疗，其中39例已痊愈，仅有1例鼻腔粘膜结核病人正在随访中。另21例结核菌PCR阴性者，经抗菌治疗亦痊愈。
Ziehl-Neelsen氏石炭酸品红抗酸杆菌染色时，可用一张已知的阳性切片同染作为对照；如不用火加热染色，可将切片放置已过滤好的石炭酸品红液中，并将染色缸置于65℃温箱中加温染色30～40min亦能达到染色效果。
PCR检测方法敏感性较高，无论是死菌、治菌的DNA都可以扩增，任何微量污染和不规则操作都有可能出现假阳性，因此操作台面及实验用品应严格消毒，所有检测用品如试管、Eppedndorf管、吸头、棉棒等，均限于一次性使用，防止交叉感染。
处理标本要及时，固定标本时间应适宜，否则会影响特异性扩增产物的结合。在操作过程中弃上清或用棉棒吸干上清，都对提高DNA的浓度极有效。另外，虽然PCR检测仅需微量标本，但我们认为标本量多或含干酪样物则阳性检出率越高。
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蛋白酶K浓度过高及时间太长，易使组织消化过度，而使核酸丢失和弥散；浓度过低及时间过短又达不到消化效果，影响靶核酸暴露，不利于PCR扩增。所以在操作时一定要严格掌握时间。
参考文献
1 林万明.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993∶37
2 胡 敏，等.聚合酶链原位扩增法检测肺石蜡切片结核菌DNA.中华结核和呼吸杂志，1994，17(3)∶79
3 阿 西，等.石蜡包埋组织中结核菌DNA与抗酸菌L型检测意义的探讨.陕西医学检验杂志，1998，13(1)∶35
(1999年4月12日收稿), http://www.100md.com
单位：苏州医学院附属三院，常州，213003
关键词：结核菌；抗酸染色；PCR检测
苏州医学院学报991114 摘要 对61例拟诊为结核病和10例正常胎儿肺组织的石蜡包埋组织分别进行组织化学方法(抗酸染色)和PCR检测结果，结核组61例中，抗酸染色阳性28例，阳性率为45.9%；PCR检测阳性40例，阳性率为65.6%。两种方法阳性检出率差异显著(P<0.005)。对照组10例，两种方法检测均为阴性。结果表明，PCR检测石蜡组织中的结核菌，具有较高的灵敏度和特异性。
中图法分类 R52.04； R446.8
石蜡包埋组织中结核的病理检测，是结核病临床诊断的主要手段之一。随着分子生物学的发展，结核病原学检查不断出现突破性进展。近年来，我们对石蜡包埋组织中的结核菌，同时进行抗酸染色和PCR扩增技术检测，以探讨其在临床医学诊断中的意义。
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1 材料、方法与结果
1.1 组织标本：1995～1998年的石蜡包埋组织61例，其中男28例，女33例，年龄5～75岁。颈部淋巴结26例，胸膜10例，支气管粘膜10例，乳房脓肿4例，肾脏7例，肠粘膜3例，鼻腔粘膜1例。另选10例正常胎儿肺组织作为对照。
1.2 仪器：澳大利亚PTs320型自动热循环仪，紫外反射透射仪，高速离心机，电泳仪等。
1.3 引物序列：①5′-TCC GCT GCC AGT CGT CTT CC-3′；②5′-GTC CTC GCG AGT CTA GGC CA-3′。由军事医学科学院放射医学研究所提供。
1.4 Ziehl-Neelsen氏石炭酸品红抗酸杆菌染色：石蜡切片脱蜡至水洗后，将Ziehl-Neelsen氏石炭酸品红染液滴加于切片上，微火加热至有蒸气出现约5min，用0.5%盐酸酒精液分化至无红色染料留下为止约1min，水洗1～2min；用0.5%美蓝水溶液作对比染色20～60s，水洗1～2min；用95%酒精分化数秒钟，然后无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结核杆菌呈亮红色，其它组织呈浅蓝色。
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1.5 TB-DNA的提取：取5～8张厚4μm的石蜡切片置Eppendorf管内加入二甲苯溶液1ml，混匀，加盖加温于55℃ 15min，以1200r/min离心5min，除上清后，再用棉棒吸干，重复2次。沉淀加入1ml无水乙醇，翻转混匀，加温55℃ 15min以1400r/min离心5min，除上清后，再用棉棒吸干，重复两次，畅盖置于70℃水浴中10min，组织集成块状、变硬即可，加入100μl裂解液I，置于55℃水浴过夜。次日加100μl裂解液II和200μl氯仿异戊醇(24∶1)混合液，翻转混匀，振荡5min后，以1500r/min离心10min，取上清约250μl，置于另一个Eppendorf管内。加入-20℃无水乙醇800μl，翻转混匀，置于-28℃冰箱内30min，然后1500r/min离心10min，弃上清，用棉棒吸干。加入-20℃的75%酒精800μl，翻转混匀置于-28℃冰箱内30min，以1500r/min离心10min，弃上清，用棉棒吸干，此过程重复两次，畅盖置于70℃水浴蒸发至组织呈粉末状。
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1.7 结果：经Zihehl-Neelsen氏石炭酸品红抗酸杆菌染色的61例结核病标本中，结核杆菌阳性28例，阴性33例。而以PCR扩增后，结核菌PCR阳性40例，阴性21例。抗酸染色阳性者，PCR检测均为阳性。另10例正常胎儿肺组织均为阴性。
2 讨论
, 百拇医药
结核病的诊断常根据临床情况、X线检查、直接涂片镜检、细菌培养及病理切片等传统检查方法，但敏感性低，特异性差，常延误治疗时机。本文40例结核菌PCR阳性者，由于诊断明确，及时给予抗痨治疗，其中39例已痊愈，仅有1例鼻腔粘膜结核病人正在随访中。另21例结核菌PCR阴性者，经抗菌治疗亦痊愈。
Ziehl-Neelsen氏石炭酸品红抗酸杆菌染色时，可用一张已知的阳性切片同染作为对照；如不用火加热染色，可将切片放置已过滤好的石炭酸品红液中，并将染色缸置于65℃温箱中加温染色30～40min亦能达到染色效果。
PCR检测方法敏感性较高，无论是死菌、治菌的DNA都可以扩增，任何微量污染和不规则操作都有可能出现假阳性，因此操作台面及实验用品应严格消毒，所有检测用品如试管、Eppedndorf管、吸头、棉棒等，均限于一次性使用，防止交叉感染。
处理标本要及时，固定标本时间应适宜，否则会影响特异性扩增产物的结合。在操作过程中弃上清或用棉棒吸干上清，都对提高DNA的浓度极有效。另外，虽然PCR检测仅需微量标本，但我们认为标本量多或含干酪样物则阳性检出率越高。
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蛋白酶K浓度过高及时间太长，易使组织消化过度，而使核酸丢失和弥散；浓度过低及时间过短又达不到消化效果，影响靶核酸暴露，不利于PCR扩增。所以在操作时一定要严格掌握时间。
参考文献
1 林万明.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993∶37
2 胡 敏，等.聚合酶链原位扩增法检测肺石蜡切片结核菌DNA.中华结核和呼吸杂志，1994，17(3)∶79
3 阿 西，等.石蜡包埋组织中结核菌DNA与抗酸菌L型检测意义的探讨.陕西医学检验杂志，1998，13(1)∶35
(1999年4月12日收稿), http://www.100md.com