IL-12对慢性丙型肝炎病毒感染者淋巴细胞增殖的影响
作者：范学工 易红 欧志明 胡国龄
单位：范学工(湖南医科大学湘雅医院中心实验室，长沙 410008)；易红(湖南宁乡县人民医院，宁乡 410012)；欧志明(湖南医科大学湘雅医院传 染科，长沙 410008)；胡国龄(湖南医科大学湘雅医院中心实验室，长沙 410008)
关键词：白细胞介素-12；丙型肝炎病毒；增殖反应；淋巴细胞
中国免疫学杂志000418 摘 要 目的：观察重组人白细胞介素12(rhIL-12)对慢性 丙型肝炎病毒(HCV)感染者淋巴细胞增殖的影响。方法：外周血单个 核细胞(PBMC)分别与植物血凝 素(PHA)，HCV抗原c22、c100-3，rhIL-12和抗IL-12抗体孵育5 d后，加入胸腺嘧啶核 苷 ( 3H-TdR)，然后收集细胞于液闪仪测定每分种脉冲数(cpm)。 结果：不论是健康对照者(P <0.025)，抑或慢性HCV感染者(P <0.01)，rhIL-12在体外可显著增加其淋巴细胞对PHA的 增殖反应。同时，rhIL-12亦能显著增强HCV感染者对HCV抗原c22的增殖反应(P<0.01)。[ HT5”H 结论：rhIL-12可在体外显著增加慢性HCV感染者淋巴细胞的增殖反应， 该结果为今后使用IL-1 2治疗这类病人提供了重要的实验根据。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R512.6
Effect of IL-12 on lymphoproliferative response in individuals with chronic hep atitis C virus infection
FAN Xue-Gong YI Hong OU Zhi-Ming
(Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008)
Abstract Objective：To investigate the effect of IL-12 on lymphopr oliferative response in individuals with chronic hepatitis C virus (HCV) infecti on. Methods: Peripheral lymphocytes were co-cultured with p hytohaemagglutinin ( PHA), HCV antigens c22 or c100-3 in the presence of recombinant human IL-12 (r hI L-12) or anti-IL-12 antibody, respectively. After 5 days culture, 3H- TdR was the n added and counts per minute (cpm) were measured. Results: Based on cpm, an in crease in peripheral blood lymphocyte proliferation was observed in healthy cont rols (P<0.025) as well as in individuals with chronic HCV infection (P<0.01) whe n lymphocytes were co-cultured with PHA in the presence of rhIL-12 compared to t hat in the absence of rhIL-12. Also, rhIL-12 enhanced lymphoproliferative resp onse to HCV antigens in HCV infected individuals (P<0.01). Conclusion: rhIL-12 ca n significantly enhance lymphoproliferative response in vitro, which may be impl icated in treatment for such patients.
, 百拇医药
Key words Interleukin 12 Hepatitis C virus Proliferativ e response Lymphocytes
丙型肝炎病毒(HCV)感染是输血后肝炎的主要病因，我们以前 的研究发现，慢性HCV感染宿主细胞免疫功能低下，这可能是导致这类病人感染慢性化的重 要机制[1,2]。白 细胞介素(IL)-12是目前发现的促进T细胞活性最强的细胞因子，能够回复某些感染性疾 病的免疫缺陷[3]。为了探讨IL-12能否在体外改善慢性HCV感染者的免疫功能，本 文观察了IL-12对这些病人外周血淋巴细胞增殖反应的作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 对象 10例(男性6例，女性4例)慢性HCV感染者系我科的住院和门诊 患者，以及筛查出的职业献血员，感染史至少在1年以上。年龄从27岁～53岁，平均35.7岁 。5例患者均有受血史。HCV感染的诊断根据血清抗HCV抗体和血清HCV-RNA的测定，所有病 例血清抗HCV抗体和HCV-RNA均为阳性，研究前3个月内均未使用过免疫调节剂或抗病毒剂。 重叠有乙型肝炎病毒(HBV)或庚型肝炎病毒(HGV)感染者及合并有其他严重疾患者从研 究组中去除。6名我院健康献血员作为正常对照，他们均无HBV和HCV感染。其中男性2人，女 性4人，年龄28～40岁，平均36岁。
, 百拇医药
1.2 淋巴细胞增殖反应 按我们以前报道的方法进行[4]。 取研究对象外周血，肝素抗凝，常规分离外周 血单个核细胞(PBMC)，PBMC置96孔培养板，每孔1×105细胞，根据实验要求，分别于培 养 孔中加植物血凝素(PHA，Sigma，10 μg/ml)，HCV重组抗原(10 μg/ml)c22、c100-3 (NS 4)，重组人IL-12 p70(rhIL-12，PharMingen，500 pg/ml)和多克隆兔抗人IL-12抗体 (Genzyme，1:1 000)。HCV抗原由美国Chiron公司惠赠。每一样品设3个平行孔。培养5 d 后，每 孔加1 μCi胸腺嘧啶核苷( 3H-TdR，北京中国原子能科学研究院)，再孵育24 h， 然后收集细胞，于液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。
1.3 其他 血清HBV标志物、抗HCV抗体和抗HGV抗体测定采用 酶联免疫吸附试验(ELISA)，试剂盒分别购于洛阳华美生物工程公司和珠海生物试剂工程 公司；血清HCV-RNA检测采用RT-PCR，试剂盒购自厦门长城生物工程公司。上述实验均按 说明书程序操作。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 采用配对t检验。
2 结果
慢性HCV感染者对PHA刺激的淋巴细胞增殖反应明显低于健康对照者 (P<0.05)见表1。不论是健康对照者，抑或慢性HCV感染者，rhIL-12在体外 可显著增加其淋巴细 胞对PHA的增殖反应。在rhIL-12作用后，HCV感染者淋巴细胞对PHA刺激的增殖反应可达到 健康人水平。同时，rhIL-12亦能显著增强HCV感染者淋巴细胞对HCV抗原的增殖反应，尽管对c100-3的反应未能达到统计学意义。本文结果还表明，对静息状态的或增殖反应 不显著的淋 巴细胞，rhIL-12不能影响其增殖反应，说明rhIL-12仅能增强激活的淋巴细胞的增殖活 性。为进一步证实IL-12在淋巴细胞增殖中的作用，于PBMC培养孔中加入抗IL-12抗体 。结果显示，PHA刺激的淋巴细胞增殖反应明显减低(表2)，证实在淋巴细胞增殖反应中， IL-12是必需的。
, 百拇医药 表1 rhIL-12对淋巴细胞增殖的影响(
±s)
Tab.1 Effect of rhIL-12 on lymphoproliferative response (±s) Groups
Lymphocyte response(cpm)
P values
Healthy controls(n=6)
PBMC
PBMC+rhIL-12
, 百拇医药 158±8
179±16
>0.05
PBMC+PHA
PBMC+PHA+rhIL-12
20 007±2 186
33 084±5 151
<0.025
PBMC+c22
PBMC+c22+rhIL-12
217±19
375±114
, 百拇医药
>0.05
PBMC+c100-3
PBMC+c100-3+rhIL-12
162±14
213±20
>0.05
HCV patients(n=10)
PBMC
PBMC+rhIL-12
218±28
206±32
>0.05
, 百拇医药
PBMC+PHA
PBMC+PHA+rhIL-12
13 556±3 093
27 325±6 106
<0.01
PBMC+c22
PBMC+c22+rhIL-12
737±137
1 343±298
<0.01
PBMC+c100-3
, http://www.100md.com
PBMC+c100-3+rhIL-12
485±78
819±281
>0.05
表2 抗IL-12抗体对健康对照者淋巴细胞增殖的影响(±s)1)
Tab.2 Effect of anti-IL-12 antibody on lymphocyte response(± s)1)
Lymphocyte response(cpm)
, http://www.100md.com
P values
PBMC
227±21
PBMC+PHZ
PBMC+PHA+anti-IL-12
18 506±2 936
9 210±1 124
<0.001
Note:1) Controls
3 讨论
国内、外的研究显示，慢性HCV感染者存在增强的Th2免疫应答。增强的Th2应答可抑制宿主 的细胞免疫功能，使其不能清除病毒，这可能是HCV感染慢性化的重要机制之一[1,5，6]。IL-12是主要由单核-巨噬细胞和B细胞产生的细胞因子。研究发现，IL-12可增 强或 改善艾滋病、麻风、利氏曼原虫和血吸虫等慢性感染宿主的细胞免疫功能，从而达到根除感 染的作用，其主要机理是IL-12能促进Th1免疫应答[3]。因而，IL-12在抗感 染免疫中有着广 泛的应用前景。本研究证实，IL-12能显著增强外周血淋巴细胞对PHA刺激的增殖反应，并 使 慢性HCV感染者的淋巴细胞增殖反应达到健康对照者的增殖水平(未加IL-12时)。此外，I L -12亦能增加HCV感染者对HCV抗原的特异性增殖反应。上述结果提示，慢性HCV感染者的IL -1 2产生或活性是低下的，亦进一步说明慢性HCV感染者存在减弱的Th1免疫应答。用抗IL-12 抗 体后，健康对照者淋巴细胞增殖反应显著减低，也肯定了IL-12在淋巴细胞增殖中的作用。 IL-12对HCV感染者Th1和Th2细胞因子产生的影响如何，有关工作正在进一步进行之中。
, 百拇医药
HCV感染的慢性化是目前HCV研究中的难点，如何使宿主的免疫系统能有效地清除 病毒，是研究者们关注的问题。除了HCV的基因变异因素外，宿主免疫应答在HCV感染慢性化 中的作用如何，现在仍所知甚少[4，5]。本研究结果为今后使用IL-12作为免 疫调节剂，治疗 HCV感染者，改善其免疫功能，从而最终清除病毒感染提供了重要的实验根据。
致谢：感谢美国Chiron 公司 Michael Houghton 博士提供 HCV 重组抗原。
国家教委优秀年轻教师基金(教人司 1996 486-2)和卫生部优秀青年人才基金资助(96Q-023)
作者简介：范学工，男，41岁，博士导师，教授，从事感染与免疫的研究
4 参考文献
1，Fan X G, Liu W E, Li C Z et al. Circulating Th1 and Th2 cytokines in patients with hepatitis C virus infection. Mediators Inflam , 1998; 7:295
, 百拇医药
2，范学工，唐发清，欧志明 et al.慢性丙型肝炎病毒感染者外周血淋巴细胞增殖反 应.世界华人消化杂志，1999；7(12)：1038
3，范学工. 感染性疾病的Th1和Th2免疫应答. 中华内科杂志，1998; 37(5):350
4，Fan X G, Yakoob J, Fan X J et al. Effect of IL-4 on peri pheral blood lymphocyt e proliferation: implication in immunopathogenesis of H. pylori infection. Immun ol Lett, 1995; 48:45
5，Cacciarelli T V, Martinez O M, Gish R G et al. Immunoregul atory cytokines in ch ronic hepatitis C virus infection: pre-and posttreatment with interferon alfa. Hepatology, 1996; 24:6
6，Tsai S L, Liaw Y F, Chen M H et al. Detection of type 2-l ike T-helper cells in hepatitis C virus infection: implications for hepatitis C virus chronicity. Hepa tology, 1997; 25:449
[收稿1998-10-28 修回1999-03-25], 百拇医药
单位：范学工(湖南医科大学湘雅医院中心实验室，长沙 410008)；易红(湖南宁乡县人民医院，宁乡 410012)；欧志明(湖南医科大学湘雅医院传 染科，长沙 410008)；胡国龄(湖南医科大学湘雅医院中心实验室，长沙 410008)
关键词：白细胞介素-12；丙型肝炎病毒；增殖反应；淋巴细胞
中国免疫学杂志000418 摘 要 目的：观察重组人白细胞介素12(rhIL-12)对慢性 丙型肝炎病毒(HCV)感染者淋巴细胞增殖的影响。方法：外周血单个 核细胞(PBMC)分别与植物血凝 素(PHA)，HCV抗原c22、c100-3，rhIL-12和抗IL-12抗体孵育5 d后，加入胸腺嘧啶核 苷 ( 3H-TdR)，然后收集细胞于液闪仪测定每分种脉冲数(cpm)。 结果：不论是健康对照者(P <0.025)，抑或慢性HCV感染者(P <0.01)，rhIL-12在体外可显著增加其淋巴细胞对PHA的 增殖反应。同时，rhIL-12亦能显著增强HCV感染者对HCV抗原c22的增殖反应(P<0.01)。[ HT5”H 结论：rhIL-12可在体外显著增加慢性HCV感染者淋巴细胞的增殖反应， 该结果为今后使用IL-1 2治疗这类病人提供了重要的实验根据。
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中国图书分类号 R512.6
Effect of IL-12 on lymphoproliferative response in individuals with chronic hep atitis C virus infection
FAN Xue-Gong YI Hong OU Zhi-Ming
(Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008)
Abstract Objective：To investigate the effect of IL-12 on lymphopr oliferative response in individuals with chronic hepatitis C virus (HCV) infecti on. Methods: Peripheral lymphocytes were co-cultured with p hytohaemagglutinin ( PHA), HCV antigens c22 or c100-3 in the presence of recombinant human IL-12 (r hI L-12) or anti-IL-12 antibody, respectively. After 5 days culture, 3H- TdR was the n added and counts per minute (cpm) were measured. Results: Based on cpm, an in crease in peripheral blood lymphocyte proliferation was observed in healthy cont rols (P<0.025) as well as in individuals with chronic HCV infection (P<0.01) whe n lymphocytes were co-cultured with PHA in the presence of rhIL-12 compared to t hat in the absence of rhIL-12. Also, rhIL-12 enhanced lymphoproliferative resp onse to HCV antigens in HCV infected individuals (P<0.01). Conclusion: rhIL-12 ca n significantly enhance lymphoproliferative response in vitro, which may be impl icated in treatment for such patients.
, 百拇医药
Key words Interleukin 12 Hepatitis C virus Proliferativ e response Lymphocytes
丙型肝炎病毒(HCV)感染是输血后肝炎的主要病因，我们以前 的研究发现，慢性HCV感染宿主细胞免疫功能低下，这可能是导致这类病人感染慢性化的重 要机制[1,2]。白 细胞介素(IL)-12是目前发现的促进T细胞活性最强的细胞因子，能够回复某些感染性疾 病的免疫缺陷[3]。为了探讨IL-12能否在体外改善慢性HCV感染者的免疫功能，本 文观察了IL-12对这些病人外周血淋巴细胞增殖反应的作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 对象 10例(男性6例，女性4例)慢性HCV感染者系我科的住院和门诊 患者，以及筛查出的职业献血员，感染史至少在1年以上。年龄从27岁～53岁，平均35.7岁 。5例患者均有受血史。HCV感染的诊断根据血清抗HCV抗体和血清HCV-RNA的测定，所有病 例血清抗HCV抗体和HCV-RNA均为阳性，研究前3个月内均未使用过免疫调节剂或抗病毒剂。 重叠有乙型肝炎病毒(HBV)或庚型肝炎病毒(HGV)感染者及合并有其他严重疾患者从研 究组中去除。6名我院健康献血员作为正常对照，他们均无HBV和HCV感染。其中男性2人，女 性4人，年龄28～40岁，平均36岁。
, 百拇医药
1.2 淋巴细胞增殖反应 按我们以前报道的方法进行[4]。 取研究对象外周血，肝素抗凝，常规分离外周 血单个核细胞(PBMC)，PBMC置96孔培养板，每孔1×105细胞，根据实验要求，分别于培 养 孔中加植物血凝素(PHA，Sigma，10 μg/ml)，HCV重组抗原(10 μg/ml)c22、c100-3 (NS 4)，重组人IL-12 p70(rhIL-12，PharMingen，500 pg/ml)和多克隆兔抗人IL-12抗体 (Genzyme，1:1 000)。HCV抗原由美国Chiron公司惠赠。每一样品设3个平行孔。培养5 d 后，每 孔加1 μCi胸腺嘧啶核苷( 3H-TdR，北京中国原子能科学研究院)，再孵育24 h， 然后收集细胞，于液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。
1.3 其他 血清HBV标志物、抗HCV抗体和抗HGV抗体测定采用 酶联免疫吸附试验(ELISA)，试剂盒分别购于洛阳华美生物工程公司和珠海生物试剂工程 公司；血清HCV-RNA检测采用RT-PCR，试剂盒购自厦门长城生物工程公司。上述实验均按 说明书程序操作。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 采用配对t检验。
2 结果
慢性HCV感染者对PHA刺激的淋巴细胞增殖反应明显低于健康对照者 (P<0.05)见表1。不论是健康对照者，抑或慢性HCV感染者，rhIL-12在体外 可显著增加其淋巴细 胞对PHA的增殖反应。在rhIL-12作用后，HCV感染者淋巴细胞对PHA刺激的增殖反应可达到 健康人水平。同时，rhIL-12亦能显著增强HCV感染者淋巴细胞对HCV抗原的增殖反应，尽管对c100-3的反应未能达到统计学意义。本文结果还表明，对静息状态的或增殖反应 不显著的淋 巴细胞，rhIL-12不能影响其增殖反应，说明rhIL-12仅能增强激活的淋巴细胞的增殖活 性。为进一步证实IL-12在淋巴细胞增殖中的作用，于PBMC培养孔中加入抗IL-12抗体 。结果显示，PHA刺激的淋巴细胞增殖反应明显减低(表2)，证实在淋巴细胞增殖反应中， IL-12是必需的。
, 百拇医药 表1 rhIL-12对淋巴细胞增殖的影响(
±s)Tab.1 Effect of rhIL-12 on lymphoproliferative response (
±s) GroupsLymphocyte response(cpm)
P values
Healthy controls(n=6)
PBMC
PBMC+rhIL-12
, 百拇医药 158±8
179±16
>0.05
PBMC+PHA
PBMC+PHA+rhIL-12
20 007±2 186
33 084±5 151
<0.025
PBMC+c22
PBMC+c22+rhIL-12
217±19
375±114
, 百拇医药
>0.05
PBMC+c100-3
PBMC+c100-3+rhIL-12
162±14
213±20
>0.05
HCV patients(n=10)
PBMC
PBMC+rhIL-12
218±28
206±32
>0.05
, 百拇医药
PBMC+PHA
PBMC+PHA+rhIL-12
13 556±3 093
27 325±6 106
<0.01
PBMC+c22
PBMC+c22+rhIL-12
737±137
1 343±298
<0.01
PBMC+c100-3
, http://www.100md.com
PBMC+c100-3+rhIL-12
485±78
819±281
>0.05
表2 抗IL-12抗体对健康对照者淋巴细胞增殖的影响(
±s)1)Tab.2 Effect of anti-IL-12 antibody on lymphocyte response(
± s)1)Lymphocyte response(cpm)
, http://www.100md.com
P values
PBMC
227±21
PBMC+PHZ
PBMC+PHA+anti-IL-12
18 506±2 936
9 210±1 124
<0.001
Note:1) Controls
3 讨论
国内、外的研究显示，慢性HCV感染者存在增强的Th2免疫应答。增强的Th2应答可抑制宿主 的细胞免疫功能，使其不能清除病毒，这可能是HCV感染慢性化的重要机制之一[1,5，6]。IL-12是主要由单核-巨噬细胞和B细胞产生的细胞因子。研究发现，IL-12可增 强或 改善艾滋病、麻风、利氏曼原虫和血吸虫等慢性感染宿主的细胞免疫功能，从而达到根除感 染的作用，其主要机理是IL-12能促进Th1免疫应答[3]。因而，IL-12在抗感 染免疫中有着广 泛的应用前景。本研究证实，IL-12能显著增强外周血淋巴细胞对PHA刺激的增殖反应，并 使 慢性HCV感染者的淋巴细胞增殖反应达到健康对照者的增殖水平(未加IL-12时)。此外，I L -12亦能增加HCV感染者对HCV抗原的特异性增殖反应。上述结果提示，慢性HCV感染者的IL -1 2产生或活性是低下的，亦进一步说明慢性HCV感染者存在减弱的Th1免疫应答。用抗IL-12 抗 体后，健康对照者淋巴细胞增殖反应显著减低，也肯定了IL-12在淋巴细胞增殖中的作用。 IL-12对HCV感染者Th1和Th2细胞因子产生的影响如何，有关工作正在进一步进行之中。
, 百拇医药
HCV感染的慢性化是目前HCV研究中的难点，如何使宿主的免疫系统能有效地清除 病毒，是研究者们关注的问题。除了HCV的基因变异因素外，宿主免疫应答在HCV感染慢性化 中的作用如何，现在仍所知甚少[4，5]。本研究结果为今后使用IL-12作为免 疫调节剂，治疗 HCV感染者，改善其免疫功能，从而最终清除病毒感染提供了重要的实验根据。
致谢：感谢美国Chiron 公司 Michael Houghton 博士提供 HCV 重组抗原。
国家教委优秀年轻教师基金(教人司 1996 486-2)和卫生部优秀青年人才基金资助(96Q-023)
作者简介：范学工，男，41岁，博士导师，教授，从事感染与免疫的研究
4 参考文献
1，Fan X G, Liu W E, Li C Z et al. Circulating Th1 and Th2 cytokines in patients with hepatitis C virus infection. Mediators Inflam , 1998; 7:295
, 百拇医药
2，范学工，唐发清，欧志明 et al.慢性丙型肝炎病毒感染者外周血淋巴细胞增殖反 应.世界华人消化杂志，1999；7(12)：1038
3，范学工. 感染性疾病的Th1和Th2免疫应答. 中华内科杂志，1998; 37(5):350
4，Fan X G, Yakoob J, Fan X J et al. Effect of IL-4 on peri pheral blood lymphocyt e proliferation: implication in immunopathogenesis of H. pylori infection. Immun ol Lett, 1995; 48:45
5，Cacciarelli T V, Martinez O M, Gish R G et al. Immunoregul atory cytokines in ch ronic hepatitis C virus infection: pre-and posttreatment with interferon alfa. Hepatology, 1996; 24:6
6，Tsai S L, Liaw Y F, Chen M H et al. Detection of type 2-l ike T-helper cells in hepatitis C virus infection: implications for hepatitis C virus chronicity. Hepa tology, 1997; 25:449
[收稿1998-10-28 修回1999-03-25], 百拇医药