m3受体亚型在人舌下腺组织中的分布
作者：李苏 曾淑君
单位：李苏 中山医科大学肿瘤医院内科(510060)；曾淑君 中山医科大学药理系(510080)
关键词：M受体；m3受体单克隆抗体；人；舌下腺；免疫组织化学
广东医学991005 【摘要】 目的 描述m3受体在人舌下腺组织中的分布。方法 应用m3受体亚型的单克隆抗体结合免疫组织化学方法(LSAB法)来描述m3受体在人舌下腺组织中的分布。结果 光镜下可见舌下腺组织中腺泡细胞和肌上皮细胞的细胞膜上均有棕黄色颗粒聚集，但前者免疫着色明显强于后者，导管组织及间质均未见棕黄色细颗粒聚集；阴性对照片未见棕黄色细颗粒聚集。结论 该结果提示人舌下腺中m3受体主要分布于腺泡细胞细胞膜表面，部分分布于肌上皮细胞细胞膜上，该文同时论述了唾液腺的分泌机制。
Experimental sutdy on the location of muscarinic m3 receptor in human sublingual gland
, 百拇医药
Li Su, Zeng Shujun.
Tumor Hospital of Sun Yet-Sen University of Medical Science, Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective To determine the precise location of m3 receptor in human sublingual gland and preliminarily discuss the secretive mechanism. Methods m3 receptor monoclone antibody and immunohistochemistry (LSAB) were used to describe the m3 receptor distribution in human sublingual gland.Results Under light microscope, there were more brown granular depositions in the cellular membrane of acinar cells than in the myoepithelial cells, these was not any deposition in the duct or stroma. No staining was obseved in controls. Conclusion In human sublingual gland, the m3 receptor mainly locates in cellular membrane of acinar cells, partly locates in the myoepithelial cells. The excitement of m3 receptor in the cellular membrane of acinar cells directly makes the acinar cells secrete saliva. and the excitement of m3 receptor in myoepithelial cells can help acinar excrete salive.
, 百拇医药
【Key words】 Muscarinic receptor m3 receptor monoclone antibody Human sublingula gland Immunohistochemistry
目前认为唾液分泌取决于受交感、副交感神经支配的肌上皮细胞，M受体兴奋，经G蛋白偶联激活PI系统引起唾液分泌[1～3]。放射配基受体结合实验研究表明[4，5]，支配唾液腺分泌的毒蕈碱受体(M受体)主要为M3和M1受体亚型，但对于M受体亚型在具体组织中的分布及分泌的具体机制目前仍未明了。已有学者应用m3受体的多抗检测m3受体在大脑、泪腺的定位分布[6，7]。但应用m3单抗描述人唾液腺组织中m3受体的分布仍未见报道。本课题应用m3受体亚型的单克隆抗体(McAbm3b)结合免疫组织化学方法(LSAB法)对人舌下腺组织中m3受体的分布进行研究，为唾液腺的分泌机制作进一步的探讨。
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1 材料与方法
1.1 材料 LSAB试剂盒购自迈新公司，其它试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法 ①实验组(LSAB法)：取外科切除的新鲜健康人舌下腺组织，立即置于4%多聚甲醛固定过夜，经二甲苯、系列乙醇脱水后，常规石蜡包埋切片(厚度5 μm)，贴附于APE处理的洁净载波片，经二甲苯、系列乙醇复水后滴加0.3%H2O2室温孵育20 min；PBS洗后置抗原修复液(枸缘酸钠缓冲液pH 6.0)中，微波处理10 min,PBS洗后加绵羊血清封闭40 min，加入纯化的抗m3受体单克隆抗体McAbm3b(1∶100)，4℃过夜，次日PBS洗后加入生物素标记的绵羊抗小鼠IgG(二抗)37℃、40 min，PBS洗后加入辣根过氧化物酶标记的链亲和素37℃、40 min，PBS洗后加入底物DAB显色，镜下控制染色，苏木素复染，树脂封片观察。②对照组：阴性对照以正常羊血清代替单抗，其余步骤同实验组；吸收实验中单抗加入前先与m3肽链在37℃孵育30 min，其余步骤同实验组。
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2 结果
m3受体在人舌下腺组织中广泛分布，光镜下可见人舌下腺组织中腺泡细胞和肌上皮细胞的细胞膜上均有棕黄色细颗粒聚集(阳性反应)，表明这些组织的细胞膜能与McAbm3b特异性的结合，即含m3受体，但前者免疫着色明显强于后者，导管组织及间质均未见棕黄色细颗粒聚集；吸收实验及阴性对照片均未见棕黄色细颗粒聚集。
3 讨论
毒蕈碱受体(M受体)属于G蛋白家族类受体，广泛的分布在中枢及外周组织，分子生物学研究表明M受体存在5种亚型，按Bonner法[8]命名为m1～m5，其中m1～m4所对应的药理分型为M1～M4，而m5未找到相对应的药理分型。对M受体分布的探讨已在多个系统、多个组织中进行[6，7]，而有关唾液腺组织M受体亚型的分布及功能研究，则处于起步阶段，仅有学者报道[4，5]唾液腺主要存在M3和M1，但M受体在具体组织中的分布尚未完全阐明。本课题首次应用m3受体的单克隆抗体(McAbm3b)，该单抗具有高度特异性和高纯度，与其它m受体亚型及α、β受体均无交叉反应，能特异地与m3受体结合，因此本实验的结果能较为准确、可靠地反映m3受体在人舌下腺组织中的分布。目前仍未有关于唾液腺m3受体免疫组化分布图，其它腺体如大鼠泪腺，Lemullois等[7]应用m3多抗对其进行的研究发现，m3受体主要分布于肌上皮细胞，部分分布于腺泡细胞。
, 百拇医药
目前认为唾液的分泌机制为腺泡外层的肌上皮细胞受交感或副交感神经刺激后引起收缩导致腺泡排出唾液，M受体的激活可增加膜肌醇磷脂的代谢，最终调节了唾液腺的分泌[1]，以上的结果虽然在一定程度上解释了唾液的分泌机制，但对于M受体的具体分布、腺泡细胞能否主动分泌唾液、M受体各型以及其它受体在唾液分泌中的作用仍未明了。本实验应用高纯度、高特异性的m3受体单抗结合免疫组织化学方法(LSAB法)对人舌下腺组织中m3受体的分布进行初步的探讨，结果显示人舌下腺组织中腺泡细胞和肌上皮细胞细胞膜上均有棕黄色细颗粒聚集，但前者免疫着色明显强于后者，导管组织及间质均未见棕黄色细颗粒聚集，该结果表明m3受体主要存在于腺泡细胞膜上，部分存在于肌上皮细胞上，因此可推测唾液腺的分泌机制可能是胆碱能神经的兴奋激活了腺泡细胞膜上的m3受体，m3受体激活后导致腺泡细胞离子通道的开放，引起唾液分泌，同时可激活肌上皮细胞，引起肌上皮细胞受缩，协助腺泡细胞排出分泌物，这方面需要进一步工作证实。
检测毒蕈碱受体分布的方法有许多[9]：放射配基结合实验，分子生物学技术，以及免疫沉淀法，这三种方法虽能对m3受体进行较为准确的定量分析，但难以准确定位分析；目前大部分关于m3受体在组织中的免疫组化分布图，所采用的抗体均为多抗，由于多抗具有交叉反应且纯度不高，因此难以准确反映其分布，而单抗针对单一抗原决定簇，特异性高，交叉反应少。因此为了更精确测定M受体在组织中的分布，八十年代后人们将目光转向制备亚型特异的单克隆抗体，其比亚型特异性配基和抗血清有更高选择性，而且杂交瘤细胞一旦建立，可不断的提取抗体。因此本实验采用单克隆抗体技术和免疫组织化学方法相结合的方法检测m3受体亚型的定位分布图，该方法是研究受体的结构和功能关系不可缺少的方法。
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4 参考文献
1 Baum BJ, Dai Y, Hiramatsu Y, et al. Signaling mechanisms that regulate saliva formation. Crit Rev Oral Biol Med, 1993, 4:379
2 Dai Y, Ambudkar IS, Horn VJ, et al. Evidence that M3 muscarinic receptors in rat parotid gland couple to two second messenger systems. Am J Physid, 1991, 261 (Cell physiol, 30): c 1063
3 Edward M, Gerstin Jr, Freclerick J, et al. Inhibition of muscarinic stimulated phosphomostide hydrolysis in the rat parotid gland by cAMP. Life Sciences, 1996, 58(2):145
, http://www.100md.com
4 Watson GE, Culp DJ. Muscarinic receptor subtypes in rat sublingual glands. Am J Physiol, 1994, 266(Cell physiol, 35): c355
5 Watson Eileen L, Peter W Abel, Dennis Dijnlio, et al. Identification of muscarinic receptor subtypes in mouse parotid gland. Am J Physiol, 1996, 271 (Cell physiol, 40): c950
6 Levey AI, Edmunds SM, Heilman CJ, et al. Location of muscarinic m3 receptor protein and M3 receptor binding in rat brain. Neuroscience, 1994, 63(1):207
, http://www.100md.com
7 Lemullois M, Rossignol B, Mauduit P. Immunolocalization of myoepithelial cells in isolated acini of rat exorbital lacrimal gland: cellular distribution of muscarinic receptors. Biol Cell, 1996, 86(2～3)：175
8 Bonner TI, Buckley NJ, Young AC, et al.Identification of a family of muscarinicacetylchaline receptor genes. Science (Washington DC), 1987, 537
9 陆 敏，综述.毒蕈碱受体亚型定量分布研究进展.国外医学放射医学核医学分册，1993， 17(3)：124, http://www.100md.com
单位：李苏 中山医科大学肿瘤医院内科(510060)；曾淑君 中山医科大学药理系(510080)
关键词：M受体；m3受体单克隆抗体；人；舌下腺；免疫组织化学
广东医学991005 【摘要】 目的 描述m3受体在人舌下腺组织中的分布。方法 应用m3受体亚型的单克隆抗体结合免疫组织化学方法(LSAB法)来描述m3受体在人舌下腺组织中的分布。结果 光镜下可见舌下腺组织中腺泡细胞和肌上皮细胞的细胞膜上均有棕黄色颗粒聚集，但前者免疫着色明显强于后者，导管组织及间质均未见棕黄色细颗粒聚集；阴性对照片未见棕黄色细颗粒聚集。结论 该结果提示人舌下腺中m3受体主要分布于腺泡细胞细胞膜表面，部分分布于肌上皮细胞细胞膜上，该文同时论述了唾液腺的分泌机制。
Experimental sutdy on the location of muscarinic m3 receptor in human sublingual gland
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Li Su, Zeng Shujun.
Tumor Hospital of Sun Yet-Sen University of Medical Science, Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective To determine the precise location of m3 receptor in human sublingual gland and preliminarily discuss the secretive mechanism. Methods m3 receptor monoclone antibody and immunohistochemistry (LSAB) were used to describe the m3 receptor distribution in human sublingual gland.Results Under light microscope, there were more brown granular depositions in the cellular membrane of acinar cells than in the myoepithelial cells, these was not any deposition in the duct or stroma. No staining was obseved in controls. Conclusion In human sublingual gland, the m3 receptor mainly locates in cellular membrane of acinar cells, partly locates in the myoepithelial cells. The excitement of m3 receptor in the cellular membrane of acinar cells directly makes the acinar cells secrete saliva. and the excitement of m3 receptor in myoepithelial cells can help acinar excrete salive.
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【Key words】 Muscarinic receptor m3 receptor monoclone antibody Human sublingula gland Immunohistochemistry
目前认为唾液分泌取决于受交感、副交感神经支配的肌上皮细胞，M受体兴奋，经G蛋白偶联激活PI系统引起唾液分泌[1～3]。放射配基受体结合实验研究表明[4，5]，支配唾液腺分泌的毒蕈碱受体(M受体)主要为M3和M1受体亚型，但对于M受体亚型在具体组织中的分布及分泌的具体机制目前仍未明了。已有学者应用m3受体的多抗检测m3受体在大脑、泪腺的定位分布[6，7]。但应用m3单抗描述人唾液腺组织中m3受体的分布仍未见报道。本课题应用m3受体亚型的单克隆抗体(McAbm3b)结合免疫组织化学方法(LSAB法)对人舌下腺组织中m3受体的分布进行研究，为唾液腺的分泌机制作进一步的探讨。
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1 材料与方法
1.1 材料 LSAB试剂盒购自迈新公司，其它试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法 ①实验组(LSAB法)：取外科切除的新鲜健康人舌下腺组织，立即置于4%多聚甲醛固定过夜，经二甲苯、系列乙醇脱水后，常规石蜡包埋切片(厚度5 μm)，贴附于APE处理的洁净载波片，经二甲苯、系列乙醇复水后滴加0.3%H2O2室温孵育20 min；PBS洗后置抗原修复液(枸缘酸钠缓冲液pH 6.0)中，微波处理10 min,PBS洗后加绵羊血清封闭40 min，加入纯化的抗m3受体单克隆抗体McAbm3b(1∶100)，4℃过夜，次日PBS洗后加入生物素标记的绵羊抗小鼠IgG(二抗)37℃、40 min，PBS洗后加入辣根过氧化物酶标记的链亲和素37℃、40 min，PBS洗后加入底物DAB显色，镜下控制染色，苏木素复染，树脂封片观察。②对照组：阴性对照以正常羊血清代替单抗，其余步骤同实验组；吸收实验中单抗加入前先与m3肽链在37℃孵育30 min，其余步骤同实验组。
, 百拇医药
2 结果
m3受体在人舌下腺组织中广泛分布，光镜下可见人舌下腺组织中腺泡细胞和肌上皮细胞的细胞膜上均有棕黄色细颗粒聚集(阳性反应)，表明这些组织的细胞膜能与McAbm3b特异性的结合，即含m3受体，但前者免疫着色明显强于后者，导管组织及间质均未见棕黄色细颗粒聚集；吸收实验及阴性对照片均未见棕黄色细颗粒聚集。
3 讨论
毒蕈碱受体(M受体)属于G蛋白家族类受体，广泛的分布在中枢及外周组织，分子生物学研究表明M受体存在5种亚型，按Bonner法[8]命名为m1～m5，其中m1～m4所对应的药理分型为M1～M4，而m5未找到相对应的药理分型。对M受体分布的探讨已在多个系统、多个组织中进行[6，7]，而有关唾液腺组织M受体亚型的分布及功能研究，则处于起步阶段，仅有学者报道[4，5]唾液腺主要存在M3和M1，但M受体在具体组织中的分布尚未完全阐明。本课题首次应用m3受体的单克隆抗体(McAbm3b)，该单抗具有高度特异性和高纯度，与其它m受体亚型及α、β受体均无交叉反应，能特异地与m3受体结合，因此本实验的结果能较为准确、可靠地反映m3受体在人舌下腺组织中的分布。目前仍未有关于唾液腺m3受体免疫组化分布图，其它腺体如大鼠泪腺，Lemullois等[7]应用m3多抗对其进行的研究发现，m3受体主要分布于肌上皮细胞，部分分布于腺泡细胞。
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目前认为唾液的分泌机制为腺泡外层的肌上皮细胞受交感或副交感神经刺激后引起收缩导致腺泡排出唾液，M受体的激活可增加膜肌醇磷脂的代谢，最终调节了唾液腺的分泌[1]，以上的结果虽然在一定程度上解释了唾液的分泌机制，但对于M受体的具体分布、腺泡细胞能否主动分泌唾液、M受体各型以及其它受体在唾液分泌中的作用仍未明了。本实验应用高纯度、高特异性的m3受体单抗结合免疫组织化学方法(LSAB法)对人舌下腺组织中m3受体的分布进行初步的探讨，结果显示人舌下腺组织中腺泡细胞和肌上皮细胞细胞膜上均有棕黄色细颗粒聚集，但前者免疫着色明显强于后者，导管组织及间质均未见棕黄色细颗粒聚集，该结果表明m3受体主要存在于腺泡细胞膜上，部分存在于肌上皮细胞上，因此可推测唾液腺的分泌机制可能是胆碱能神经的兴奋激活了腺泡细胞膜上的m3受体，m3受体激活后导致腺泡细胞离子通道的开放，引起唾液分泌，同时可激活肌上皮细胞，引起肌上皮细胞受缩，协助腺泡细胞排出分泌物，这方面需要进一步工作证实。
检测毒蕈碱受体分布的方法有许多[9]：放射配基结合实验，分子生物学技术，以及免疫沉淀法，这三种方法虽能对m3受体进行较为准确的定量分析，但难以准确定位分析；目前大部分关于m3受体在组织中的免疫组化分布图，所采用的抗体均为多抗，由于多抗具有交叉反应且纯度不高，因此难以准确反映其分布，而单抗针对单一抗原决定簇，特异性高，交叉反应少。因此为了更精确测定M受体在组织中的分布，八十年代后人们将目光转向制备亚型特异的单克隆抗体，其比亚型特异性配基和抗血清有更高选择性，而且杂交瘤细胞一旦建立，可不断的提取抗体。因此本实验采用单克隆抗体技术和免疫组织化学方法相结合的方法检测m3受体亚型的定位分布图，该方法是研究受体的结构和功能关系不可缺少的方法。
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4 参考文献
1 Baum BJ, Dai Y, Hiramatsu Y, et al. Signaling mechanisms that regulate saliva formation. Crit Rev Oral Biol Med, 1993, 4:379
2 Dai Y, Ambudkar IS, Horn VJ, et al. Evidence that M3 muscarinic receptors in rat parotid gland couple to two second messenger systems. Am J Physid, 1991, 261 (Cell physiol, 30): c 1063
3 Edward M, Gerstin Jr, Freclerick J, et al. Inhibition of muscarinic stimulated phosphomostide hydrolysis in the rat parotid gland by cAMP. Life Sciences, 1996, 58(2):145
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4 Watson GE, Culp DJ. Muscarinic receptor subtypes in rat sublingual glands. Am J Physiol, 1994, 266(Cell physiol, 35): c355
5 Watson Eileen L, Peter W Abel, Dennis Dijnlio, et al. Identification of muscarinic receptor subtypes in mouse parotid gland. Am J Physiol, 1996, 271 (Cell physiol, 40): c950
6 Levey AI, Edmunds SM, Heilman CJ, et al. Location of muscarinic m3 receptor protein and M3 receptor binding in rat brain. Neuroscience, 1994, 63(1):207
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7 Lemullois M, Rossignol B, Mauduit P. Immunolocalization of myoepithelial cells in isolated acini of rat exorbital lacrimal gland: cellular distribution of muscarinic receptors. Biol Cell, 1996, 86(2～3)：175
8 Bonner TI, Buckley NJ, Young AC, et al.Identification of a family of muscarinicacetylchaline receptor genes. Science (Washington DC), 1987, 537
9 陆 敏，综述.毒蕈碱受体亚型定量分布研究进展.国外医学放射医学核医学分册，1993， 17(3)：124, http://www.100md.com