NO含量与NOS活力对ALT与AST活力影响的研究
作者：覃甲仁
单位：广西医科大学生物化学教研室 南宁 530021
关键词：L-精氨酸；一氧化氮；一氧化氮合酶；丙氨酸转氨酶；天冬氨酸转氨酶
广西医科大学学报990518
摘要 目的：研究一氧化氮(Nitric oxide; NO)与一氧化氮合酶(Nitric Oxide synthase; NOS)活力对丙氨酸转氨酶(ALT)与天冬氨酸转氨酶(AST)活力的影响并探讨其机制。方法：对大鼠腹腔注射L-Arg，4h后采血取肝检测NO含量，NOS活力、ALT及AST活力并与对照组大鼠对比.NO定量用硝酸还原酶法、NOS测定用分光光度法、ALT与AST测定用改良赖氏法(2，4一二硝基苯肼比色法)。用NaNO2和NaNO3作抑制剂进行酶抑制试验。结果：腹腔注射L-Arg后肝脏及血清中NO含量与NOS活力显著升高(P<0.01)；而肝脏及血清中ALT与AST活力下降。结论：体内NO转化生成的NO-2、NO-3对ALT及AST有抑制作用，其中NO-2的抑制作用强于NO-3。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 Q-33
STUDY OF EFFECT OF NO AND NOS ON THE ACTIVITY OF ALT AND AST
Qin Jiaren
(Department of Biochemistry, Guangxi Medical Universty, Nanning 530021)
Abstract Objective:To study the effect on activity of ALT and AST by nitric oxide product and nitric oxide synthase activity.Methods:Injecting into abdominal cavity of mice with the injection of 8% L-Arg.Four hours later,measuring the nitric oxide product,the activity of nitric oxide synthase and the activity of ALT and AST, and contrasting them with those of the normal subjects. NO: nitrate reductase methods. NOS: spectrophotometric methods. AST and ALT: 2,4-dinitro-phenylhydrazine colorimetry. The NaNO2 and NaNO3 as the inhibitor are used in the inhibitory test on ALT and AST.Results:After injecting into abdominal cavity of mouses with the injection of 8% L-Arg, the NO product and the activity of NOS in hepar and serum of the mice were increased (P<0.01). Contrary to that, the activity of ALT and AST were decreased (hepar: P<0.01; serum: P<0.05). NO-2 and NO-3 are the powerful inhibitors of ALT and AST.Conclusion:The NO-2 and NO-3 that were inverted by the endogenous nitric oxide are the inhibitors of ALT and AST. The inhibition of NO-2 are more powerful than NO-3.
, http://www.100md.com
Key words L-Arginine;nitric oxide;nitric oxide synthase;alanine transaminase;asparagine transaminase
一氧化氮(NO)是一种新型的信息分子。NO的功能十分复杂：在体内广泛地参与各种生理过程，并在许多病理过程中起介导作用。NO在介导生理过程或病理过程时常引起某些酶活性的改变。例如：NO可使核苷酸还原酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶[1]，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px; GPx)[2]，顺鸟头酸酶[3]，超氧化物歧化酶(SOD)[4]等抑制或失活；相反，NO可使环氧化酶、肝蛋白激酶C[5]等激活。本实验从诱导NO生成入手，观察大鼠NOS及NO水平与ALT、AST这两种酶的活力之间的联系，并通过酶抑制试验探讨这种联系的发生机制，希望能对护肝治疗提供新的思路。
, http://www.100md.com 1 研究对象和方法
1.1 实验动物：取5月龄大鼠20只，体质量(319±9.7)g；不分雌雄，随机分组。对照组10只；实验组(注射L-Arg组)10只。对照组：先经胸穿刺心内取血(2～3ml/鼠)，制备血清。然后断头处死大鼠、剖腹取肝，用冰冷生理盐水洗净残留血液后滤纸吸干。准确称取肝组织0.5g，加入4.5ml冰冷生理盐水充分研磨制成10%肝匀浆。离心(6000r/min、5min)取上清液备用。实验组：用灭菌双蒸水配制80g/L L-Arg注射液，按30mg/100g体质量分别对各实验鼠进行腹腔内注射。4h后心内取血制备血清、断头剖腹取肝制备肝匀浆。
1.2 试剂及仪器：L-Arg为上海化学试剂公司产品；NO及NOS检测试剂为南京建成生物工程研究所提供；ALT及AST测试试剂用上海化学试剂公司产品自行配制；NaNO2为广州化学试剂厂产品(分析纯)；NaNO3为上海试剂一厂产品(分析纯)；主要仪器有：电子天平(香港产，B120S)、台式离心机(上海产、TCL-16C)、721-3型分光光度计(湖南产，液晶显示)，紫外分光光度计(日本产，HITACHI、UV-100-40)、微量玻璃匀浆器等。
, 百拇医药
1.3 方法：NO定量用硝酸还原酶法；NOS活力测定用分光光度法(NOS活力单位含义为：在30℃条件下，每分钟催化L-Arg生成1nmol NO的酶量)；ALT及AST活力测定用改良赖氏法(2,4-二硝基苯肼比色法)；酶抑制试验使用不同浓度抑制剂(分别为NaNO3及NaNO2)同步检测。未及处理或检测的标本一律置-18℃冰箱保存。
2 结 果
2.1 肝匀浆测定结果(见表1)
表1 肝匀浆NO、NOS、ALT及AST测定结果 组别
NO
(nmol/g)
NOS
, http://www.100md.com (U/g鲜组织)
ALT
(KU/g鲜组织)
AST
(KU/g鲜组织)
对照组
(n=10)
56.5±7.7
80.8±7.9
99.0±4.5
140.5±10.6
实验组
, 百拇医药
(n=10)
120.9±17.2
119.9±12.5
92.9±6.8
97.9±19.6
P
<0.01
<0.01
<0.05
<0.01
2.2 血清检测结果(见表2)。表2 血清NO、NOS、ALT及AST测定结果 组别
, 百拇医药 NO
(cB/μmol.L-1)
NOS
(U/ml)
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
对照组
(n=10)
67.3±6.3
48.8±2.7
, 百拇医药
24.3±9.6
70.5±11.5
实验组
(n=10)
80.1±8.6
55.4±2.1
18.3±13.2
65.2±6.7
P
<0.01
<0.01
>0.05
, http://www.100md.com
<0.05
2.3 酶抑制试验结果(见表3,表4)表3 NO-2对ALT、AST抑制试验结果(各组n=10) 项目
无抑制剂
不同浓度(终浓度)抑制剂(cB/mmol.L-1)
0.2
0.1
0.01
0.001
0.0001
ALT
, http://www.100md.com
99.0±4.5
0
0
0
66.9±6.0
94.3±6.0
P
<0.01
<0.05
AST
140.5±10.6
0
0
, 百拇医药
0
72.0±9.9
116.6±9.2
P
<0.01
<0.01
(单位：kU/g鲜组织)表4 NO-3对AST、AST抑制试验结果(各组n=10) 项目
无抑制剂
不同浓度(终浓度)抑制剂(cB/mol.L-1)
0.2
, 百拇医药
0.1
0.01
0.001
0.0001
ALT
99.0±4.5
0
24.1±4.5
92.0±6.4
94.4±6.3
97.7±4.8
P
<0.01
, 百拇医药
<0.05
>0.05
>0.05
AST
140.5±10.6
0
46.7±6.9
126.1±14.7
139.2±13.8
140.2±10.6
P
<0.01
, 百拇医药
<0.05
>0.05
>0.05
(单位：kU/g鲜组织)
3 讨论
3.1 表1、表2的结果显示：腹腔内注射L-Arg的实验鼠肝脏内的NOS活力及NO含量显著增加(P<0.01)。同时，血清中NOS活力及NO含量也相应显著增加(P<0.01)。在体内，NO的生成是NOS催化L-Arg转化的结果，可简单表示为：L-Arg —→NOS L-瓜氨酸+NO[7]。实验鼠腹腔内注射L-Arg 后，L-Arg可被较快地吸收并经门静脉运到肝脏，肝细胞对L-Arg有较强的摄取能力而使肝细胞内L-Arg浓度增加。结果，通过下列两方面机理使肝内NOS总活力及NO含量提高：①L-Arg是NOS的底物，底物浓度增加则酶的催化速度(酶活力)增加。②L-Arg发挥底物诱导作用，诱导肝细胞产生iNOS(诱导型NOS)；iNOS的生成使肝内NOS总酶量增加，促使NO生成增加。血清中的NOS及NO有多种来源，主要是由各种组织细胞生成后释放入血的[7]。肝脏是血清NOS及NO的正常来源之一，由于肝中NOS及NO增加，可在一定程度上(并非成正比)使血清中NOS总活力及NO总含量增加。不排除由于L-Arg大量吸收入血后也可引起肝脏以外的多种组织细胞合成NO增加并释放入血的途径。
, http://www.100md.com
3.2 表3、表4的结果清楚地显示：NO-2和NO-3是ALT及AST的抑制剂。其中NO-2的抑制作用更明显——当NO-2浓度(终浓度，下同)>0.01mol/L时，对ALT及AST完全抑制；即使终浓度为0.0001mol/L(或100μmol/L)时仍具有抑制作用(对ALT，P<0.05；对AST，P<0.01)。NO-3对ALT及AST的抑制作用稍弱，当终浓度达到0.01mol/L时，才能表现出明显的抑制作用。本文的这一发现，为解释NOS、NO与ALT、AST的反向变化提供了理论依据。
3.3 从表1、表2可以看出：实验鼠腹腔内注射L-Arg后，一方面引起肝脏和血清中NOS及NO的升高，另一方面引起ALT及AST活力的下降。作者认为，NO含量的升高是引起ALT及AST活力下降的重要原因。体内产生的NO很少游离存在，很快被氧化为NO-2，继而部分转化为NO-3[7]。换言之，体内的NO主要以NO-2和NO-3的形成存在。NO含量的增加，意味着NO-2、NO-3的浓度增加。而NO-2、NO-3都是ALT及AST的抑制剂，可使ALT及AST的活力下降。国内学者报告，抗肝炎药物Sy-801可使肝损伤小鼠肝形态损伤减轻，血浆ALT及AST水平下降；若同时使用NO生成抑制药物，这种保肝作用被抵销[6]。不少研究成果指出，NO对肝脏具有保护和毒性的双重作用[7]。NO过多产生毒性作用；而NO适度增加可减轻肝损伤，从而减少ALT及AST从肝细胞逃逸到血浆的数量并最终导致血清ALT及AST活力降低。这可能是NO升高后血清ALT及AST活力下降的另一机制。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Brune B, Dimmeler S, Vedia LM, et al.Nitric oxide: a signal for ADP-ribosylation of proteins. Life Sci, 1994, 54:61～70
2 Asahi M, Fujii J, Suzuk K, et al. Inactivation of glutathione peroxidase by nitric oxide: implication for cytotoxicity. J.B.C, 1995,270:21035～21039
3 Hausladen A, Fridovich I, Superoxide and peroxynitrite inactivate aconitases, but nitric oxide does not. J.B.C, 1994, 269:29405～29408
, http://www.100md.com
4 Crow JP, Beckman JS, Reactions between nitric oxide, superoxide and peroxynitrite: footprints of peroxynitrite in vivo. Adv pharmacol.1995,34:17～43
5 Burgstahler AD, Nathanson MH, NO modulates the apicolateral cytoskeleton of isolated hepatocytes by a PKC-dependent, cGMP-independent mechanism. Am J physiol, 1995,269: G789～G799
6 孙长凯,孙普存,刘耕陶，等.全国一氧化氮基础与临床学术研讨会记要.中华医学杂志,1998,78(1):16～18
7 钟慈声,孙安阳.一氧化氮的生物医学.上海：上海医科大学出版社,1997.3～12
收稿日期：1999-03-31, 百拇医药
单位：广西医科大学生物化学教研室 南宁 530021
关键词：L-精氨酸；一氧化氮；一氧化氮合酶；丙氨酸转氨酶；天冬氨酸转氨酶
广西医科大学学报990518
摘要 目的：研究一氧化氮(Nitric oxide; NO)与一氧化氮合酶(Nitric Oxide synthase; NOS)活力对丙氨酸转氨酶(ALT)与天冬氨酸转氨酶(AST)活力的影响并探讨其机制。方法：对大鼠腹腔注射L-Arg，4h后采血取肝检测NO含量，NOS活力、ALT及AST活力并与对照组大鼠对比.NO定量用硝酸还原酶法、NOS测定用分光光度法、ALT与AST测定用改良赖氏法(2，4一二硝基苯肼比色法)。用NaNO2和NaNO3作抑制剂进行酶抑制试验。结果：腹腔注射L-Arg后肝脏及血清中NO含量与NOS活力显著升高(P<0.01)；而肝脏及血清中ALT与AST活力下降。结论：体内NO转化生成的NO-2、NO-3对ALT及AST有抑制作用，其中NO-2的抑制作用强于NO-3。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 Q-33
STUDY OF EFFECT OF NO AND NOS ON THE ACTIVITY OF ALT AND AST
Qin Jiaren
(Department of Biochemistry, Guangxi Medical Universty, Nanning 530021)
Abstract Objective:To study the effect on activity of ALT and AST by nitric oxide product and nitric oxide synthase activity.Methods:Injecting into abdominal cavity of mice with the injection of 8% L-Arg.Four hours later,measuring the nitric oxide product,the activity of nitric oxide synthase and the activity of ALT and AST, and contrasting them with those of the normal subjects. NO: nitrate reductase methods. NOS: spectrophotometric methods. AST and ALT: 2,4-dinitro-phenylhydrazine colorimetry. The NaNO2 and NaNO3 as the inhibitor are used in the inhibitory test on ALT and AST.Results:After injecting into abdominal cavity of mouses with the injection of 8% L-Arg, the NO product and the activity of NOS in hepar and serum of the mice were increased (P<0.01). Contrary to that, the activity of ALT and AST were decreased (hepar: P<0.01; serum: P<0.05). NO-2 and NO-3 are the powerful inhibitors of ALT and AST.Conclusion:The NO-2 and NO-3 that were inverted by the endogenous nitric oxide are the inhibitors of ALT and AST. The inhibition of NO-2 are more powerful than NO-3.
, http://www.100md.com
Key words L-Arginine;nitric oxide;nitric oxide synthase;alanine transaminase;asparagine transaminase
一氧化氮(NO)是一种新型的信息分子。NO的功能十分复杂：在体内广泛地参与各种生理过程，并在许多病理过程中起介导作用。NO在介导生理过程或病理过程时常引起某些酶活性的改变。例如：NO可使核苷酸还原酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶[1]，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px; GPx)[2]，顺鸟头酸酶[3]，超氧化物歧化酶(SOD)[4]等抑制或失活；相反，NO可使环氧化酶、肝蛋白激酶C[5]等激活。本实验从诱导NO生成入手，观察大鼠NOS及NO水平与ALT、AST这两种酶的活力之间的联系，并通过酶抑制试验探讨这种联系的发生机制，希望能对护肝治疗提供新的思路。
, http://www.100md.com 1 研究对象和方法
1.1 实验动物：取5月龄大鼠20只，体质量(319±9.7)g；不分雌雄，随机分组。对照组10只；实验组(注射L-Arg组)10只。对照组：先经胸穿刺心内取血(2～3ml/鼠)，制备血清。然后断头处死大鼠、剖腹取肝，用冰冷生理盐水洗净残留血液后滤纸吸干。准确称取肝组织0.5g，加入4.5ml冰冷生理盐水充分研磨制成10%肝匀浆。离心(6000r/min、5min)取上清液备用。实验组：用灭菌双蒸水配制80g/L L-Arg注射液，按30mg/100g体质量分别对各实验鼠进行腹腔内注射。4h后心内取血制备血清、断头剖腹取肝制备肝匀浆。
1.2 试剂及仪器：L-Arg为上海化学试剂公司产品；NO及NOS检测试剂为南京建成生物工程研究所提供；ALT及AST测试试剂用上海化学试剂公司产品自行配制；NaNO2为广州化学试剂厂产品(分析纯)；NaNO3为上海试剂一厂产品(分析纯)；主要仪器有：电子天平(香港产，B120S)、台式离心机(上海产、TCL-16C)、721-3型分光光度计(湖南产，液晶显示)，紫外分光光度计(日本产，HITACHI、UV-100-40)、微量玻璃匀浆器等。
, 百拇医药
1.3 方法：NO定量用硝酸还原酶法；NOS活力测定用分光光度法(NOS活力单位含义为：在30℃条件下，每分钟催化L-Arg生成1nmol NO的酶量)；ALT及AST活力测定用改良赖氏法(2,4-二硝基苯肼比色法)；酶抑制试验使用不同浓度抑制剂(分别为NaNO3及NaNO2)同步检测。未及处理或检测的标本一律置-18℃冰箱保存。
2 结 果
2.1 肝匀浆测定结果(见表1)
表1 肝匀浆NO、NOS、ALT及AST测定结果 组别
NO
(nmol/g)
NOS
, http://www.100md.com (U/g鲜组织)
ALT
(KU/g鲜组织)
AST
(KU/g鲜组织)
对照组
(n=10)
56.5±7.7
80.8±7.9
99.0±4.5
140.5±10.6
实验组
, 百拇医药
(n=10)
120.9±17.2
119.9±12.5
92.9±6.8
97.9±19.6
P
<0.01
<0.01
<0.05
<0.01
2.2 血清检测结果(见表2)。表2 血清NO、NOS、ALT及AST测定结果 组别
, 百拇医药 NO
(cB/μmol.L-1)
NOS
(U/ml)
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
对照组
(n=10)
67.3±6.3
48.8±2.7
, 百拇医药
24.3±9.6
70.5±11.5
实验组
(n=10)
80.1±8.6
55.4±2.1
18.3±13.2
65.2±6.7
P
<0.01
<0.01
>0.05
, http://www.100md.com
<0.05
2.3 酶抑制试验结果(见表3,表4)表3 NO-2对ALT、AST抑制试验结果(各组n=10) 项目
无抑制剂
不同浓度(终浓度)抑制剂(cB/mmol.L-1)
0.2
0.1
0.01
0.001
0.0001
ALT
, http://www.100md.com
99.0±4.5
0
0
0
66.9±6.0
94.3±6.0
P
<0.01
<0.05
AST
140.5±10.6
0
0
, 百拇医药
0
72.0±9.9
116.6±9.2
P
<0.01
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(单位：kU/g鲜组织)表4 NO-3对AST、AST抑制试验结果(各组n=10) 项目
无抑制剂
不同浓度(终浓度)抑制剂(cB/mol.L-1)
0.2
, 百拇医药
0.1
0.01
0.001
0.0001
ALT
99.0±4.5
0
24.1±4.5
92.0±6.4
94.4±6.3
97.7±4.8
P
<0.01
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<0.05
>0.05
>0.05
AST
140.5±10.6
0
46.7±6.9
126.1±14.7
139.2±13.8
140.2±10.6
P
<0.01
, 百拇医药
<0.05
>0.05
>0.05
(单位：kU/g鲜组织)
3 讨论
3.1 表1、表2的结果显示：腹腔内注射L-Arg的实验鼠肝脏内的NOS活力及NO含量显著增加(P<0.01)。同时，血清中NOS活力及NO含量也相应显著增加(P<0.01)。在体内，NO的生成是NOS催化L-Arg转化的结果，可简单表示为：L-Arg —→NOS L-瓜氨酸+NO[7]。实验鼠腹腔内注射L-Arg 后，L-Arg可被较快地吸收并经门静脉运到肝脏，肝细胞对L-Arg有较强的摄取能力而使肝细胞内L-Arg浓度增加。结果，通过下列两方面机理使肝内NOS总活力及NO含量提高：①L-Arg是NOS的底物，底物浓度增加则酶的催化速度(酶活力)增加。②L-Arg发挥底物诱导作用，诱导肝细胞产生iNOS(诱导型NOS)；iNOS的生成使肝内NOS总酶量增加，促使NO生成增加。血清中的NOS及NO有多种来源，主要是由各种组织细胞生成后释放入血的[7]。肝脏是血清NOS及NO的正常来源之一，由于肝中NOS及NO增加，可在一定程度上(并非成正比)使血清中NOS总活力及NO总含量增加。不排除由于L-Arg大量吸收入血后也可引起肝脏以外的多种组织细胞合成NO增加并释放入血的途径。
, http://www.100md.com
3.2 表3、表4的结果清楚地显示：NO-2和NO-3是ALT及AST的抑制剂。其中NO-2的抑制作用更明显——当NO-2浓度(终浓度，下同)>0.01mol/L时，对ALT及AST完全抑制；即使终浓度为0.0001mol/L(或100μmol/L)时仍具有抑制作用(对ALT，P<0.05；对AST，P<0.01)。NO-3对ALT及AST的抑制作用稍弱，当终浓度达到0.01mol/L时，才能表现出明显的抑制作用。本文的这一发现，为解释NOS、NO与ALT、AST的反向变化提供了理论依据。
3.3 从表1、表2可以看出：实验鼠腹腔内注射L-Arg后，一方面引起肝脏和血清中NOS及NO的升高，另一方面引起ALT及AST活力的下降。作者认为，NO含量的升高是引起ALT及AST活力下降的重要原因。体内产生的NO很少游离存在，很快被氧化为NO-2，继而部分转化为NO-3[7]。换言之，体内的NO主要以NO-2和NO-3的形成存在。NO含量的增加，意味着NO-2、NO-3的浓度增加。而NO-2、NO-3都是ALT及AST的抑制剂，可使ALT及AST的活力下降。国内学者报告，抗肝炎药物Sy-801可使肝损伤小鼠肝形态损伤减轻，血浆ALT及AST水平下降；若同时使用NO生成抑制药物，这种保肝作用被抵销[6]。不少研究成果指出，NO对肝脏具有保护和毒性的双重作用[7]。NO过多产生毒性作用；而NO适度增加可减轻肝损伤，从而减少ALT及AST从肝细胞逃逸到血浆的数量并最终导致血清ALT及AST活力降低。这可能是NO升高后血清ALT及AST活力下降的另一机制。
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参考文献
1 Brune B, Dimmeler S, Vedia LM, et al.Nitric oxide: a signal for ADP-ribosylation of proteins. Life Sci, 1994, 54:61～70
2 Asahi M, Fujii J, Suzuk K, et al. Inactivation of glutathione peroxidase by nitric oxide: implication for cytotoxicity. J.B.C, 1995,270:21035～21039
3 Hausladen A, Fridovich I, Superoxide and peroxynitrite inactivate aconitases, but nitric oxide does not. J.B.C, 1994, 269:29405～29408
, http://www.100md.com
4 Crow JP, Beckman JS, Reactions between nitric oxide, superoxide and peroxynitrite: footprints of peroxynitrite in vivo. Adv pharmacol.1995,34:17～43
5 Burgstahler AD, Nathanson MH, NO modulates the apicolateral cytoskeleton of isolated hepatocytes by a PKC-dependent, cGMP-independent mechanism. Am J physiol, 1995,269: G789～G799
6 孙长凯,孙普存,刘耕陶，等.全国一氧化氮基础与临床学术研讨会记要.中华医学杂志,1998,78(1):16～18
7 钟慈声,孙安阳.一氧化氮的生物医学.上海：上海医科大学出版社,1997.3～12
收稿日期：1999-03-31, 百拇医药