RGDS肽对胶元活化的大鼠血小板L-Arginine/NO途径的影响
作者：姚兴海 王培勇 于文杰 李夏 苏静怡 唐朝枢
单位：姚兴海 首都医科大学病理生理教研室，北京100054；王培勇 于文杰 李夏 苏静怡 唐朝枢 北京医科大学心血管基础研究所，北京100083
关键词：RGDS肽；血小板聚集；L-精氨酸转运；一氧化氮合酶；亚硝酸盐
基础医学与临床990509 摘要 本工作在胶原活化的大鼠血小板上，观察RGDS肽对血小板聚集、L-精氨酸(L-Arg)转运、一氧化氮合酶(NOS)活性和亚硝酸盐(NO2-)含量的影响。结果发现，4μg/mL胶原引起血小板聚集时，L-Arg转运增强、NOS活性增高和NO2-含量增加。血小板L-Arg转运的Vmax与NOS活性和NO2-生成呈明显正相关(r=0.8100和0.8343，P<0.01)；血小板聚集与NO2-生成亦呈明显正相关(r=0.7660，P<0.05)。RGDS肽200μmol/L与胶原共同孵育，可明显抑制胶原引起的血小板聚集、L-Arg转运增强、NOS活性增高和NO2-含量增加。提示，胶原激活的血小板L-Arg/NO途径增加是通过Ⅱb/Ⅲa复合物所介导，RGDS肽可拮抗其增加作用。
, 百拇医药
Effect of Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) Peptide on L-Arginine/NO Pathway of
Collagen Activated Rat Platelet
Yao Xinghai1 Wang Peiyong2 Yu Wenjie2 Li Xia2 Su Jingyi2 Tang Chaoshu2
(1 Dept. of Physiopathology of Capital University of Medical Sciences，Beijing100050)
(2 Institute of Cardiovascular Basic Research Beijing Medical University，Beijing100083)
, 百拇医药
The aim of this work is to investigate the effect of Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) peptide on platelet aggregation，L-Arginine (L-Arg) transport，NO synthase (NOS) activity and nitrite (NO2-) content during platelet activation.Experiments were performed on collagen activated rat platelets in vivo.Results showed that collagen 4μg/mL，while inducing platelet aggregation，obviously enhanced L-Arg transport，NOS activity and NO2- production.When platelets and collagen were incubated together with 200μmol/L RGDS peptide it was found that RGDS peptide markedly inhibit collagen activated platelet aggregation，L-Arg transport，NOS activation and NO2- content.The Vmax of L-Arg transport is positively related with NOS activation and NO2- production (r=0.8100 and 0.8343，P<0.01); The platelet aggregation and NO2- production are also in positive relationship (r=0.7660，P<0.05).The results suggested that the L-Arg/NO pathway of collagen activated platelet is enhanced by GPⅡb/Ⅲa complex medium and the increase of the L-Arg/NO pathway can be resisted by RGDS.
, 百拇医药
Key words RGDS peptide platelet aggregation L-Arg transport NO synthase nitrite
RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)肽是血浆纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)Aa链95～98和572～575位的四肽氨基酸残基，为血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa复合物的配基。应用天然或合成的含RGDS结构物作为血小板膜GPⅡb/Ⅲa复合物阻断剂可抑制血小板聚集，具有明确的抗栓效应[1，2]。近年的研究亦证实，NO可降低血小板的活性，使GPⅡb/Ⅲa复合物下调[3]。Lantoine等发现血小板富含NO合酶(NO Synthase，NOS)并催化L-精氨酸(L-Arginine，L-Arg)生成NO，血小板活化时刺激NO生成，血小板源NO具有抑制血小板聚集和扩张血管等重要作用[4，5]，但RGDS肽与NO生成的关系目前尚不清楚。本工作在胶原激活的大鼠血小板上观察RGDS肽对L-Arg/NO途径，即L-Arg转运，NOS活性及NO生成的影响，以探讨血小板膜GPⅡb/Ⅲa与NO生成的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 血小板聚集及血浆纤维蛋白原含量的测定
雄性Wistar大鼠体重200～250g，乌拉坦(1.0g/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝，离心分别制备富血小板血浆(PRP，1 000r/min，15min)及贫血小板血浆(PPP，3 500r/min，15min)，PRP调至5×108血小板/mL。实验分4组，于每管置180μL PRP，37 ℃预孵育1min后，分别加入20μL下述不同的药物。(1)对照组加入生理盐水；(2)RGDS肽组加入RGDS肽200μmol/L；(3)胶原组加入胶原4μg/mL；(4)胶原+RGDS肽组加入胶原4μg/mL和RGDS肽200μmol/L。实验各组37 ℃孵育5min，按比浊法测定血小板聚集。亚硫酸钠法测定血浆Fg含量。
1.2 血小板L-Arg转运测定[6]
, 百拇医药
按1:10(v/v)取PRP悬浮于Hepes缓冲液中(mmol/L：NaCl 137，KCl 2.7，NaH2PO4 3.0，MgCl2 1.0和Hepes 3.5，pH 7.4)2350r/min离心10min，弃上清，重复洗脱一次。血小板悬浮在含葡萄糖(5mmol/L)和CaCl2(1mmol/L)的Hepes缓冲液中，调整血小板至2×108血小板/mL，在水浴振荡器上预孵育10min。实验分组同上，取50μL血小板悬液，加入生理盐水或RGDS肽(200μmol/L)，孵育5min，加入胶原4μg/mL孵育5min，再分别加入不同浓度3H-L-Arg(2.5，5，10，20，40，80和100μmol/L)孵育1min(预试发现在2min内，血小板3H-L-Arg摄入与孵育时间呈直线关系)，加入终止液(mmol/L：甲醛270，EGTA 16，NaCl 150)100μL，经微孔抽滤装置过0.45μm孔径微孔滤膜抽滤，用Hepes液4mL冲洗3次，晾干，加入闪烁液在β液闪计数仪上测定3H放射活性。同时设立不加样本的非特异平行对照管，L-Arg血小板转运为总摄入与非特异结合之差，以每min pmol/108血小板表示。
, 百拇医药
1.3 血小板一氧化氮合酶(NO Synthase，NOS)活性的测定[7]
取血小板悬液0.4mL，37 ℃预孵育10min后，加入生理盐水或RGDS肽200μmol/L，孵育1min，加入4μg/mL胶原10min后，再加10% Triton X-100(终浓度)超声30s，4 ℃ 12 000r/min，离心10min，取上清0.2mL，加0.1mL孵育液(Tris-HCl，pH 7.4)50mmol/L，NADPH 100μmol/L，CaCl2 2mmol/L，L-Arg 30μmol/L，3H-L-Arg 0.5μCi/100μL，钙调蛋白1μg/100μL 37 ℃孵育30min，用0.2mL预冷的终止液(mmol/L ：NaAc 2.0 pH 5.5，L-瓜氨酸1，EDTA 2，EGTA 0.2)放置10min，经Dowex AG 50-X 82(Na+型)的阳离子交换层析柱，取上清0.3mL，加入闪烁液，测样本放射活性。
, 百拇医药
1.4 血小板亚硝酸盐生成测定
用微盘测定法[8]，取PRP 1.0mL，预孵育10min，加入生理盐水或RGDS肽200μmol/L，1min后加入胶原4μg/mL，孵育1h后，离心3 000r/min，10min，取上清，加入等量Greiss液(1%对氨基苯磺胺，0.1% N-(1-奈基)-乙二胺，5%磷酸)，室温放置10min，应用酶标仪在550nm波长下测样本的吸光度。
1.5 材料
Wistar大鼠由北京医科大学实验动物部提供 ：L-[2，3-3H]-Arg(比活性2.29 TBq/mmol)购自DuPont NEN； 胶原，RGDS肽，L-Arg，钙调蛋白等均购自Sigma Co.余为市售分析纯试剂。
1.6 统计学
, 百拇医药
实验结果以均数±标准差(
±s)表示，用One-Way analysis of anova方法，组间q检验作统计学处理。
2 结果
2.1 RGDS肽对大鼠血小板聚集的影响
本实验所制备的大鼠PRP中Fg含量为2.87±0.12mg/mL，胶原引起血小板明显聚集，RGDS肽可明显抑制胶原引起的血小板聚集。见表1所示。
表1 RGDS肽对L-Arg/NO途径和血小板聚集的影响
Table1 Effect of RGDS Peptide on L-Arginine/NO Pathway And Platelet Aggregation(±s,n=5)
, http://www.100md.com
Group
L-Arg Transport
NOS Activity
(pmol/108pt)
No2-Content
(μmol/108pt)
Pt Aggregation%
5×108pt
Vmax(pmol/108pt/min)
Km(μmol)
, 百拇医药
Control
12.53±0.86
7.15±1.54
11.08±0.92
4.43±0.42
-
RGDS
11.98±1.25
7.87±1.21
10.53±1.07
4.41±0.59
-
, 百拇医药
Collagen
16.72±1.29**
6.89±1.19
22.24±1.44**
8.25±0.30**
50.2±2.77
Coll+rgds
14.20±0.68##
7.02±1.51
18.70±1.66##
, 百拇医药
6.78±0.94##
43.2±3.35##
Compared with Control Group **p<0.01;Compared with Collagen Group ##p<0.01.
2.2 RGDS肽对血小板L-Arg转运的影响
大鼠血小板对L-Arg摄取呈浓度饱和高亲合转运特征，与文献报告一致[6]。见图1所示。RGDS组与对照组血小板L-Arg转运相近。胶原刺激血小板L-Arg转运，较对照组其最大转运速率(Vmax)增加40%(P<0.01)，但不改变L-Arg转运的Km值。RGDS肽抑制胶原的上述作用，胶原+RGDS组的Vmax值较胶原组降低15%(P<0.01)。见表1所示。
, 百拇医药
图1 大鼠血小板3H-L-Arg的转运特征
Fig1 Kinetics of 3H-L-Arg Transport by Rat Platelets (±s, n=5)
2.3 RGDS肽对血小板NOS活性的影响
RGDS肽对未活化血小板NOS活性无明显影响，但胶原刺激血小板NOS激活(较对照组增加101%，P<0.01)为RGDS肽所拮抗，胶原+RGDS组较胶原组NOS活性抑制16%(P<0.01)。结果见表1所示。
2.4 RGDS肽对血小板NO2-生成的影响
, http://www.100md.com RGDS肽对未活化血小板NO2-生成无明显影响，而胶原刺激血小板NO2-生成增多(较对照组增加86%，P<0.01)为RGDS肽所抑制，胶原+RGDS组较胶原组NO2-生成降低18%(P<0.01)见表1所示。
血小板L-Arg转运的Vmax与NOS活性和NO2-生成呈明显正相关(r=0.8100和r=0.8384，P<0.01)；血小板聚集与NO2-生成亦呈明显正相关(r=0.7660，P<0.05)。
3 讨论
NO具有抑制血小板粘附和聚集作用[9]，胶原等激活血小板、促进血小板聚集和NO生成增多，可能有自身负反馈保护调节意义。但活化血小板刺激NO生成的机制目前尚不清楚。血小板生成NO取决于细胞内NOS(为cNOS，Ca2+依赖)将L-Arg转化为L-Citrulline(L-瓜氨酸)，而胞内L-Arg库主要由血浆L-Arg经膜上氨基酸Y+转运载体(非Na+依赖)转运[6]。RGDS肽与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa结合，可明显抗血小板聚集。本工作观察到血小板产生NO2-、存在cNOS和L-Arg/NO转运途径，与文献报道一致，胶原活化血小板，可使NOS活性增高、L-Arg转运增强，NO2-生成增加。RGDS肽对非活化血小板L-Arg/NO途径无明显影响，而对胶原激活的血小板则可明显抑制NOS活性增高、L-Arg转运增强和NO2-生成增加。RGDS肽抗血小板聚集效应与NO2-生成呈明显正相关。结果表明胶原刺激NO生成，其机制与NOS活性增强、L-Arg跨细胞转运增加有关；RGDS肽阻断Ⅱb/Ⅲa复合物，对非活化血小板L-Arg/NO途径无明显影响，但对胶原活化的L-Arg/NO途径有拮抗作用。提示胶原刺激血小板活化，使L-Arg/NO途径增强是通过血小板膜GPⅡb/Ⅲa复合物所介导，RGDS肽可拮抗其增加作用。
, 百拇医药
参考文献
1 Sheu JR，Yen MH，Pen HC，et al.Triflavin，an Arg-Gly-Asp-containing peptide，prevents platelet plug formation in in vivo experiments.European Journal of Pharmacology，1995，294:231
2 Rote WE，Davis JH，Mousa SA，et al.Antithrombotic e ffects of DMP728，a platelet GPⅡb/Ⅲa receptor antagonist，in a canine model of arterial thrombosis.J cardiovasc Pharmacol，1994，23:681
3 Michelson AD，Benoit SE，Furman MI，et al.Effect of nitric oxide/EDRF on platelet surface glycoproteins.Am J Physiol，1996，270 (Heart Circ.Physiol.39):H1640
, 百拇医药
4 Lantoine F，Brunet A，Bedioui F，et al.Direct measurement of nitric oxide production in platelets: Relationship with cytosolic Ca2+ concentration.Biochemical and Biophysical Research Communications，1995，215(3):842
5 Golino P，Bgazz MC，Ambrosis G，et al.Endothelium-derived relaxing factor modulates platelet aggregation in a vivo model of recurrent platelet activation Circ Res，1992，7:1447
6 Vasta V，Meacci E，Farnararo M，et al.Identification of a specific transport system for L-arginine in human platelets.Biochemical and Biophysical Research Communications，1995，206(3):878
, http://www.100md.com
7 张新波，黄海鹭，张灵芝，等.一氧化氮合酶活性的测定及其应用.北京医科大学学报.Vol26增刊，1994，173
8 Ding AH，Nathan CF，Stuehr DJ.Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macorphages.J Immunol，1988，141:2407
9 Lukaszyk AB，Gabryelewicz A，Lukaszyk A，et al.Nitric oxide synthase inhibition and platelet function.Thromb Res，1994，75(6):667, 百拇医药
单位：姚兴海 首都医科大学病理生理教研室，北京100054；王培勇 于文杰 李夏 苏静怡 唐朝枢 北京医科大学心血管基础研究所，北京100083
关键词：RGDS肽；血小板聚集；L-精氨酸转运；一氧化氮合酶；亚硝酸盐
基础医学与临床990509 摘要 本工作在胶原活化的大鼠血小板上，观察RGDS肽对血小板聚集、L-精氨酸(L-Arg)转运、一氧化氮合酶(NOS)活性和亚硝酸盐(NO2-)含量的影响。结果发现，4μg/mL胶原引起血小板聚集时，L-Arg转运增强、NOS活性增高和NO2-含量增加。血小板L-Arg转运的Vmax与NOS活性和NO2-生成呈明显正相关(r=0.8100和0.8343，P<0.01)；血小板聚集与NO2-生成亦呈明显正相关(r=0.7660，P<0.05)。RGDS肽200μmol/L与胶原共同孵育，可明显抑制胶原引起的血小板聚集、L-Arg转运增强、NOS活性增高和NO2-含量增加。提示，胶原激活的血小板L-Arg/NO途径增加是通过Ⅱb/Ⅲa复合物所介导，RGDS肽可拮抗其增加作用。
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Effect of Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) Peptide on L-Arginine/NO Pathway of
Collagen Activated Rat Platelet
Yao Xinghai1 Wang Peiyong2 Yu Wenjie2 Li Xia2 Su Jingyi2 Tang Chaoshu2
(1 Dept. of Physiopathology of Capital University of Medical Sciences，Beijing100050)
(2 Institute of Cardiovascular Basic Research Beijing Medical University，Beijing100083)
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The aim of this work is to investigate the effect of Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) peptide on platelet aggregation，L-Arginine (L-Arg) transport，NO synthase (NOS) activity and nitrite (NO2-) content during platelet activation.Experiments were performed on collagen activated rat platelets in vivo.Results showed that collagen 4μg/mL，while inducing platelet aggregation，obviously enhanced L-Arg transport，NOS activity and NO2- production.When platelets and collagen were incubated together with 200μmol/L RGDS peptide it was found that RGDS peptide markedly inhibit collagen activated platelet aggregation，L-Arg transport，NOS activation and NO2- content.The Vmax of L-Arg transport is positively related with NOS activation and NO2- production (r=0.8100 and 0.8343，P<0.01); The platelet aggregation and NO2- production are also in positive relationship (r=0.7660，P<0.05).The results suggested that the L-Arg/NO pathway of collagen activated platelet is enhanced by GPⅡb/Ⅲa complex medium and the increase of the L-Arg/NO pathway can be resisted by RGDS.
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Key words RGDS peptide platelet aggregation L-Arg transport NO synthase nitrite
RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)肽是血浆纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)Aa链95～98和572～575位的四肽氨基酸残基，为血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa复合物的配基。应用天然或合成的含RGDS结构物作为血小板膜GPⅡb/Ⅲa复合物阻断剂可抑制血小板聚集，具有明确的抗栓效应[1，2]。近年的研究亦证实，NO可降低血小板的活性，使GPⅡb/Ⅲa复合物下调[3]。Lantoine等发现血小板富含NO合酶(NO Synthase，NOS)并催化L-精氨酸(L-Arginine，L-Arg)生成NO，血小板活化时刺激NO生成，血小板源NO具有抑制血小板聚集和扩张血管等重要作用[4，5]，但RGDS肽与NO生成的关系目前尚不清楚。本工作在胶原激活的大鼠血小板上观察RGDS肽对L-Arg/NO途径，即L-Arg转运，NOS活性及NO生成的影响，以探讨血小板膜GPⅡb/Ⅲa与NO生成的关系。
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1 材料与方法
1.1 血小板聚集及血浆纤维蛋白原含量的测定
雄性Wistar大鼠体重200～250g，乌拉坦(1.0g/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝，离心分别制备富血小板血浆(PRP，1 000r/min，15min)及贫血小板血浆(PPP，3 500r/min，15min)，PRP调至5×108血小板/mL。实验分4组，于每管置180μL PRP，37 ℃预孵育1min后，分别加入20μL下述不同的药物。(1)对照组加入生理盐水；(2)RGDS肽组加入RGDS肽200μmol/L；(3)胶原组加入胶原4μg/mL；(4)胶原+RGDS肽组加入胶原4μg/mL和RGDS肽200μmol/L。实验各组37 ℃孵育5min，按比浊法测定血小板聚集。亚硫酸钠法测定血浆Fg含量。
1.2 血小板L-Arg转运测定[6]
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按1:10(v/v)取PRP悬浮于Hepes缓冲液中(mmol/L：NaCl 137，KCl 2.7，NaH2PO4 3.0，MgCl2 1.0和Hepes 3.5，pH 7.4)2350r/min离心10min，弃上清，重复洗脱一次。血小板悬浮在含葡萄糖(5mmol/L)和CaCl2(1mmol/L)的Hepes缓冲液中，调整血小板至2×108血小板/mL，在水浴振荡器上预孵育10min。实验分组同上，取50μL血小板悬液，加入生理盐水或RGDS肽(200μmol/L)，孵育5min，加入胶原4μg/mL孵育5min，再分别加入不同浓度3H-L-Arg(2.5，5，10，20，40，80和100μmol/L)孵育1min(预试发现在2min内，血小板3H-L-Arg摄入与孵育时间呈直线关系)，加入终止液(mmol/L：甲醛270，EGTA 16，NaCl 150)100μL，经微孔抽滤装置过0.45μm孔径微孔滤膜抽滤，用Hepes液4mL冲洗3次，晾干，加入闪烁液在β液闪计数仪上测定3H放射活性。同时设立不加样本的非特异平行对照管，L-Arg血小板转运为总摄入与非特异结合之差，以每min pmol/108血小板表示。
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1.3 血小板一氧化氮合酶(NO Synthase，NOS)活性的测定[7]
取血小板悬液0.4mL，37 ℃预孵育10min后，加入生理盐水或RGDS肽200μmol/L，孵育1min，加入4μg/mL胶原10min后，再加10% Triton X-100(终浓度)超声30s，4 ℃ 12 000r/min，离心10min，取上清0.2mL，加0.1mL孵育液(Tris-HCl，pH 7.4)50mmol/L，NADPH 100μmol/L，CaCl2 2mmol/L，L-Arg 30μmol/L，3H-L-Arg 0.5μCi/100μL，钙调蛋白1μg/100μL 37 ℃孵育30min，用0.2mL预冷的终止液(mmol/L ：NaAc 2.0 pH 5.5，L-瓜氨酸1，EDTA 2，EGTA 0.2)放置10min，经Dowex AG 50-X 82(Na+型)的阳离子交换层析柱，取上清0.3mL，加入闪烁液，测样本放射活性。
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1.4 血小板亚硝酸盐生成测定
用微盘测定法[8]，取PRP 1.0mL，预孵育10min，加入生理盐水或RGDS肽200μmol/L，1min后加入胶原4μg/mL，孵育1h后，离心3 000r/min，10min，取上清，加入等量Greiss液(1%对氨基苯磺胺，0.1% N-(1-奈基)-乙二胺，5%磷酸)，室温放置10min，应用酶标仪在550nm波长下测样本的吸光度。
1.5 材料
Wistar大鼠由北京医科大学实验动物部提供 ：L-[2，3-3H]-Arg(比活性2.29 TBq/mmol)购自DuPont NEN； 胶原，RGDS肽，L-Arg，钙调蛋白等均购自Sigma Co.余为市售分析纯试剂。
1.6 统计学
, 百拇医药
实验结果以均数±标准差(
±s)表示，用One-Way analysis of anova方法，组间q检验作统计学处理。2 结果
2.1 RGDS肽对大鼠血小板聚集的影响
本实验所制备的大鼠PRP中Fg含量为2.87±0.12mg/mL，胶原引起血小板明显聚集，RGDS肽可明显抑制胶原引起的血小板聚集。见表1所示。
表1 RGDS肽对L-Arg/NO途径和血小板聚集的影响
Table1 Effect of RGDS Peptide on L-Arginine/NO Pathway And Platelet Aggregation(
±s,n=5), http://www.100md.com
Group
L-Arg Transport
NOS Activity
(pmol/108pt)
No2-Content
(μmol/108pt)
Pt Aggregation%
5×108pt
Vmax(pmol/108pt/min)
Km(μmol)
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Control
12.53±0.86
7.15±1.54
11.08±0.92
4.43±0.42
-
RGDS
11.98±1.25
7.87±1.21
10.53±1.07
4.41±0.59
-
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Collagen
16.72±1.29**
6.89±1.19
22.24±1.44**
8.25±0.30**
50.2±2.77
Coll+rgds
14.20±0.68##
7.02±1.51
18.70±1.66##
, 百拇医药
6.78±0.94##
43.2±3.35##
Compared with Control Group **p<0.01;Compared with Collagen Group ##p<0.01.
2.2 RGDS肽对血小板L-Arg转运的影响
大鼠血小板对L-Arg摄取呈浓度饱和高亲合转运特征，与文献报告一致[6]。见图1所示。RGDS组与对照组血小板L-Arg转运相近。胶原刺激血小板L-Arg转运，较对照组其最大转运速率(Vmax)增加40%(P<0.01)，但不改变L-Arg转运的Km值。RGDS肽抑制胶原的上述作用，胶原+RGDS组的Vmax值较胶原组降低15%(P<0.01)。见表1所示。
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图1 大鼠血小板3H-L-Arg的转运特征
Fig1 Kinetics of 3H-L-Arg Transport by Rat Platelets (
±s, n=5)2.3 RGDS肽对血小板NOS活性的影响
RGDS肽对未活化血小板NOS活性无明显影响，但胶原刺激血小板NOS激活(较对照组增加101%，P<0.01)为RGDS肽所拮抗，胶原+RGDS组较胶原组NOS活性抑制16%(P<0.01)。结果见表1所示。
2.4 RGDS肽对血小板NO2-生成的影响
, http://www.100md.com RGDS肽对未活化血小板NO2-生成无明显影响，而胶原刺激血小板NO2-生成增多(较对照组增加86%，P<0.01)为RGDS肽所抑制，胶原+RGDS组较胶原组NO2-生成降低18%(P<0.01)见表1所示。
血小板L-Arg转运的Vmax与NOS活性和NO2-生成呈明显正相关(r=0.8100和r=0.8384，P<0.01)；血小板聚集与NO2-生成亦呈明显正相关(r=0.7660，P<0.05)。
3 讨论
NO具有抑制血小板粘附和聚集作用[9]，胶原等激活血小板、促进血小板聚集和NO生成增多，可能有自身负反馈保护调节意义。但活化血小板刺激NO生成的机制目前尚不清楚。血小板生成NO取决于细胞内NOS(为cNOS，Ca2+依赖)将L-Arg转化为L-Citrulline(L-瓜氨酸)，而胞内L-Arg库主要由血浆L-Arg经膜上氨基酸Y+转运载体(非Na+依赖)转运[6]。RGDS肽与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa结合，可明显抗血小板聚集。本工作观察到血小板产生NO2-、存在cNOS和L-Arg/NO转运途径，与文献报道一致，胶原活化血小板，可使NOS活性增高、L-Arg转运增强，NO2-生成增加。RGDS肽对非活化血小板L-Arg/NO途径无明显影响，而对胶原激活的血小板则可明显抑制NOS活性增高、L-Arg转运增强和NO2-生成增加。RGDS肽抗血小板聚集效应与NO2-生成呈明显正相关。结果表明胶原刺激NO生成，其机制与NOS活性增强、L-Arg跨细胞转运增加有关；RGDS肽阻断Ⅱb/Ⅲa复合物，对非活化血小板L-Arg/NO途径无明显影响，但对胶原活化的L-Arg/NO途径有拮抗作用。提示胶原刺激血小板活化，使L-Arg/NO途径增强是通过血小板膜GPⅡb/Ⅲa复合物所介导，RGDS肽可拮抗其增加作用。
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