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编号:10265487
大鼠颈动脉损伤后内膜增生的计算机图像分析
http://www.100md.com 《铁道医学》 1999年第6期
     作者:林桂粉 刘文琦 乔增勇 张丽蓉

    单位:南京铁道医学院 (南京 210009)

    关键词:数字图像处理;体视学方法;寡脱氧核苷酸;内膜增生

    铁道医学990606 【摘要】 目的 利用计算机图像处理分析系统对局部应用反义寡脱氧核苷酸(ODNs)对大鼠颈动脉损伤后内膜增生抑制作用进行定量分析。方法 将大鼠随机分成6组(即反义组A、正义组B、错配组C、对照组D、脂质体组E、假手术组F),进行大鼠颈动脉损伤后内膜增生的形态参数测定。结果 A组管腔面积大于B、C、D及E组(P<0.05)且小于F组(P<0.05);A组的内膜面积、内膜/中膜面积比值、最大内膜厚度、内膜/中膜厚度比值、内膜覆盖率均明显小于B、C、D及E组(P<0.01),而B、C、D及E组组间两两比较无显著性差异(P>0.05)。结论 利用计算机图像处理从量化角度分析内膜增生的各种情况,进一步证实了血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)的反义(ODNs)对氮气干燥后大鼠颈动脉内膜增殖有抑制作用,且具有序列依赖性。
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    Computer image analysis of the inhibitory effect of intimal hyperplasia in rat's carotid artery

    Lin Guifen,Liu Wenqi,Qiao Zenyong et al.

    Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009

    【Abstract】 Objective To quantitatively analyse the inhibitory effect of antisense phosphorthioate oligodeoxynucleotides on rat carotid artery after nitrogen drying injury by compute image processing.Method The rats were classified into six groups (antisense group,sense group,mismatch group,DOTAP group. control group and false group). The morphology of intimal hyperplasis in rat carotid artery after nitrogen drying injury were measured. Results The intimal hyperplasia in antisense ATR ODNs treated rats were inhibited significantly compared with the sense,mismatch and DOTAP group,whereas sense.mismatch and DOTAP group failed to show any inhibitory effect.Conclusion The ATR plays an important role in the mechanism of intimal hyperplasia,and it shows inhibitony effect of antisense phosphorthioate oligodeoxynucleotides on in rat carotid artery after nitrogen drying injury.
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    【Key words】 digital image processing stereological method oligodeoxynucleotides intimal hyperplasia

    (Railway Medical Journal,1999,27:370~372)

    本世纪60年代开始研制图像分析系统,经过几十年的发展,计算机图像处理分析系统在生物及医学分析中发挥了相当大的作用,成为其主要分析测试手段[1]

    目前市场上销售的欧美国家的图像自动分析系统价格十分昂贵,而国内在90年代初研制的分析系统,效果并不十分理想,在实际应用中还存在不少问题。主要原因是这些系统大多属通用的计算机图像分析系统,针对性不强,处理特殊要求的医学图像则难以达到预期的效果,而且软件系统大多是基于WIN3.1或DOS系统,未能充分发挥计算机资源的优势,用户很难进行2次开发。
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    作者应用自己研制的图像处理软件系统,对新生大鼠缺氧缺血模型脑切片中线粒体衰竭进行了图像分析[2]。并介绍图像分析系统的研制、系统软硬件的构成及应用血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)的反义寡脱氧核苷酸(ODNs)对大鼠颈动脉损伤后内膜增生抑制作用的图像分析。

    1 图像分析系统

    1.1 硬件系统

    计算机子系统:计算机显示卡为SVGA、系统主板至少有一个16位扩展槽、内存16 MB以上、硬盘应在2 000 MB以上。

    图像输入子系统:MTV-1881EX-CCD彩色摄像机和MVPCI-V3真彩色图像采集卡。MTV-1881EX-CCD彩色摄像机:600条水平摄像线,最小景物照度为0.2 lux,扫描速度为(1/125) s。
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    MVPCI-V3真彩色图像采集卡:分辨率为512×512×8 Bit,采集图像是实时在VGA卡上显示,实现图像同频显示工作方式。

    图像输出子系统:激光打印机,720DPI的EPSON-STYLUS COLOR彩色喷墨打印机。

    1.2 软件系统

    该软件是在WIN95环境下,应用最流行可视化快速开发工具Delphi,编程语言为面向对象Pascal语言。系统提供了独特的窗口、菜单、控制对话的界面和鼠标操作,为使用者提供了全新的图形操作界面,易学易用。

    软件系统涉及的图像处理按以下几个步骤进行:(1)对输入的图像先进行中值滤波法平滑处理,在抑制随机噪声的同时,又能保持边沿少受模糊[3];(2)局部自适应的直方图均衡化处理[4]。由于大多数显微摄像系统所成的像,其灰度分布一般集中在较窄的区间,引起图像细节不清楚。我们采用局部自适应的直方图均衡化处理后,使得图像的灰度分布均匀而使灰度间距拉开,增大了反差,使图像细节清晰。(3)利用已处理过的图像边沿进行图像分割[5]。其方法如下:
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    设经过直方图均衡化分析处理后的图像函数为f(x,y),点(x,y)处梯度Gradf(x,y)的模用GM(x,y)表示,分割后的图像为g(x,y), 则

    GM(x,y)=|Gradf(x,y)|={[f(x,y)-f(x+1.y+1)]2+[f(x+1,y)-f(x,y+1)2]}1/2

    当GM(x,y)≥T时 g(x,y)=255

    当GM(x,y)
    利用这种方法将明显边缘及背景分别用灰度级255和0表示,产生二值图像,从而确定边缘位置,实现了以边沿进行图像分割。经分割后的图像就可以进行生物医学图像体视学参数的测定。

    1.3 体视学方法测形态参数
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    1.3.1 血管腔面积计算及精度分析

    可以将血管腔简化成一个封闭的多边形。在获取多边形的边界点的坐标(xi,yi)后,可计算血管腔的面积[6]

    经过分析,发现当多边形的坐标点分布大致比较均匀,即多边形边长大致相同时,由上式计算的血管腔面积精度最高。

    1.3.2 血管腔周长计算

    在将血管腔简化成一个封闭的多边形后,血管腔的总长度则为封闭多边形各边的长度之和。由于照度的原因,血管腔的边缘有时不能有效辨析,为了提高血管腔周长的计算准确度,往往加大采集封闭多边形点数,因而所形成的多边形更加弯曲,得到的周长往往不能准确反映血管腔的周长,因此软件系统采用曲线拟合法进行。
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    1.3.3 体视学参数计算

    设血管腔面积为S,内膜与中膜面积分别为S1、S2,内膜外侧周长为L,内膜面积与中膜面积的比率=S1/S2;内膜及中膜厚度是指内膜与中膜的最大厚度处测定两点间距离D1、D2,内膜厚度与中膜厚度比率=D1/D2;内膜内侧周长为L′,内膜覆盖率= L′/L。

    2 局部应用反义寡核脱氧苷酸对大鼠颈动脉损伤后内膜增生抑制作用的计算机图像分析

    一些研究已证实:血管平滑肌细胞的异常增殖、迁移,在血管成形术后再狭窄的发病机制中起着重要的作用[7]。反义技术是基因治疗的前沿技术之一[8]。利用该技术在大鼠颈动脉内皮损伤段,以压力为驱动系统,阳离子脂质体DOTAP为转染系统,将针对AT1R的反义ODNs,局部、靶向作用于大鼠颈动脉内皮剥脱后的腔内,观察AT1R的反义ODNs对内膜增生的影响,以期为再狭窄提供一种新的有效的基因治疗途径。
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    2.1 动物分组及实验方法

    将雄性SD大鼠55只随机分为6组,即反义组(A)、正义组(B)、错配组(C)、对照组(D)、脂质体组(E)、假手术组(F),见表1。饲养2周后,经股静脉每公斤体重注入Evans蓝染料60 mg,30 min后用经心原位灌注法[9]灌注0.9%的生理盐水至流出液变清后,改用4%多聚甲醛生理盐水灌注固定10 min。取Evans蓝着色颈动脉,放入福尔马林进一步固定后,取前、中、后三部分进行石蜡包埋,非连续切片8~10层,苏木精-伊红染色,随机取3个血管断面输入计算机,进行图像处理及体视学参数测量,计算管腔面积、内膜面积、中膜面积、内膜/中膜面积比值、最大内膜厚度、内膜/中膜厚度比值、内膜覆盖率等参数。

    表1 动物及分组 组别

    n

    处理方法
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    A

    10

    内皮剥脱后转染100μgAT1R的反义ODN1

    B

    10

    内皮剥脱后转染100μgAT1R的正义ODN1

    C

    10

    内皮剥脱后转染100μgAT1R的错配ODN1

    D
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    10

    内皮剥脱后不转染任何物质

    E

    5

    内皮剥脱后转染100μg的DOTAP

    F

    10

    仅用0.9%生理盐水冲洗左颈总动脉

    2.2 结果

    各组大鼠颈动脉管腔的6个体视学参数测量结果见表2。表2 反义寡脱氧核苷酸对大鼠颈动脉损伤后内膜增生抑制作用的计算机图像分析结果(x±s) 组别

    管腔面积/mm2
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    内膜面积/mm2

    内膜/中膜面积比值

    最大内膜厚度/mm

    内膜/中膜厚度比值

    内膜覆盖率/%

    A

    0.344 0±0.037 0

    0.064 1±0.016 1

    0.487 1±0.133 3

    0.040 1±0.001 2

    0.899 9±0.296 0
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    55.900 0±11.900 0

    B

    0.267 5±0.074 5

    0.135 2±0.027 9

    1.122 2±0.256 3

    0.114 6±0.024 2

    2.297 2±0.480 8

    77.530 0±09.450 0

    C

    0.286 4±0.045 9

    0.136 1±0.013 8
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    1.034 9±0.116 4

    0.096 9±0.025 3

    1.922 0±0.362 4

    82.960 0±11.660 0

    D

    0.245 3±0.059 8

    0.131 2±0.021 2

    0.981 3±0.139 7

    0.109 0±0.024 2

    2.356 8±0.472 0

    79.380 0±09.300 0
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    E

    0.283 3±0.043 5

    0.146 9±0.006 1

    1.075 6±0.108 3

    0.106 6±0.026 5

    2.129 5±0.362 3

    85.730 0±15.130 0

    F

    0.405 2±0.020 6

    采用方差分析Q检验进行各组之间两两比较,P<0.05有显著性差异。

, 百拇医药     2.3 分析

    利用图像分析系统,在将各组动物切片的图像输入计算机后,对图像进行对比度拉伸、增强、特征提取后,快速地计算出各组切片的管腔面积、内膜面积、中膜面积、内膜/中膜面积比值、最大内膜厚度、内膜/中膜厚度比值、内膜覆盖率等参数,从而对6组切片进行分析。从表2可以看出,A组管腔面积大于B、C、D及E组(P<0.05)且小于F组(P<0.05);A组的内膜面积、内膜/中膜面积比值、最大内膜厚度、内膜/中膜厚度比值、内膜覆盖率均明显小于B、C、D及E组(P<0.01),而B、C、D及E组组间两两比较无显著性差异(P>0.05)。

    3 结 论

    图像处理分析进一步证实了AT1R的反义ODNs对氮气干燥后大鼠颈动脉内膜增殖有抑制作用,且具有序列依赖性。AT1R在内膜形成的发病机制中起重要作用,这为采用AT1R反义ODNs防治血管再狭窄提供了一种新的基因治疗方法。尽管从光镜上观察AT1R的反义ODNs也能得出抑制血管内膜增殖这一结论,但这只是定性的,不具备数值分析功能。通过对6组切片的图像,采用专用的图像采集卡进行实时数据采集,从定量的角度来分析,所得出的结论更具有说服力、更可靠。
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    图像处理软件使用Windows独特的窗口、菜单、控制对话框等界面和鼠标操作手段,这样对图像处理软件设计不甚了解的生物医学工作者都能方便快捷地进行操作测试,使得这一套图像处理分析系统能在生物医学领域广泛得到推广应用。

    参考文献

    1 Xu J.Image analysis and its applications.Singapore: World Scientifics,1992.1

    2 林桂粉,邵小松,汤云珍.新生大鼠缺氧缺血模型脑切片中线粒体衰竭的计算机图像分析.中国医学物理学杂志,1998,15(1):36

    3 Huang TS, Yang GT, Tang GY.A fast two-dimensional median filtering algorithm.IEEE trans.Acoustics,Speech,and Signal Processing,ASSP,1979,27(1):13
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    4 荆仁杰,叶秀清,徐胜荣,等.计算机图像处理.杭州:浙江大学出版社,1990.145

    5 Roberts LG.Machine perception of three-dimensional solids,in J.T.Tippett. Optical and electro-optical information processing ver1.0. Cambridge:MA MIT Press,1965.159

    6 Kenneth RC.digital image processing.ver 1.0. En~glewood Cliffs, NJ Prentice-Hall International Inc,1997.489

    7 Libby P,Tanaka H. The molecular bases of restenosis.Prog Cardiovasc Dis,1997,40(2):97
, 百拇医药
    8 Roush W.Antisensen aims for a renaissance. Science, 1997,276:1192

    9 Urata H,Nishimura H,Granten D,et al. Angiotensin Ⅱcoverting en~zymeindepent pathways of angiotensin Ⅱ formation in human tissue and cardiovascular disease.Blood Press, 1996,5(suppl):22

    收稿:1999-05-28 修回:1999-08-27

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