Rnasin对脑胶质瘤细胞生长的抑制作用
作者：王占祥 章翔 费舟 张志文 刘飞 曹卫东 陈义军 杨帆
单位：王占祥 章翔 费舟 张志文 刘飞 曹卫东 陈义军(第四军医大学西京医院神经外科)；杨帆(基础部病理学教研室,陕西西安710032)
关键词：核糖核酸酶抑制因子；胶质瘤；C6胶质瘤细胞；SHG44胶质瘤细胞
癌症000115
摘 要：目的：探讨核糖核酸酶抑制因子(RNasin)对脑胶质瘤生长的抑制作用及可能机理。方法：从人胎盘组织中提取制备RNasin，体内外观察其对人SHG44和大鼠C6胶质瘤细胞生长的抑制作用。结果：(1)体外不同浓度的RNasin对培养的C6及SHG44胶质瘤细胞存活率无明显影响，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)；(2)加入RNasin后裸鼠体内C6胶质瘤平均重量为1.72g±0.184g，平均大小(直径)为12.84mm±1.15mm；SHG44胶质瘤平均重量为1.012g±0.174g，平均大小为11.20mm±1.21mm，均与对照组有显著性差异(P<0.05)。结论：RNasin体外对培养的胶质瘤细胞生长无抑制作用，而体内对胶质瘤瘤体的生长有明显抑制作用。
, http://www.100md.com
分类号：R739.41 文献标识码：A
文章编号：1000467X(2000)01-0051-03
Suppression effect of ribonuclease inhibitor on the growth of glioma cells
WANG Zhan-xiang, ZHANG Xiang, FEI Zhou, et al.
(Department of Neurosurgery,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,Xi an 710032,P.R.China)
Abstract：Objective：To explore the role and mechanism of suppression of ribonuclease RNase inhibitor in the growth of glioma cells.Method：Ribonuclease inhibitor was extracted from human placenta, and the suppression of ribonuclease inhibitor on the growth of human glioma cell line SHG44 and rat glioma cell line C6 was observed in vitro and in vivo. Results：(1) Different concentrations of ribonuclease inhibitor had no prominent effect on the survival rates of two glioma cell lines in vitro.There was no remarkable difference between experimental and control groups (P > 0.05). (2) the average weight and size of tumor in nude mice in treated and control groups were that： C6 glioma cell line 1.172± 0.184 g vs 2.876 g± 3.94 g and 12.84± 1.15 mm vs 21.72 mm± 1.60 mm;SHG44 glioma cell line 1.012± 0.174 g vs 2.834± 0.321 g and 11.20± 1.21 mm vs 22.17± 1.62 mm.There were evidences differences between experimental and control groups (P<0.01).Conclusion： Ribonuclease inhibitor has no inhibitory effect on the growth of cultured glioma cells in vitro, whereas it has significant inhibitor effect on the growth of glioma in vivo.
, 百拇医药
Key words：Ribonclease inhibitor ; Glioma; C6 glioma cell; SHG44 glioma cell ▲
核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor,RNasin)是体内的一种糖蛋白，广泛存在于细胞的可溶性部分。近年来研究显示：RNasin对乳腺癌、胃癌等实体肿瘤的生长有明显的抑制作用[1]，但RNasin对脑胶质瘤的生长是否有同样的抑制作用尚未见报道。本文采用从人胎盘组织中提取制备的RNasin，体内外观察了其对人SHG44及大鼠C6胶质瘤细胞生长的抑制作用。
1材料与方法
1.1材料
正常分娩的人胎盘，由第四军医大学西京医院妇产科提供；二硫苏糖醇(DTT)和噻唑蓝(MTT)，为美国Sigma公司产品；牛胰核糖核酸酶，为西德Bockringrt Mannheim公司产品；酵母RNA，为中科院上海生化所产品；SHG44人胶质瘤细胞株，由苏州医学院脑研所提供；C6大鼠胶质瘤细胞株，由美国Johns Hospital癌症研究中心Bert Volgestein教授惠赠；二甲基亚砜(DMSO)，为北京原平生物技术公司产品。
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1.2方法
1.2.1RNasin的分离、纯化和活性测定：参考BlackburnP等[2，3]报道：(1)取新鲜人胎盘，用含0.25mmol/L蔗糖的TrisHCl(pH7.5)缓冲液洗涤后，经匀浆器制备匀浆液，离心后取上清液，加入固体(NH4)2SO4盐析，然后将35%～60%饱和度的蛋白质，溶于磷酸盐缓冲剂(PBS，pH6.4)，制成RNasin粗制品；(2)RNasin粗制品在PBS中透析过夜，加入到DEAE-52离子交换柱上，缓冲液淋洗后用含0.15mmol/L～0.5mmol/LNaCl的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，流速为0.8ml/min,在280nm处测OD值和活性；(3)透析除盐后，过Sepharose-RNasin亲和层析柱，淋洗去掉非专一性吸附的杂蛋白，加洗脱缓冲液洗脱。流速为0.5ml/min，在280nm处测OD值和活性；(4)RNasin活性测定参照文献[2，3],测定加入RNasin后RNase水解RNA能力的下降，RNasin活力以校正A260表示，校正A260=A260(不加RNase)-A260(测定)，收集RNasin活性高峰的第35～55管中液体。混和透析除盐后，过SepharoseRNase亲和层析柱，合并活性高的37～48管中液体，即可提纯RNasin。
, 百拇医药
1.2.2RNasin体外对C6及SHG44胶质瘤细胞生长的影响：用进口24孔扳培养C6及SHG44胶质瘤细胞，每孔接种1×103细胞，待细胞平铺长满孔底时(3天)，更换培养基，同时以每3孔为一组分别加入50U、100U、200URNasin及生理盐水(对照)，每孔体积为200μl，再培养3天后加入新配制的噻唑蓝(MTT)(5mg/ml)20μl作用4小时，弃孔中培养液，再加入二甲基亚砜(DMSO)150μl/孔，振荡10分钟后选择40nm波长测OD值，并按下式计算细胞存活率：细胞存活率=试验组OD/对照组OD×100%。
1.2.3RNasin体内对C6及SHG44胶质瘤瘤体生长的影响：取5～6周龄雌性Balb/C裸鼠20只(动物合格证号02-49-1)，随机分成2组，右腋皮下分别接种C6和SHG44胶质瘤细胞2×106，于接种后48小时每组各取5只，沿原接种部位注射RNasin200u，另5只作对照，注射等量生理盐水。饲养14天后处死小鼠，测量瘤重及肿瘤最长径a和最宽径b，根据公式D=(a+b)/2计算肿瘤大小。
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1.2.4统计学处理：采用t检验进行统计学分析。
2结果
2.1RNasin的分离、纯化及活性测定
RNasin提纯过程各步骤的总蛋白、总活性及比活性见表1。经SepharoseRNase亲和层析后，RNasin的比活性达到了600u/mg，而匀浆液和盐析后所得蛋白质检测不到RNasin活性，可能是由于RNasin与组织中RNase结合，掩蔽了其活性所致。
表1 RNasin提纯过程中总蛋白、总活性及比活性 步骤
总蛋白(mg)
总活性(u)
比活性(u/mg)
, 百拇医药
匀浆液
5000
(NH4)2SO4
600
DEAE-52纤维交换层析
100
1300
13
Sepharose-RNase亲和层析
1
600
600
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2.2RNasin体外对C6及SHG44胶质瘤细胞生长的影响
加入不同浓度RNasin后，C6及SHG44瘤细胞存活率如表2，各浓度组间细胞存活率无显著差别(P>0.05)，表明不同浓度的RNasin在体外对C6和SHG44瘤细胞的生长无明显影响。表2 不同浓度RNasin中C6及SHG44瘤细胞存活率(
±s，%) 细胞类型
生理盐水
RNasin浓度
50U
100U
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200U
C6
100
97.6±2.1
93.1±1.8
92.1±2.0
SHG44
100
98.5±2.7
95.2±1.9
94.3±3.1
2.3RNasin体内对C6及SHG44胶质瘤瘤体生长的影响
, 百拇医药
由表3可见，注入RNasin后C6及SHG44胶质瘤的大小和重量均较对照组明显减小(P<0.05)，表明RNasin对胶质瘤的瘤体在体内生长有明显的抑制作用。表3 RNasin对C6与SHG44胶质瘤瘤体重量及大小影响(±s) 组别
裸小鼠数(只)
肿瘤重量(g)
抑制率(%)
肿瘤大小(mm)
P值
对照组
5
, http://www.100md.com
2.876±0.394
-
21.72±1.60
<0.05
C6细胞组
5
1.172±0.184
59
12.84±1.15
对照组
5
2.834±0.321
, 百拇医药
-
22.17±1.62
<0.05
SHG44组
5
1.012±0.174
64
11.20±1.21
3讨论
核糖核酸酶抑制因子(Ribonnsdease Inhibitor,RNasin)是一种糖蛋白，其分子结构中含有8个游离的巯基，是活性所必需的基团，巯基的氧化会导致其失活。在体内RNasin能与核糖核酸酶(Ribonudease,RNase)结合成复合物，有效地抑制酶活性，因而能保护mRNA和rRNA免受RNase降解，使蛋白合成旺盛[4]。RNasin不仅是一种RNase的抑制剂，而且是一种血管生成因子(Angiogenin)的抑制剂，它与血管生成因子的亲合力比与RNase的亲合力大100倍[5]。
, 百拇医药
1993年Polakonski等[6]发现，重组的人胎盘核糖核酸酶抑制因子有抑制小鼠乳腺癌瘤体生长的作用。本实验结果显示：RNasin在体外对胶质瘤细胞生长无明显影响，而在体内则有明显的抑制作用，不论是肿瘤的大小还是重量都较对照组明显降低，进一步证明了RNasin的体内抗实体瘤作用。其抑制瘤体生长的机理可能是：RNasin与血管生成因子结合后有效地抑制了其生物活性，血管生成因子可以刺激实体病内血管新生，所以RNasin通过对血管生成因子的抑制作用，而抑制了肿瘤的生长和转移。RNasin的这种抗实体瘤生长作用，有望为肿瘤的治疗开辟新途径。
*通讯作者：Tel：86-29-3375323
Fax：86-29-3211790
Email：wangzx@fmmu.edu.cn
参考文献：
, 百拇医药
[1]武利存.血管生长抑制因子[J].国外医学肿瘤学分册，1993，20(1)：4～7.
[2]Blackburn P, Keeromth N, Both K,et al.Ribonuclease inhibitor from human placenta： interaction with derivatives of ribonuclease A[J]. J Biol Chem, 1997,254： 12844～ 12848.
[3]王道苑.核糖核酸酶抑制因子的制备及其在红细胞中的检测[J].生物化学杂志，1985，2(3)：75～ 77.
[4]Schneider R, Higgins MJ, Kieninger D,et al. The Human ribonuclease angiogenin inhibitor is encoded by a gene mapped to chromosome 11p15.5, within 90 kb of the H-RAS protooncogene[J]. Cytogenet Cell Gene,1992,59： 264～ 267.
, 百拇医药
[5]Polakowski IJ, Lewis MK, Muthukkaruppan VR, et al.A ribonuclease inhibitor expresses anti-angiogenic properties and leads to reduced tumor growth in mice[J]. Am J Pathol, 1993,143(2)： 507～ 517.
[6] Polakowski IJ, Smith LH, Finaly I,et al. A protein ribonuclease inhibitor expresses anti-angiogenic properties in mice[J]. EXS,1993,61： 428～ 433.
收稿日期：1998-12-14, 百拇医药
单位：王占祥 章翔 费舟 张志文 刘飞 曹卫东 陈义军(第四军医大学西京医院神经外科)；杨帆(基础部病理学教研室,陕西西安710032)
关键词：核糖核酸酶抑制因子；胶质瘤；C6胶质瘤细胞；SHG44胶质瘤细胞
癌症000115
摘 要：目的：探讨核糖核酸酶抑制因子(RNasin)对脑胶质瘤生长的抑制作用及可能机理。方法：从人胎盘组织中提取制备RNasin，体内外观察其对人SHG44和大鼠C6胶质瘤细胞生长的抑制作用。结果：(1)体外不同浓度的RNasin对培养的C6及SHG44胶质瘤细胞存活率无明显影响，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)；(2)加入RNasin后裸鼠体内C6胶质瘤平均重量为1.72g±0.184g，平均大小(直径)为12.84mm±1.15mm；SHG44胶质瘤平均重量为1.012g±0.174g，平均大小为11.20mm±1.21mm，均与对照组有显著性差异(P<0.05)。结论：RNasin体外对培养的胶质瘤细胞生长无抑制作用，而体内对胶质瘤瘤体的生长有明显抑制作用。
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分类号：R739.41 文献标识码：A
文章编号：1000467X(2000)01-0051-03
Suppression effect of ribonuclease inhibitor on the growth of glioma cells
WANG Zhan-xiang, ZHANG Xiang, FEI Zhou, et al.
(Department of Neurosurgery,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,Xi an 710032,P.R.China)
Abstract：Objective：To explore the role and mechanism of suppression of ribonuclease RNase inhibitor in the growth of glioma cells.Method：Ribonuclease inhibitor was extracted from human placenta, and the suppression of ribonuclease inhibitor on the growth of human glioma cell line SHG44 and rat glioma cell line C6 was observed in vitro and in vivo. Results：(1) Different concentrations of ribonuclease inhibitor had no prominent effect on the survival rates of two glioma cell lines in vitro.There was no remarkable difference between experimental and control groups (P > 0.05). (2) the average weight and size of tumor in nude mice in treated and control groups were that： C6 glioma cell line 1.172± 0.184 g vs 2.876 g± 3.94 g and 12.84± 1.15 mm vs 21.72 mm± 1.60 mm;SHG44 glioma cell line 1.012± 0.174 g vs 2.834± 0.321 g and 11.20± 1.21 mm vs 22.17± 1.62 mm.There were evidences differences between experimental and control groups (P<0.01).Conclusion： Ribonuclease inhibitor has no inhibitory effect on the growth of cultured glioma cells in vitro, whereas it has significant inhibitor effect on the growth of glioma in vivo.
, 百拇医药
Key words：Ribonclease inhibitor ; Glioma; C6 glioma cell; SHG44 glioma cell ▲
核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor,RNasin)是体内的一种糖蛋白，广泛存在于细胞的可溶性部分。近年来研究显示：RNasin对乳腺癌、胃癌等实体肿瘤的生长有明显的抑制作用[1]，但RNasin对脑胶质瘤的生长是否有同样的抑制作用尚未见报道。本文采用从人胎盘组织中提取制备的RNasin，体内外观察了其对人SHG44及大鼠C6胶质瘤细胞生长的抑制作用。
1材料与方法
1.1材料
正常分娩的人胎盘，由第四军医大学西京医院妇产科提供；二硫苏糖醇(DTT)和噻唑蓝(MTT)，为美国Sigma公司产品；牛胰核糖核酸酶，为西德Bockringrt Mannheim公司产品；酵母RNA，为中科院上海生化所产品；SHG44人胶质瘤细胞株，由苏州医学院脑研所提供；C6大鼠胶质瘤细胞株，由美国Johns Hospital癌症研究中心Bert Volgestein教授惠赠；二甲基亚砜(DMSO)，为北京原平生物技术公司产品。
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1.2方法
1.2.1RNasin的分离、纯化和活性测定：参考BlackburnP等[2，3]报道：(1)取新鲜人胎盘，用含0.25mmol/L蔗糖的TrisHCl(pH7.5)缓冲液洗涤后，经匀浆器制备匀浆液，离心后取上清液，加入固体(NH4)2SO4盐析，然后将35%～60%饱和度的蛋白质，溶于磷酸盐缓冲剂(PBS，pH6.4)，制成RNasin粗制品；(2)RNasin粗制品在PBS中透析过夜，加入到DEAE-52离子交换柱上，缓冲液淋洗后用含0.15mmol/L～0.5mmol/LNaCl的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，流速为0.8ml/min,在280nm处测OD值和活性；(3)透析除盐后，过Sepharose-RNasin亲和层析柱，淋洗去掉非专一性吸附的杂蛋白，加洗脱缓冲液洗脱。流速为0.5ml/min，在280nm处测OD值和活性；(4)RNasin活性测定参照文献[2，3],测定加入RNasin后RNase水解RNA能力的下降，RNasin活力以校正A260表示，校正A260=A260(不加RNase)-A260(测定)，收集RNasin活性高峰的第35～55管中液体。混和透析除盐后，过SepharoseRNase亲和层析柱，合并活性高的37～48管中液体，即可提纯RNasin。
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1.2.2RNasin体外对C6及SHG44胶质瘤细胞生长的影响：用进口24孔扳培养C6及SHG44胶质瘤细胞，每孔接种1×103细胞，待细胞平铺长满孔底时(3天)，更换培养基，同时以每3孔为一组分别加入50U、100U、200URNasin及生理盐水(对照)，每孔体积为200μl，再培养3天后加入新配制的噻唑蓝(MTT)(5mg/ml)20μl作用4小时，弃孔中培养液，再加入二甲基亚砜(DMSO)150μl/孔，振荡10分钟后选择40nm波长测OD值，并按下式计算细胞存活率：细胞存活率=试验组OD/对照组OD×100%。
1.2.3RNasin体内对C6及SHG44胶质瘤瘤体生长的影响：取5～6周龄雌性Balb/C裸鼠20只(动物合格证号02-49-1)，随机分成2组，右腋皮下分别接种C6和SHG44胶质瘤细胞2×106，于接种后48小时每组各取5只，沿原接种部位注射RNasin200u，另5只作对照，注射等量生理盐水。饲养14天后处死小鼠，测量瘤重及肿瘤最长径a和最宽径b，根据公式D=(a+b)/2计算肿瘤大小。
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1.2.4统计学处理：采用t检验进行统计学分析。
2结果
2.1RNasin的分离、纯化及活性测定
RNasin提纯过程各步骤的总蛋白、总活性及比活性见表1。经SepharoseRNase亲和层析后，RNasin的比活性达到了600u/mg，而匀浆液和盐析后所得蛋白质检测不到RNasin活性，可能是由于RNasin与组织中RNase结合，掩蔽了其活性所致。
表1 RNasin提纯过程中总蛋白、总活性及比活性 步骤
总蛋白(mg)
总活性(u)
比活性(u/mg)
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匀浆液
5000
(NH4)2SO4
600
DEAE-52纤维交换层析
100
1300
13
Sepharose-RNase亲和层析
1
600
600
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2.2RNasin体外对C6及SHG44胶质瘤细胞生长的影响
加入不同浓度RNasin后，C6及SHG44瘤细胞存活率如表2，各浓度组间细胞存活率无显著差别(P>0.05)，表明不同浓度的RNasin在体外对C6和SHG44瘤细胞的生长无明显影响。表2 不同浓度RNasin中C6及SHG44瘤细胞存活率(
±s，%) 细胞类型生理盐水
RNasin浓度
50U
100U
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200U
C6
100
97.6±2.1
93.1±1.8
92.1±2.0
SHG44
100
98.5±2.7
95.2±1.9
94.3±3.1
2.3RNasin体内对C6及SHG44胶质瘤瘤体生长的影响
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由表3可见，注入RNasin后C6及SHG44胶质瘤的大小和重量均较对照组明显减小(P<0.05)，表明RNasin对胶质瘤的瘤体在体内生长有明显的抑制作用。表3 RNasin对C6与SHG44胶质瘤瘤体重量及大小影响(
±s) 组别裸小鼠数(只)
肿瘤重量(g)
抑制率(%)
肿瘤大小(mm)
P值
对照组
5
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2.876±0.394
-
21.72±1.60
<0.05
C6细胞组
5
1.172±0.184
59
12.84±1.15
对照组
5
2.834±0.321
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22.17±1.62
<0.05
SHG44组
5
1.012±0.174
64
11.20±1.21
3讨论
核糖核酸酶抑制因子(Ribonnsdease Inhibitor,RNasin)是一种糖蛋白，其分子结构中含有8个游离的巯基，是活性所必需的基团，巯基的氧化会导致其失活。在体内RNasin能与核糖核酸酶(Ribonudease,RNase)结合成复合物，有效地抑制酶活性，因而能保护mRNA和rRNA免受RNase降解，使蛋白合成旺盛[4]。RNasin不仅是一种RNase的抑制剂，而且是一种血管生成因子(Angiogenin)的抑制剂，它与血管生成因子的亲合力比与RNase的亲合力大100倍[5]。
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1993年Polakonski等[6]发现，重组的人胎盘核糖核酸酶抑制因子有抑制小鼠乳腺癌瘤体生长的作用。本实验结果显示：RNasin在体外对胶质瘤细胞生长无明显影响，而在体内则有明显的抑制作用，不论是肿瘤的大小还是重量都较对照组明显降低，进一步证明了RNasin的体内抗实体瘤作用。其抑制瘤体生长的机理可能是：RNasin与血管生成因子结合后有效地抑制了其生物活性，血管生成因子可以刺激实体病内血管新生，所以RNasin通过对血管生成因子的抑制作用，而抑制了肿瘤的生长和转移。RNasin的这种抗实体瘤生长作用，有望为肿瘤的治疗开辟新途径。
*通讯作者：Tel：86-29-3375323
Fax：86-29-3211790
Email：wangzx@fmmu.edu.cn
参考文献：
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[1]武利存.血管生长抑制因子[J].国外医学肿瘤学分册，1993，20(1)：4～7.
[2]Blackburn P, Keeromth N, Both K,et al.Ribonuclease inhibitor from human placenta： interaction with derivatives of ribonuclease A[J]. J Biol Chem, 1997,254： 12844～ 12848.
[3]王道苑.核糖核酸酶抑制因子的制备及其在红细胞中的检测[J].生物化学杂志，1985，2(3)：75～ 77.
[4]Schneider R, Higgins MJ, Kieninger D,et al. The Human ribonuclease angiogenin inhibitor is encoded by a gene mapped to chromosome 11p15.5, within 90 kb of the H-RAS protooncogene[J]. Cytogenet Cell Gene,1992,59： 264～ 267.
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[5]Polakowski IJ, Lewis MK, Muthukkaruppan VR, et al.A ribonuclease inhibitor expresses anti-angiogenic properties and leads to reduced tumor growth in mice[J]. Am J Pathol, 1993,143(2)： 507～ 517.
[6] Polakowski IJ, Smith LH, Finaly I,et al. A protein ribonuclease inhibitor expresses anti-angiogenic properties in mice[J]. EXS,1993,61： 428～ 433.
收稿日期：1998-12-14, 百拇医药