双岐杆菌对牙周病原菌的体外抗生作用
作者：涂家珍 张和光 陈罕 廖旭辉 杨国平
单位：中山医科大学口腔医学院口腔内科， 广东 广州 510055
关键词：双岐杆菌；牙周病；微生物学；抗生作用；集落计数；微生物学
中山医科大学学报000412
摘 要： 【目的】 探讨双岐杆菌DM 8504对牙周病原菌的体外抗生作用。【方法】 分别取每升3×108 CFU (集落形成单位，colony-forming units, CFU)的牙龈卟啉单胞菌(Pg)，具核梭杆菌(Fn)，伴放线菌放线杆菌(Aa)，中间普氏菌(Pi)菌液20 μL与每升3×1010 CFU的DM 8504菌液20 μL混合培养，每株菌做16支试管,以各菌的单独培养作对照，厌氧培养36 h，平板菌落计数法定量测DM 8504的抑菌作用，计算抑制率。【结果】 DM 8504对Pg 1312、Pg 33277、Pi 25261、Pi 25611、Aa 29523、Aa Y4、Fn 10953抑制率分别达到55.42%、57.21%、48.21%、46.69%、43.00%、39.04%、49.36%。双歧杆菌本身所受抑制作用则较弱，与Pg 33277混合培养的抑制率为21.02%。单因素方差分析表明抑制作用有非常显著的统计学意义(P<0.01)。【结论】 双岐杆菌DM 8504对牙周致病菌Pg、Aa、Fn、Pi均有抑制作用。
, http://www.100md.com
中图分类号：R781.4 文献标识码： A
文章编号：1000-257X(2000)04-0274-03
The Antibiosis of Bifidobacterium on Periodontal Pathogens
TU Jia-zhen, ZHANG He-guang, CHEN Han, LIAO Xu-hui, YANG Guo-ping
(Department of Oral Medicine, College of Stomatology, Sun Yat-sen University
of Medical Sciences, Guangzhou 510055, China)
, http://www.100md.com
Abstract：【Objective】 To investigate the antibiosis of Bifidobacterium DM 8504 on periodontal pathogens. 【Methods】 20 μL of 3×108 CFU/L (colony-forming units, CFU) Porphyromonas gingivalis (Pg), Fusobacterium nucleatun (Fn),Prevotella intermedius (Pi) and Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) were mixed with 20 μL of 3×1010 CFU/L DM 8504 in 5 mL BHI broth test tubes respectively. Test tubes (n=16 for each bacterial strain) were then incubated in anaerobic cabinet for 36 h. Pure culture of each bacterial strain was used as control groups. After incubation, bacterial colonies on plates were counted and inhibitory rate of DM 8504 on periodontal pathogens was calculated. 【Results】 The inhibitory rate of DM 8504 on Pg 1312, Pg 33277, Pi 25261, Pi 25611, Aa 29523, Aa Y4 and Fn 10953 were 55.42%, 57.21%, 48.21%, 46.69%, 43.00%, 39.04% and 49.36% respectively. DM 8504 was slightly inhibited in co-culture. The inhibitory rate of Pg 33277 on DM 8504 was 21.02%. Statistical analysis showed that difference in viable bacterial enumeration of each strain between pure culture and co-culture was highly significant (P<0.01). 【Conclusion】 Bifidobacterium DM 8504 has inhibitory effect on periodontal pathogens Pg, Fn, Pi and Aa.
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Key words:Bifidobacterium; periodontal diseases/microbiology; antibiosis; colony count, microbial
对致病菌产生拮抗作用是双岐杆菌构成生物屏障作用的重要因素，许多研究表明双岐杆菌能抑制沙门氏菌、李斯特菌、弯曲菌、志贺菌和霍乱弧菌等多种革兰氏阳性和阴性菌[1～3]。目前双岐杆菌产生生物拮抗作用的研究主要集中在抑制肠道致病菌方面[1～3]，国内外尚未见双岐杆菌抑制牙周致病菌的文献报道。本研究设计了双岐杆菌体外抑菌实验,旨在探讨双岐杆菌对牙周病原菌的体外抗生作用, 从而为双歧杆菌应用于牙周病的生态防治提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 菌 种
青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolesentis)DM 8504：活菌制剂丽珠肠乐生产菌种；牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)：ATCC(American Typical Culture Center，美国标准培养物保存中心)1312(上海口腔医学研究所)，ATCC 33277(本实验室保存株)；具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，Fn)：ATCC 10953(上海口腔医学研究所)；伴放线菌放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)：FDC(Forsyth Dental Center: Forsyth牙科中心)Y4(华西医科大学口腔医学院)，ATCC 29523(本实验室保存株)；中间普氏菌(Prevotella intermedia，Pi)：ATCC 25261(华西医科大学口腔医学院)，ATCC 25611(本实验室保存株)。
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1.2 培养基
牛心脑浸液培养基(brain heart infusion, BHI)由美国Beckton Dickinson公司生产。配制时每100 mL添加西红柿汁20 mL及氯化血红素、维生素K1贮存液1 mL。双歧杆菌选择性培养基(bifidibacterial selective medium agar，BSA)，自配。
1.3 仪器设备
YQX厌氧培养箱(上海跃进医疗器械厂)，SW-CJ-IF超净工作台(苏州苏净集团安泰空气技术有限公司)，QY系列金花牌取液器(北京青云航空仪表公司)。
1.4 混合培养和定量分析
收集BHI平板上的各实验菌，将双岐杆菌菌液调至3×1010 CFU/L(集落形成单位，colony-forming units, CFU)，其它各实验菌菌液调至3×108 CFU/L，吸取各实验菌液20 μL接种至5 mL BHI液体培养基的试管中，每株菌接种16支试管，每管中再分别接种20 μL双岐杆菌液，以各实验菌液和双岐杆菌液20 μL 接种于等量液体培养基中单独培养作对照，37 ℃厌氧培养(体积比：80% N2, 10% H2, 10% CO2)36 h后取出，经10倍系列稀释到10-8，吸取各稀释菌液50 μL，用三角形玻璃推棒涂布平板，37 ℃厌氧培养24 h，计实验菌菌落数，涂布BSA平板厌氧培养48 h，计双岐杆菌菌落数(计数范围：每板30～400个)。计算双岐杆菌抑菌率为：
, 百拇医药
1.5 统计分析
本结果以SPSS for windows 9.0分析数据, 采用方差分析(ANOVA)法，α值定为双侧0.05。
2 结 果
DM 8504对Pg 1312、Pg 33277、Pi 25261、Pi 25611、Aa 29523、Aa Y4、Fn 10953都有抑制作用，抑制率分别达到55.42%、57.21%、48.21%、46.69%、43.00%、39.04%、49.36%, 而DM 8504本身受抑制作用较弱，与Pg 33277混合培养受抑率为21.02%(表1)。将原始数据换算成活菌数(CFU/L)：活菌数=菌落数×稀释倍数×20×1 000，再将其行对数变换，使各组方差齐，单因素方差分析结果表明：单独培养的各实验菌活菌数均多于混合培养数(P<0.01)(表2)。
表1 DM 8504对实验菌的抑菌率
, 百拇医药
Table 1 The inhibitory rate of DM 8504 on experimental bacteria (
±s，CFU/plate) Bacterial
strain
n
Bacterial colonies 1)
Percent
inhibition(%)
Pure culture
Co-culture
, 百拇医药
Pg 1312
16
332±5
148±3
55.42
Pg 33277
16
243±7
104±2
57.21
Pi 25261
16
251±5
, 百拇医药
130±3
48.21
Pi 25611
16
242±5
129±4
46.69
Aa 29523
16
307±9
175±4
43.00
Aa Y4
, 百拇医药
16
333±7
203±7
39.04
Fn 10953
16
156±4
79±3
49.36
DM 8504 2)
16
158±4
, 百拇医药 125±4
21.02
1) Data were selected when it was diluted to 10-7； 2) Co-culture with Pg 33277
3 讨 论
3.1 双岐杆菌用于牙周病生态防治的设想
牙周细菌的相互拮抗作用，对于牙周细菌组成和比例起着重要作用，直接影响牙周组织的健康及病变的发生和发展。顺应牙周微生态系规律，建立生理性的拮抗菌丛，恢复、维持牙周微生态系的平衡，是牙周病生态防治的新构思。双岐杆菌是人体最重要的益生菌，具有拮抗多种致病菌[1～3]、激活机体免疫机能、产生维生素、抗肿瘤、清除氧自由基、降解内毒素及细菌产生的有害酶、防治创面感染、促进伤口愈合等广泛的生态效应[2]。因此，若能在牙周微生态系内建立双岐杆菌的优势菌丛，可开辟一条安全有效、生态防治牙周病的新途径。
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表2 单独培养与混合培养的活菌数的比较
Table 2 Comparison of viable bacterial number between pure-culture and co-culture (±s, n=16) Bacterial
Strain
lg(bacterial number)
Pure-culture
Co-culture
Pg 1312
13.824±0.009
, 百拇医药
13.474±0.022
Pg 33277
13.690±0.010
13.320±0.014
Pi 25261
13.703±0.003
13.412±0.003
Pi 25611
13.684±0.014
13.411±0.022
Aa 29523
, http://www.100md.com
13.794±0.022
13.542±0.008
Aa Y4
13.825±0.018
13.495±0.016
Fn 10953
13.491±0.016
13.200±0.009
DM 8504
13.501±0.009
13.411±0.010
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Viable bacterial number in pure culture is more than that in co-culture (P<0.01)
3.2 菌液浓度确定
双岐杆菌生长较慢。本研究通过预实验观察，双岐杆菌要经18～24 h才进入对数生长期，而其它几种实验菌6～8 h即进入对数生长期。因此，参照蒋寒青等[3]报道双歧杆菌生物拮抗作用的菌液浓度比，将双岐杆菌菌液浓度调至3×1010 CFU/L，其余实验菌菌液浓度调至3×108 CFU/L，以显示双岐杆菌对牙周致病菌的生物拮抗作用。
3.3 双歧杆菌拮抗牙周致病菌的作用
对致病菌产生拮抗作用是双岐杆菌构成生物屏障作用的重要因素，双歧杆菌是否具有拮抗牙周致病菌的作用，是能否成为牙周病菌群调整疗法效应菌的关键指标之一。本结果表明双岐杆菌有抑制牙周病原菌Pg、Aa、Pi、Fn的作用， 提示若能在牙周微生态系内建立双岐杆菌的优势菌丛, 将有利于建立和维持牙周微生态系的生理性平衡。
, 百拇医药
3.4 双岐杆菌抗菌作用的机理分析
体外实验表明[4,5]，Pg、Aa、Pi、Fn的最适生长pH值均在中性至弱碱性范围。中间普氏菌仅能在6.0～7.3的pH范围中生长；牙龈卟啉单胞菌的最适生长pH值为7.5～8.0，在pH值小于6.5或大于8.7时，生长极差，不能保持应有的生物活性；具核梭杆菌、中间型普氏菌的生长随pH值的下降受抑制甚至停滞[6]。Rogers等[7]报道，Fn生长所需的氨基肽酶，其最适pH值为7.5～8.0，当pH值呈酸性时，这些酶活性明显下降，Fn的生长受抑制。在混合培养时，随着双岐杆菌的生长，培养基中的乳酸和乙酸增多，pH值下降到不适宜致病菌的生长，双岐杆菌产生的广谱抗菌物质也增多[1～3]，从而抑制了牙周病原菌Pg、Aa、Pi、Fn的生长。国内外尚未见双岐杆菌抑制牙周致病菌的文献报道，其抑菌的确切机制，待进一步研究。
基金项目：中山医科大学科研启动基金
, 百拇医药
作者简介：涂家珍(1967-)，男，福建长汀人，硕士，讲师，主攻牙周病的防治.
参考文献：
[1] Gibson G R,Wang X.Regulatory effects of Bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria[J]. J Appl Bacteriol, 1994,77(4):412.
[2] 陈昭斌，张朝武，康 白.我国人源双歧杆菌生态效应的研究近况[J].中国微生态学杂志,1997,9(5): 54.
[3] 蒋寒青，卢行安，康 白.对双歧杆菌DM 9227株的实验研究：Ⅰ双歧杆菌DM 9227株的试管内生物拮抗作用的研究[J].中国微生态学杂志,1993,5(1):26.
, http://www.100md.com
[4] Takahashi N, Saito K, Schachtele C F, et al. Acid tolerance and acid-neutralizing activity of Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia and Fusobacterium nucleatum[J]. Oral Microbiol Immunol, 1997, 12(6): 323.
[5] Svensater G, Larsson U B, Greif E C，et al. Acid tolerance response and survival by oral bacteria [J]. Oral Microbiol Immunol, 1997, 12(5): 266.
[6] 周 村，章锦才.牙周微生态研究进展[J].中国微生态学杂志, 1998, 10(4): 236.
[7] Rogers A H,Gunadi A,Gully N J,et al.An aminopeptidase nutritionally important to Fusobacterium nucleatum[J]. Microbiology, 1998,144(Pt 7):1807
收稿日期：1999-12-29, 百拇医药
单位：中山医科大学口腔医学院口腔内科， 广东 广州 510055
关键词：双岐杆菌；牙周病；微生物学；抗生作用；集落计数；微生物学
中山医科大学学报000412
摘 要： 【目的】 探讨双岐杆菌DM 8504对牙周病原菌的体外抗生作用。【方法】 分别取每升3×108 CFU (集落形成单位，colony-forming units, CFU)的牙龈卟啉单胞菌(Pg)，具核梭杆菌(Fn)，伴放线菌放线杆菌(Aa)，中间普氏菌(Pi)菌液20 μL与每升3×1010 CFU的DM 8504菌液20 μL混合培养，每株菌做16支试管,以各菌的单独培养作对照，厌氧培养36 h，平板菌落计数法定量测DM 8504的抑菌作用，计算抑制率。【结果】 DM 8504对Pg 1312、Pg 33277、Pi 25261、Pi 25611、Aa 29523、Aa Y4、Fn 10953抑制率分别达到55.42%、57.21%、48.21%、46.69%、43.00%、39.04%、49.36%。双歧杆菌本身所受抑制作用则较弱，与Pg 33277混合培养的抑制率为21.02%。单因素方差分析表明抑制作用有非常显著的统计学意义(P<0.01)。【结论】 双岐杆菌DM 8504对牙周致病菌Pg、Aa、Fn、Pi均有抑制作用。
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中图分类号：R781.4 文献标识码： A
文章编号：1000-257X(2000)04-0274-03
The Antibiosis of Bifidobacterium on Periodontal Pathogens
TU Jia-zhen, ZHANG He-guang, CHEN Han, LIAO Xu-hui, YANG Guo-ping
(Department of Oral Medicine, College of Stomatology, Sun Yat-sen University
of Medical Sciences, Guangzhou 510055, China)
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Abstract：【Objective】 To investigate the antibiosis of Bifidobacterium DM 8504 on periodontal pathogens. 【Methods】 20 μL of 3×108 CFU/L (colony-forming units, CFU) Porphyromonas gingivalis (Pg), Fusobacterium nucleatun (Fn),Prevotella intermedius (Pi) and Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) were mixed with 20 μL of 3×1010 CFU/L DM 8504 in 5 mL BHI broth test tubes respectively. Test tubes (n=16 for each bacterial strain) were then incubated in anaerobic cabinet for 36 h. Pure culture of each bacterial strain was used as control groups. After incubation, bacterial colonies on plates were counted and inhibitory rate of DM 8504 on periodontal pathogens was calculated. 【Results】 The inhibitory rate of DM 8504 on Pg 1312, Pg 33277, Pi 25261, Pi 25611, Aa 29523, Aa Y4 and Fn 10953 were 55.42%, 57.21%, 48.21%, 46.69%, 43.00%, 39.04% and 49.36% respectively. DM 8504 was slightly inhibited in co-culture. The inhibitory rate of Pg 33277 on DM 8504 was 21.02%. Statistical analysis showed that difference in viable bacterial enumeration of each strain between pure culture and co-culture was highly significant (P<0.01). 【Conclusion】 Bifidobacterium DM 8504 has inhibitory effect on periodontal pathogens Pg, Fn, Pi and Aa.
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Key words:Bifidobacterium; periodontal diseases/microbiology; antibiosis; colony count, microbial
对致病菌产生拮抗作用是双岐杆菌构成生物屏障作用的重要因素，许多研究表明双岐杆菌能抑制沙门氏菌、李斯特菌、弯曲菌、志贺菌和霍乱弧菌等多种革兰氏阳性和阴性菌[1～3]。目前双岐杆菌产生生物拮抗作用的研究主要集中在抑制肠道致病菌方面[1～3]，国内外尚未见双岐杆菌抑制牙周致病菌的文献报道。本研究设计了双岐杆菌体外抑菌实验,旨在探讨双岐杆菌对牙周病原菌的体外抗生作用, 从而为双歧杆菌应用于牙周病的生态防治提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 菌 种
青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolesentis)DM 8504：活菌制剂丽珠肠乐生产菌种；牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)：ATCC(American Typical Culture Center，美国标准培养物保存中心)1312(上海口腔医学研究所)，ATCC 33277(本实验室保存株)；具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，Fn)：ATCC 10953(上海口腔医学研究所)；伴放线菌放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)：FDC(Forsyth Dental Center: Forsyth牙科中心)Y4(华西医科大学口腔医学院)，ATCC 29523(本实验室保存株)；中间普氏菌(Prevotella intermedia，Pi)：ATCC 25261(华西医科大学口腔医学院)，ATCC 25611(本实验室保存株)。
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1.2 培养基
牛心脑浸液培养基(brain heart infusion, BHI)由美国Beckton Dickinson公司生产。配制时每100 mL添加西红柿汁20 mL及氯化血红素、维生素K1贮存液1 mL。双歧杆菌选择性培养基(bifidibacterial selective medium agar，BSA)，自配。
1.3 仪器设备
YQX厌氧培养箱(上海跃进医疗器械厂)，SW-CJ-IF超净工作台(苏州苏净集团安泰空气技术有限公司)，QY系列金花牌取液器(北京青云航空仪表公司)。
1.4 混合培养和定量分析
收集BHI平板上的各实验菌，将双岐杆菌菌液调至3×1010 CFU/L(集落形成单位，colony-forming units, CFU)，其它各实验菌菌液调至3×108 CFU/L，吸取各实验菌液20 μL接种至5 mL BHI液体培养基的试管中，每株菌接种16支试管，每管中再分别接种20 μL双岐杆菌液，以各实验菌液和双岐杆菌液20 μL 接种于等量液体培养基中单独培养作对照，37 ℃厌氧培养(体积比：80% N2, 10% H2, 10% CO2)36 h后取出，经10倍系列稀释到10-8，吸取各稀释菌液50 μL，用三角形玻璃推棒涂布平板，37 ℃厌氧培养24 h，计实验菌菌落数，涂布BSA平板厌氧培养48 h，计双岐杆菌菌落数(计数范围：每板30～400个)。计算双岐杆菌抑菌率为：
, 百拇医药
1.5 统计分析
本结果以SPSS for windows 9.0分析数据, 采用方差分析(ANOVA)法，α值定为双侧0.05。
2 结 果
DM 8504对Pg 1312、Pg 33277、Pi 25261、Pi 25611、Aa 29523、Aa Y4、Fn 10953都有抑制作用，抑制率分别达到55.42%、57.21%、48.21%、46.69%、43.00%、39.04%、49.36%, 而DM 8504本身受抑制作用较弱，与Pg 33277混合培养受抑率为21.02%(表1)。将原始数据换算成活菌数(CFU/L)：活菌数=菌落数×稀释倍数×20×1 000，再将其行对数变换，使各组方差齐，单因素方差分析结果表明：单独培养的各实验菌活菌数均多于混合培养数(P<0.01)(表2)。
表1 DM 8504对实验菌的抑菌率
, 百拇医药
Table 1 The inhibitory rate of DM 8504 on experimental bacteria (
±s，CFU/plate) Bacterialstrain
n
Bacterial colonies 1)
Percent
inhibition(%)
Pure culture
Co-culture
, 百拇医药
Pg 1312
16
332±5
148±3
55.42
Pg 33277
16
243±7
104±2
57.21
Pi 25261
16
251±5
, 百拇医药
130±3
48.21
Pi 25611
16
242±5
129±4
46.69
Aa 29523
16
307±9
175±4
43.00
Aa Y4
, 百拇医药
16
333±7
203±7
39.04
Fn 10953
16
156±4
79±3
49.36
DM 8504 2)
16
158±4
, 百拇医药 125±4
21.02
1) Data were selected when it was diluted to 10-7； 2) Co-culture with Pg 33277
3 讨 论
3.1 双岐杆菌用于牙周病生态防治的设想
牙周细菌的相互拮抗作用，对于牙周细菌组成和比例起着重要作用，直接影响牙周组织的健康及病变的发生和发展。顺应牙周微生态系规律，建立生理性的拮抗菌丛，恢复、维持牙周微生态系的平衡，是牙周病生态防治的新构思。双岐杆菌是人体最重要的益生菌，具有拮抗多种致病菌[1～3]、激活机体免疫机能、产生维生素、抗肿瘤、清除氧自由基、降解内毒素及细菌产生的有害酶、防治创面感染、促进伤口愈合等广泛的生态效应[2]。因此，若能在牙周微生态系内建立双岐杆菌的优势菌丛，可开辟一条安全有效、生态防治牙周病的新途径。
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表2 单独培养与混合培养的活菌数的比较
Table 2 Comparison of viable bacterial number between pure-culture and co-culture (
±s, n=16) BacterialStrain
lg(bacterial number)
Pure-culture
Co-culture
Pg 1312
13.824±0.009
, 百拇医药
13.474±0.022
Pg 33277
13.690±0.010
13.320±0.014
Pi 25261
13.703±0.003
13.412±0.003
Pi 25611
13.684±0.014
13.411±0.022
Aa 29523
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13.794±0.022
13.542±0.008
Aa Y4
13.825±0.018
13.495±0.016
Fn 10953
13.491±0.016
13.200±0.009
DM 8504
13.501±0.009
13.411±0.010
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Viable bacterial number in pure culture is more than that in co-culture (P<0.01)
3.2 菌液浓度确定
双岐杆菌生长较慢。本研究通过预实验观察，双岐杆菌要经18～24 h才进入对数生长期，而其它几种实验菌6～8 h即进入对数生长期。因此，参照蒋寒青等[3]报道双歧杆菌生物拮抗作用的菌液浓度比，将双岐杆菌菌液浓度调至3×1010 CFU/L，其余实验菌菌液浓度调至3×108 CFU/L，以显示双岐杆菌对牙周致病菌的生物拮抗作用。
3.3 双歧杆菌拮抗牙周致病菌的作用
对致病菌产生拮抗作用是双岐杆菌构成生物屏障作用的重要因素，双歧杆菌是否具有拮抗牙周致病菌的作用，是能否成为牙周病菌群调整疗法效应菌的关键指标之一。本结果表明双岐杆菌有抑制牙周病原菌Pg、Aa、Pi、Fn的作用， 提示若能在牙周微生态系内建立双岐杆菌的优势菌丛, 将有利于建立和维持牙周微生态系的生理性平衡。
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3.4 双岐杆菌抗菌作用的机理分析
体外实验表明[4,5]，Pg、Aa、Pi、Fn的最适生长pH值均在中性至弱碱性范围。中间普氏菌仅能在6.0～7.3的pH范围中生长；牙龈卟啉单胞菌的最适生长pH值为7.5～8.0，在pH值小于6.5或大于8.7时，生长极差，不能保持应有的生物活性；具核梭杆菌、中间型普氏菌的生长随pH值的下降受抑制甚至停滞[6]。Rogers等[7]报道，Fn生长所需的氨基肽酶，其最适pH值为7.5～8.0，当pH值呈酸性时，这些酶活性明显下降，Fn的生长受抑制。在混合培养时，随着双岐杆菌的生长，培养基中的乳酸和乙酸增多，pH值下降到不适宜致病菌的生长，双岐杆菌产生的广谱抗菌物质也增多[1～3]，从而抑制了牙周病原菌Pg、Aa、Pi、Fn的生长。国内外尚未见双岐杆菌抑制牙周致病菌的文献报道，其抑菌的确切机制，待进一步研究。
基金项目：中山医科大学科研启动基金
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作者简介：涂家珍(1967-)，男，福建长汀人，硕士，讲师，主攻牙周病的防治.
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收稿日期：1999-12-29, 百拇医药