随机引物聚合酶链反应指纹法对变形链球菌标准株进行基因分型
作者：陈罕 凌均 刘建伟 高燕 杨国平 林正梅
单位：中山医科大学口腔医学院口腔内科， 广东 广州 510055
关键词：龋齿；病因学；变形链球菌；分类；细菌分型技术；聚合酶链反应；方法
中山医科大学学报000404
摘 要：【目的】 探索一种利用随机引物聚合酶链反应指纹法技术进行变形链球菌基因分型的方法。【方法】 利用变形链球菌不同血清型标准株和通用引物5′-TGCCGAGCTG-3′，研究了在不同条件下进行聚合酶链反应的结果，寻找满意的聚合酶链反应条件。【结果】 找到了较为满意的聚合酶链反应条件：94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，反应进行45个循环。【结论】 随机引物聚合酶链反应指纹法技术在一定的控制条件下可用于变形链球菌的鉴定和分型。
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中图分类号：R378.1； R781.1； Q756 文献标识码: A
文章编号:1000-257X(2000)04-0251-02
Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Finger Printing for the Genotypic Identification of Streptococcus mutans
CHEN Han, LING Jun-qi, LIU Jian-wei, GAO Yan, YANG Guo-ping, LIN Zheng-mei
(Department of Oral Medicine, College of Stomatology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510055, China)
, 百拇医药
Abstract：【Objective】 To find out an ideal method used in genotypic identification of Streptococcus mutans by arbitrarily primed polymerase chain reaction finger printing (AP-PCR). 【Method】 The Streptococcus mutans standard strains were used with different polymerase chain reaction (PCR) conditions on general primer (5′-TGCCGAGCTG-3′) to select an ideal result. 【Result】An ideal PCR reaction was found：94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45 cycles. 【Conclusion】 AP-PCR method could be used as an ideal method for Streptococcus mutans strains' genotypic identification.
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Key words：dental caries/etiology; Streptococcus mutans/classification; bacterial typing technique; polymerase chain reaction/methods
龋病是一种由口腔内细菌引起，具有传染性的感染性疾病[1]。变形链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)已被公认为是龋病的主要致病菌。对变形链球菌进行分型，直至进行单个特定菌株的个体识别是非常必要和重要的，这有助于对变形链球菌在龋病过程中的作用、传播的方式、感染的途径进行有效的研究。传统的分型方法有血清型分型法、生化反应鉴定法等，由于效率低、可靠性差，目前仅用于变形链球菌的初步鉴定。现代采用的有染色体DNA指纹图、核糖体分型等，但这些方法都由于技术上操作复杂，费用昂贵而较难广泛使用。随着分子生物学技术的发展，一种新的方法由于操作简便，可靠性高而在微生物鉴定分类学上得到了较为广泛的应用，即随机引物聚合酶链反应指纹法(arbitrarily primed polymerase chain reaction finger printing，AP-PCR)。本研究旨在利用AP-PCR 技术对变形链球菌的标准菌株进行AP-PCR鉴定，分型，为以后利用此技术进行龋病学研究提供实验基础。
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1 材料与方法
1.1 细菌菌株
变形链球菌标准株(本室保存)：AHT(血清型a)、10449(血清型c)、Ingbritt(血清型c)、6715(血清型d)、LM7(血清型e)、OMZ175(血清型f)、OMZ65(血清型g)、菌株-20 ℃保存于体积分数为30%甘油BHI培养基。
1.2 细菌培养与染色体DNA提取
将各标准菌株接种于5 mL BHI液体培养基中，37 ℃，体积分数为90% N2、5% CO2、5% H2培养18 h，3 500×g(Biofuge, r=0.35 m)离心20 min收集菌体，加入0.6 mL混合液(160 g/L PEG，lysozyme 3.3 g/L，RNase 166 mg/L)37 ℃水浴60 min，15 000×g(Biofuge, r=0.35 m )离心2 min，沉淀加0.45 mL TE，50 μL 100 g/L SDS, 37 ℃水浴2 h，加0.8 mL无水乙醇，15 000×g(Biofuge, r=0.35 m )离心2 min，沉淀加0.5 mL 10 g/L SDS 68 ℃水浴20 min，加500 μL平衡酚、500 μL氯仿抽提，上清液加0.8 mL无水乙醇，15 000×g离心15 min，沉淀溶于100 μL TE液溶解，-20 ℃保存。
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1.3 AP-PCR反应
引物：5′-TGCCGAGCTG-3′(上海生工合成)，以50 μL做为反应体积，分别加入200 ng染色体DNA，100 pmol引物，5 μL 10×反应缓冲液，2.5 U Taq酶，10 mL dNTP。不足体积用ddH2O补齐。反应条件：94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，反应进行45个循环。取反应产物10 μL在10 g/L琼脂糖中电泳(TAE缓冲液)，观察并记录实验结果。
1.4 试剂与仪器
酶与试剂均购自华美公司，BHI培养基购自Becton Dickinson公司，PCR反应在PE9600 PCR仪上进行。
2 结 果
本实验所采用的引物和实验条件，可扩增出较为稳定和清晰的条带。本实验方法经多次重复实验，稳定与重复性较好。变形链球菌c血清型的标准株S. mutans 10449、Ingbritt的染色体DNA较稳定地扩增出了8～10个条带，可方便地进行菌株的鉴定和识别,其它血清型的菌株扩增出的条带数较少(图1)。
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图1 变形链球菌标准株AP-PCR产物
Fig.1 S. mutans standard strains AP-PCR products
Lane 1: Marker λDNA/HindⅢ； Lane 2： Marker φ174/HeaⅢ； Lane 3：S. mutans AHT； Lane 4： S. mutans 6715； Lane 5： S. mutans LM7； Lane 6： S. mutans OMZ175； Lane 7： S. mutans OMZ65； Lane 8： S. mutans 10449； Lane 9： S. mutans Ingbritt
3 讨 论
变形链球菌已被确认为是龋病的重要病原菌，因而已对它进行了广泛的研究。利用从不同病人的口腔中分离的变形链球菌株，进行菌斑形成和致龋性实验，发现各个菌株的致龋力相差较大。为了有效地预防龋病，对各个变形链球菌菌株进行个体识别，判定它的致龋能力是非常重要的[2]。变形链球菌的鉴定、分型是变形链球菌致龋作用研究的基础。已有的变形链球菌鉴定分型手段已不能满足当前研究工作的需要，迫切要求建立新的快速、简便、准确的分型及单个特定菌株个体鉴定的方法。细菌AP-PCR技术是利用PCR原理，应用通用寡核苷酸引物，对细菌染色体DNA进行扩增，利用琼脂糖电泳将扩增产物按分子大小分开，获得一定的条带模式即指纹图谱。这种指纹图谱可利用来进行细菌的基因分型工作。AP-PCR已成功地应用于Helicobacter pylori、Porphyromonas gingivalis等的基因分型工作[3]。本实验采用了变形链球菌染色体DNA小规模快速提取法，取得的染色体DNA达到了进行PCR扩增的纯度要求。随机扩增采用的引物长度为10个base，并应用经过优化的扩增条件，保证了能扩增出8至12个较为稳定、重复性较好的条带。经过多次重复实验，对S. mutans 10449、Ingbritt菌株染色体DNA均扩增出了相似的条带区，说明这些条带代表了变形链球菌中的保守区，利用这些保守区的信息，可将这些条带做为标准模式带用于变形链球菌的鉴定。标准模式带以外的条带，根据条带的有无、多少和位置可进行菌株的个体识别，而进行变形链球菌致龋性的分子流行病学研究，如进行变形链球菌某菌株在母婴和家庭间传播的研究[4]。本实验方法如果在临床分离株进行，可望确定某些条带与龋病的发生和患者DMFT数的关系进而利用这些特征条带进行变形链球菌毒力株确定。本研究表明AP-PCR技术做为分子生物学现代技术可望应用于龋病的微生物分子流行病学、毒力株与非毒力株、基因分型的研究。
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基金项目：中山医科大学科研基金资助项目(1998年度)
作者简介：陈罕(1967-)，男，江苏扬州人，博士，讲师.
参考文献：
[1] Loesche W J. Role of Streptococcus mutans in human dental decay [J]. Microbiol Rev, 1986,50(1):353.
[2] de Soet J J, van Loveren C, Lammens A J, et al. Differences in cariogenicity between fresh isolates of Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans [J]. Caries Res, 1991,25(2):116.
, 百拇医药
[3] Menard C,Mouton C.Randomly amplified polymorphic DNA analysis confirms the biotyping scheme of Porphyromonas gingivalis [J]. Res Microbiol, 1993,144(3):445.
[4] Li Y, Caufield P W. Arbitrarily primed polymerase chain reaction finger printing for the genotypic identification of mutans streptococci from humans [J]. Oral Microbiol Immunol, 1998,13(1):17.
收稿日期：2000-03-03, 百拇医药
单位：中山医科大学口腔医学院口腔内科， 广东 广州 510055
关键词：龋齿；病因学；变形链球菌；分类；细菌分型技术；聚合酶链反应；方法
中山医科大学学报000404
摘 要：【目的】 探索一种利用随机引物聚合酶链反应指纹法技术进行变形链球菌基因分型的方法。【方法】 利用变形链球菌不同血清型标准株和通用引物5′-TGCCGAGCTG-3′，研究了在不同条件下进行聚合酶链反应的结果，寻找满意的聚合酶链反应条件。【结果】 找到了较为满意的聚合酶链反应条件：94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，反应进行45个循环。【结论】 随机引物聚合酶链反应指纹法技术在一定的控制条件下可用于变形链球菌的鉴定和分型。
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中图分类号：R378.1； R781.1； Q756 文献标识码: A
文章编号:1000-257X(2000)04-0251-02
Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Finger Printing for the Genotypic Identification of Streptococcus mutans
CHEN Han, LING Jun-qi, LIU Jian-wei, GAO Yan, YANG Guo-ping, LIN Zheng-mei
(Department of Oral Medicine, College of Stomatology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510055, China)
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Abstract：【Objective】 To find out an ideal method used in genotypic identification of Streptococcus mutans by arbitrarily primed polymerase chain reaction finger printing (AP-PCR). 【Method】 The Streptococcus mutans standard strains were used with different polymerase chain reaction (PCR) conditions on general primer (5′-TGCCGAGCTG-3′) to select an ideal result. 【Result】An ideal PCR reaction was found：94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45 cycles. 【Conclusion】 AP-PCR method could be used as an ideal method for Streptococcus mutans strains' genotypic identification.
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Key words：dental caries/etiology; Streptococcus mutans/classification; bacterial typing technique; polymerase chain reaction/methods
龋病是一种由口腔内细菌引起，具有传染性的感染性疾病[1]。变形链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)已被公认为是龋病的主要致病菌。对变形链球菌进行分型，直至进行单个特定菌株的个体识别是非常必要和重要的，这有助于对变形链球菌在龋病过程中的作用、传播的方式、感染的途径进行有效的研究。传统的分型方法有血清型分型法、生化反应鉴定法等，由于效率低、可靠性差，目前仅用于变形链球菌的初步鉴定。现代采用的有染色体DNA指纹图、核糖体分型等，但这些方法都由于技术上操作复杂，费用昂贵而较难广泛使用。随着分子生物学技术的发展，一种新的方法由于操作简便，可靠性高而在微生物鉴定分类学上得到了较为广泛的应用，即随机引物聚合酶链反应指纹法(arbitrarily primed polymerase chain reaction finger printing，AP-PCR)。本研究旨在利用AP-PCR 技术对变形链球菌的标准菌株进行AP-PCR鉴定，分型，为以后利用此技术进行龋病学研究提供实验基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细菌菌株
变形链球菌标准株(本室保存)：AHT(血清型a)、10449(血清型c)、Ingbritt(血清型c)、6715(血清型d)、LM7(血清型e)、OMZ175(血清型f)、OMZ65(血清型g)、菌株-20 ℃保存于体积分数为30%甘油BHI培养基。
1.2 细菌培养与染色体DNA提取
将各标准菌株接种于5 mL BHI液体培养基中，37 ℃，体积分数为90% N2、5% CO2、5% H2培养18 h，3 500×g(Biofuge, r=0.35 m)离心20 min收集菌体，加入0.6 mL混合液(160 g/L PEG，lysozyme 3.3 g/L，RNase 166 mg/L)37 ℃水浴60 min，15 000×g(Biofuge, r=0.35 m )离心2 min，沉淀加0.45 mL TE，50 μL 100 g/L SDS, 37 ℃水浴2 h，加0.8 mL无水乙醇，15 000×g(Biofuge, r=0.35 m )离心2 min，沉淀加0.5 mL 10 g/L SDS 68 ℃水浴20 min，加500 μL平衡酚、500 μL氯仿抽提，上清液加0.8 mL无水乙醇，15 000×g离心15 min，沉淀溶于100 μL TE液溶解，-20 ℃保存。
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1.3 AP-PCR反应
引物：5′-TGCCGAGCTG-3′(上海生工合成)，以50 μL做为反应体积，分别加入200 ng染色体DNA，100 pmol引物，5 μL 10×反应缓冲液，2.5 U Taq酶，10 mL dNTP。不足体积用ddH2O补齐。反应条件：94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，反应进行45个循环。取反应产物10 μL在10 g/L琼脂糖中电泳(TAE缓冲液)，观察并记录实验结果。
1.4 试剂与仪器
酶与试剂均购自华美公司，BHI培养基购自Becton Dickinson公司，PCR反应在PE9600 PCR仪上进行。
2 结 果
本实验所采用的引物和实验条件，可扩增出较为稳定和清晰的条带。本实验方法经多次重复实验，稳定与重复性较好。变形链球菌c血清型的标准株S. mutans 10449、Ingbritt的染色体DNA较稳定地扩增出了8～10个条带，可方便地进行菌株的鉴定和识别,其它血清型的菌株扩增出的条带数较少(图1)。
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图1 变形链球菌标准株AP-PCR产物
Fig.1 S. mutans standard strains AP-PCR products
Lane 1: Marker λDNA/HindⅢ； Lane 2： Marker φ174/HeaⅢ； Lane 3：S. mutans AHT； Lane 4： S. mutans 6715； Lane 5： S. mutans LM7； Lane 6： S. mutans OMZ175； Lane 7： S. mutans OMZ65； Lane 8： S. mutans 10449； Lane 9： S. mutans Ingbritt
3 讨 论
变形链球菌已被确认为是龋病的重要病原菌，因而已对它进行了广泛的研究。利用从不同病人的口腔中分离的变形链球菌株，进行菌斑形成和致龋性实验，发现各个菌株的致龋力相差较大。为了有效地预防龋病，对各个变形链球菌菌株进行个体识别，判定它的致龋能力是非常重要的[2]。变形链球菌的鉴定、分型是变形链球菌致龋作用研究的基础。已有的变形链球菌鉴定分型手段已不能满足当前研究工作的需要，迫切要求建立新的快速、简便、准确的分型及单个特定菌株个体鉴定的方法。细菌AP-PCR技术是利用PCR原理，应用通用寡核苷酸引物，对细菌染色体DNA进行扩增，利用琼脂糖电泳将扩增产物按分子大小分开，获得一定的条带模式即指纹图谱。这种指纹图谱可利用来进行细菌的基因分型工作。AP-PCR已成功地应用于Helicobacter pylori、Porphyromonas gingivalis等的基因分型工作[3]。本实验采用了变形链球菌染色体DNA小规模快速提取法，取得的染色体DNA达到了进行PCR扩增的纯度要求。随机扩增采用的引物长度为10个base，并应用经过优化的扩增条件，保证了能扩增出8至12个较为稳定、重复性较好的条带。经过多次重复实验，对S. mutans 10449、Ingbritt菌株染色体DNA均扩增出了相似的条带区，说明这些条带代表了变形链球菌中的保守区，利用这些保守区的信息，可将这些条带做为标准模式带用于变形链球菌的鉴定。标准模式带以外的条带，根据条带的有无、多少和位置可进行菌株的个体识别，而进行变形链球菌致龋性的分子流行病学研究，如进行变形链球菌某菌株在母婴和家庭间传播的研究[4]。本实验方法如果在临床分离株进行，可望确定某些条带与龋病的发生和患者DMFT数的关系进而利用这些特征条带进行变形链球菌毒力株确定。本研究表明AP-PCR技术做为分子生物学现代技术可望应用于龋病的微生物分子流行病学、毒力株与非毒力株、基因分型的研究。
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基金项目：中山医科大学科研基金资助项目(1998年度)
作者简介：陈罕(1967-)，男，江苏扬州人，博士，讲师.
参考文献：
[1] Loesche W J. Role of Streptococcus mutans in human dental decay [J]. Microbiol Rev, 1986,50(1):353.
[2] de Soet J J, van Loveren C, Lammens A J, et al. Differences in cariogenicity between fresh isolates of Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans [J]. Caries Res, 1991,25(2):116.
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[3] Menard C,Mouton C.Randomly amplified polymorphic DNA analysis confirms the biotyping scheme of Porphyromonas gingivalis [J]. Res Microbiol, 1993,144(3):445.
[4] Li Y, Caufield P W. Arbitrarily primed polymerase chain reaction finger printing for the genotypic identification of mutans streptococci from humans [J]. Oral Microbiol Immunol, 1998,13(1):17.
收稿日期：2000-03-03, 百拇医药