基因重组乳链球菌防龋疫苗免疫性的实验研究
作者：凌均 汪喻忠 蒋少云
单位：湖北医科大学口腔医学院， 湖北 武汉 430079
关键词：DNA；重组；乳链球菌；龋病；预防和控制；疫苗；合成
中山医科大学学报000401
摘 要： 【目的】 测定基因重组乳链球菌防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性。【方法】 用基因重组乳链球菌(HL 107)、乳链球菌(LM 0230)、变形链球菌Ingbritt分别灌胃免疫实验动物BALB/c鼠，与未免疫组作对照，以酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清及唾液中的抗变形链球菌表面蛋白PAc的特异性IgG和IgA。【结果】 基因重组乳链球菌组血清中抗PAc-IgG水平明显高于乳链球菌组(P<0.01) 、变形链球菌组(P<0.05)和未免疫组(P<0.01)，唾液中重组乳链球菌组抗 PAc-IgA抗体水平明显高于乳链球菌组(P<0.01) 和未免疫组(P<0.01)，与变形链球菌组无差别(P>0.05)，血清IgA和唾液IgG的水平在4组中均无差别(P>0.05)。【结论】 基因重组乳链球菌具有变形链球菌表面蛋白的免疫原性，能够在BALB/c鼠中产生特异性免疫反应。
, http://www.100md.com
中图分类号：R783.1 文献标识码： A
文章编号：1000-257X(2000)04-0241-04
Experimental Study on the Immunity of Recombinant
Streptococcus Lactis Anticaries Vaccine
LING Jun-qi,JIANG Shao-yun
(College of Stomatology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510055)
WANG Yu-zhong
, 百拇医药
(College of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079, China)
Abstract: 【Objective】 To test the immunogenicity and immunoreactivity of recombinant S. lactis. 【Method】 The intragastric immunization was performed individually with gene recombinant S.lactis (HL 107), S.lactis (LM 0230) and S.mutans Ingbritt in BALB/c mice.Saliva and serum samples were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).【Result】 The recombinant S. lactis were more effective in inducing PAc-specific serum IgG antibodies in BALB/c mice than the other groups when given intragastrically(P<0.05). The level of PAc-specific salivary IgA in the group of recombinant S. lactis was higher than the other groups (P<0.01) except S. mutans Ingbritt (P>0.05). PAc-specific salivary IgG and PAc-specific serum IgA in all groups showed no difference (P>0.05). 【Conclusion】 The gene recombinant S. lactis possesses an immunogenicity of S. mutans surface protein antigen and induces specific immune response in BALB/c mice.
, http://www.100md.com
Key words:DNA, recombination; streptococcus lactis; caries/prevention & control; vaccines, synthetic
龋病是一种细菌感染性疾病，变形链球菌是主要的致病因子。目前认为免疫学防治是控制龋病的有效手段之一。应用分子生物学基因工程技术合成带有变形链球菌表面蛋白(PAc)的抗原结构基因(pac)的重组乳链球菌防龋疫苗，进行人工自动免疫，刺激机体产生免疫应答，从而提高抗龋能力的研究。本研究组已完成基因重组、克隆和重组体的分析鉴定等项工作[1～3]。为观察乳链球菌重组体的免疫原性和免疫反应性，本研究对实验动物 BALB/c鼠进行了基因重组乳链球菌防龋疫苗的灌胃免疫，并以酶联免疫吸附实验(ELISA)进行抗PAc的血清和唾液特异性IgG和IgA的测定。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 菌种与培养基
重组乳链球菌HL 107(pLF107)接种于含有5 mg/L红霉素的LM 17培养基中，30 ℃培养48 h。乳链球菌LM 0230，接种于LM 17培养基中，30 ℃培养48 h。变形链球菌Ingbritt，接种于LM 17培养基中，37 ℃厌氧培养48 h。
1.2 主要试剂
变形链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ冻干标准品(美国阿拉巴大学教授 Russell MW赠送)。羊抗鼠IgG、IgA，人IgG，碱性磷酸酶标记抗人IgG抗体，碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG皆为华美生物工程公司产品。
1.3 主要仪器设备
UV-265紫外分光光度计(日本岛津), 516MC微型ELISA自动检测仪(中国上海)。
, 百拇医药
1.4 聚苯乙烯酶标性能的检测
取1∶100人IgG 100 μL包被微量板凹孔后，每孔内加入1∶100碱性磷酸酶(AP)标记抗人IgG抗体结合物，37 ℃温育1 h，PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。加入100 μL 4-硝基酚磷酸盐(1 g/L)反应底物显色。分别测得每孔λ=405 nm时的吸光度值A405，相邻两孔间A405平均值与总平均值之差在0.007～0.121之间，即相邻两孔的吸光度值的平均值与总平均值的误差在0.5%～8.5%之间，即符合要求(误差在0%～10%之间，聚苯乙烯酶标板的性能达到要求)，表明此批聚苯乙烯酶标板固相吸附性能良好，误差较小。
1.5 重组乳链球菌的口腔免疫
活化重组乳链球菌HL 107(pLF107)、乳链球菌LM 0230，30 ℃培养48 h。活化变形链球菌Ingbritt，37 ℃厌氧培养48 h。使细胞生长约至8×108/mL(A600=1.0)。8 000 r/min(型号GS-15R，半径9 cm)离心10 min，弃上清。用0.5 mL 0.5%福尔马林悬浮沉淀细胞，制成细菌悬液。选8周龄雄性鼠40只，随机分为4组，每组10只，第1～3组分别免疫上述3种细菌，第4组为未免疫对照组。用插管针取细菌悬液对小鼠灌胃，剂量为0.5 mL/只，于第1周连续3 d，每天1次，4周后用同样的抗原进行加强免疫，第6周再免疫1次，第7周收集唾液和血液样本。每只小鼠腹腔注射0.5 mL (12.5 g/L) 巴比妥麻醉，同时腹腔注射0.4 mL硫酸毛果云香碱(2 g/L)，刺激唾液溢出，取唾液和血清标本，-20 ℃保存待测。
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取提纯的变形链球菌表面蛋白抗原冻干品溶于0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 9.6)中，将10 mg/L PAc抗原溶液加入聚苯乙烯微量酶标板孔中，每孔100 μL，置于4 ℃冰箱过夜，次日弃去孔内抗原包被液，每孔加入 300 μL PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。每微量孔加入3% BSA/PBST 200 μL，37 ℃温育90 min，弃去封闭液，PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。将待检大白鼠血清、唾液分别按1∶50、1∶20的比例用PBST稀释，混匀。每孔加样10 μL，每样本一式3份，37 ℃温育2 h，弃去孔内样本液，用PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。选择好二抗的工作浓度，用3% BSA/PBST稀释羊抗鼠IgG，使其终浓度为5 mg/L，用3% BSA/PBST稀释羊抗鼠IgA，使其工作浓度1∶1 000。每孔中加入羊抗鼠IgG、IgA 100 μL，4 ℃过夜。次日弃去孔内余液，用300 μL PBST洗涤5次，每次5 min，干燥。选择好三抗的工作浓度，用3% BSA/PBST稀释碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG，使其终浓度1∶10 000。每孔内加入100 μL的酶标兔抗羊IgG，37 ℃温育4 h，用300 μL PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。每孔内加入100 μL (1 g/L ) 4-硝基酚磷酸盐溶液(4-Nitrophenylphosphate)，37 ℃温育30 min，反应呈淡黄色。每孔加入50 μL H2SO4 (2 mol/L )终止反应，随后孔内颜色稍有加深。样本于λ=405 nm处测定光吸收值A405，计录实验结果，求每个样本三孔平均吸光值。
, 百拇医药
2 结 果
重组乳链球菌HL 107、乳链球菌LM 0230、变形链球菌Ingbritt免疫BALB/c鼠后唾液、血清抗体形成水平的ELISA分析，比较各实验组BALB/c鼠血清、唾液中抗PAc-IgG、PAc-IgA抗体形成水平情况。结果显示各实验组的血清中抗PAc-IgG抗体形成水平不同，F检验有显著性差异(F=18.331，P<0.01，如表1)，q检验两两比较结果显示：重组乳链球菌HL 107灌胃组血清抗PAc-IgG抗体水平明显高于乳链球菌组、变形链球菌组和未免疫组，有统计学意义(P值分别<0.01、<0.05、<0.01)。各实验组中血清抗PAc-IgA抗体水平有统计学差异(F=2.863，0.010.05)。各实验组唾液中抗PAc-IgA抗体水平比较结果显示有统计学差异(F=7.27，P<0.01，如表3)，q检验两两比较时重组乳链球菌HL 107组中抗PAc-IgA抗体水平明显高于未免疫组(P<0.01)、乳链球菌LM 0230组(P<0.01)，但与变形链球菌Inbrigtt组无差别(P>0.05)。唾液中抗PAc-IgG抗体水平比较4组均无差别(P>0.05，如表4)。
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表1 BALB/c鼠的血清中抗PAc特异性IgG反应
Table 1 Serum PAc-specific IgG responses in BALB/c mice(n=10) Immunogen
A405
F
P
S.lactis HL 107
1.225±0.120
S.lactis LM 0230
1.091±0.057
18.331
, 百拇医药
<0.01
S.mutans Ingbritt
1.339±0.122
None
1.085±0.043
表2 BALB/c鼠的血清中抗PAc特异性IgA反应
Table 2 Serum PAc-specific IgA responses in BALB/c mice(n=10) Immunogen
A405
F
P
, 百拇医药
S.lactis HL 107
0.066±0.026
S.lactis LM 0230
0.066±0.040
2.863
0.01
S.mutans Ingbritt
0.102±0.033
None
0.063±0.037
表3 BALB/c鼠的唾液中抗PAc特异性IgA反应
, 百拇医药
Table 3 Salivary PAc-specific IgA responses in BALB/c mice(n=10) Immunogen
A405
F
P
S.lactis HL 107
0.134±0.034
S.lactis LM 0230
0.076±0.029
7.27
<0.01
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S.mutans Ingbritt
0.105±0.032
None
0.074±0.038
表4 BALB/c鼠的唾液中抗PAc特异性IgG反应
Table 4 Salivary PAc-specific IgG responses in BALB/c mice(n=10) Immunogen
A405
F
P
S.lactis HL 107
, 百拇医药
0.038±0.028
S.lactis LM 0230
0.036±0.034
0.2557
>0.05
S.mutans Ingbritt
0.031±0.020
None
0.040±0.025
3 讨 论
3.1 龋病的免疫学防治
, 百拇医药
不论是发展中国家还是发达国家龋病都是最普遍、医疗耗资最高的疾病之一[4]。Lehner[5]认为一种有效的免疫应答能够影响龋病过程。由于口腔微环境及牙齿组织的特殊性，尽管在天然情况下人类本身具有对变形链球菌产生体液免疫和细胞免疫的潜能，然而这种免疫反应往往是无效的。因此，加强免疫学反应是目前口腔龋病防治的研究热点。现已普遍认同变形链球菌的表面蛋白介导其粘附牙面和自身聚集过程，国内外学者应用分子生物学和免疫学的成就开始了变形链球菌的免疫研究，包括变形链球菌表面蛋白抗原基因的克隆和序列分析、基因重组疫苗、合成肽疫苗和单克隆抗体的研究和应用[6～9]。基于乳链球菌的安全性，其已长期被用于生产日常产品如酸奶和奶酪，因此它是最适合用于生产口服疫苗的宿主菌之一。本课题旨在构建能生产变形链球菌表面蛋白的乳链球菌菌株，研制基因重组防龋疫苗。现已完成基因重组克隆和重组体的分析鉴定等工作，本实验利用酶联免疫吸附实验检测基因重组乳链球菌对实验动物的免疫原性和免疫反应性。
3.2 抗PAc-IgG、抗PAc-IgA ELISA检测结果与分析
, 百拇医药
免疫球蛋白G(IgG)是血清Ig的主要成分，占全部Ig的75%，为抗细菌、抗外毒素、抗病毒和抗真菌的重要抗体。虽然免疫球蛋白G在血清(1.25 g/L)、龈沟液(0.35 g/L)和唾液中均占一定比例[6]，但血液中的免疫球蛋白G主要是通过穿过龈沟上皮进入龈沟液中发挥作用来抑制变形链球菌在牙面的定居。在变形链球菌全细胞细胞壁、抗原Ⅰ/Ⅱ及葡糖基转移酶的人工自动免疫研究中，人们常以各种方法测定IgG的产生量，对疫苗的免疫原性及其所引起的免疫应答进行分析和评价[5,6,10]。分泌型IgA是唾液中的一种有效防止龋病的抗体成分，能抑制变形链球菌在牙面的粘附。Hajishengallis等[9]研究发现变形链球菌对羟基磷灰石的粘附能力被分泌型IgA抑制。Katz等[10]报告用抗原Ⅰ/Ⅱ和CTB鼻内免疫普通鼠和定菌鼠产生唾液免疫应答，可以防止变形链球菌的定居及龋病的形成。
本研究以抗体作为指标，测定BALB/c鼠血清及唾液中抗PAc-IgG、抗PAc-IgA水平，主要目的是观察基因重组乳链球菌免疫能否引起BALB/c鼠对变形链球菌表面蛋白抗原(PAc)的免疫应答反应。结果提示重组乳链球菌HL107组血清中IgG明显高于乳链球菌组(P<0.01)、变形链球菌组(P<0.05)和未免疫组(P<0.01)，同时重组乳链球菌组的唾液中抗PAc-IgA的水平明显高于乳链球菌组(P<0.01)和未免疫组(P<0.01)，与变形链球菌组产生同样的免疫反应(P>0.05)。而与龋病保护性免疫无关的血清IgA和唾液IgG的水平在4组中均无差别(P>0.05)。说明携带变形链球菌表面蛋白抗原基因的重组乳链球菌免疫BALB/c鼠后，BALB/c鼠产生了特异性免疫应答及免疫表达产物血清抗PAc-IgG和唾液抗PAc-IgA，提示重组乳链球菌可以作为一种新的免疫原用于龋病的免疫学预防。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39270720)
作者简介：凌均(1953-)，女，四川宜宾人，博士，教授，长期从事牙体牙髓病学、有关龋病病因及防治的研究工作，尤其是对变形链球菌等主要致龋菌进行了深入的分子生物学研究，发表有关研究论文30篇.
参考文献：
[1] 凌均，樊明文. 基因重组乳链球菌的研究Ⅰ：质粒的提取和纯化[J]. 口腔医学纵横, 1993, 9(4):195.
[2] 凌均，樊明文. 基因重组乳链球菌防龋疫苗的研究Ⅱ：变形链球菌结构基因重组质粒对乳链球菌的克隆[J]. 华西口腔医学杂志, 1994, 12(2):86.
[3] 凌均，樊明文. 变形链球菌pac基因在乳链球菌中的表达[J]. 中华口腔医学杂志, 1996,31(4):241.
, 百拇医药
[4] Michalek S M, Childer N K. Development and outlook for caries vaccine[J]. Crit Rev Oral Biol Med, 1990, 1(1):37.
[5] Lehner T. Immunology of dental caries, in immunology of oral disease[M]. 3rd ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1992. 68.
[6] Wu H Y, Russell M W. Induction of mucosal and systemic immune responses by intranasal immunization using recombinant cholera toxin B subunit as an adjuvant[J]. Vaccine, 1998,16(2-3):286.
, 百拇医药
[7] Okahashi N,Sasakawa C,Yoshikawa M,et al. Cloning of a surface protein antigen gene from serotype c streptococcus mutans[J]. Mol Microbiol, 1989, 3(2):221.
[8] Takahashi T, Matsushita K, Nisizawa T, et al. Genetic control of immune response in mice to synthetic peptides of a streptococcus mutans surface protein antigen[J]. Infect Immun, 1992, 60(2):623.
[9] Hajishengallis G, Nikolova E, Russell M W. Inhibition of streptococcus mutans adherence to salive-coated hydroxyapatite by human secretory immunoglobulin A antibodies to the cell surface protein antigenⅠ/Ⅱ: reversal by IgA 1 protease cleavage[J]. Infect Immun, 1992, 60(12): 5057.
[10] Katz J , Harmon C C , Buckner G P, et al. Protective salivary immunoglobulin A response against streptococcus mutans infection after intranasal immunization with S. mutans antigen coupled to the B subunit of cholera toxin[J]. Infect Immun,1993,61(5):1964.
收稿日期：1999-11-01, 百拇医药
单位：湖北医科大学口腔医学院， 湖北 武汉 430079
关键词：DNA；重组；乳链球菌；龋病；预防和控制；疫苗；合成
中山医科大学学报000401
摘 要： 【目的】 测定基因重组乳链球菌防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性。【方法】 用基因重组乳链球菌(HL 107)、乳链球菌(LM 0230)、变形链球菌Ingbritt分别灌胃免疫实验动物BALB/c鼠，与未免疫组作对照，以酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清及唾液中的抗变形链球菌表面蛋白PAc的特异性IgG和IgA。【结果】 基因重组乳链球菌组血清中抗PAc-IgG水平明显高于乳链球菌组(P<0.01) 、变形链球菌组(P<0.05)和未免疫组(P<0.01)，唾液中重组乳链球菌组抗 PAc-IgA抗体水平明显高于乳链球菌组(P<0.01) 和未免疫组(P<0.01)，与变形链球菌组无差别(P>0.05)，血清IgA和唾液IgG的水平在4组中均无差别(P>0.05)。【结论】 基因重组乳链球菌具有变形链球菌表面蛋白的免疫原性，能够在BALB/c鼠中产生特异性免疫反应。
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中图分类号：R783.1 文献标识码： A
文章编号：1000-257X(2000)04-0241-04
Experimental Study on the Immunity of Recombinant
Streptococcus Lactis Anticaries Vaccine
LING Jun-qi,JIANG Shao-yun
(College of Stomatology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510055)
WANG Yu-zhong
, 百拇医药
(College of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079, China)
Abstract: 【Objective】 To test the immunogenicity and immunoreactivity of recombinant S. lactis. 【Method】 The intragastric immunization was performed individually with gene recombinant S.lactis (HL 107), S.lactis (LM 0230) and S.mutans Ingbritt in BALB/c mice.Saliva and serum samples were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).【Result】 The recombinant S. lactis were more effective in inducing PAc-specific serum IgG antibodies in BALB/c mice than the other groups when given intragastrically(P<0.05). The level of PAc-specific salivary IgA in the group of recombinant S. lactis was higher than the other groups (P<0.01) except S. mutans Ingbritt (P>0.05). PAc-specific salivary IgG and PAc-specific serum IgA in all groups showed no difference (P>0.05). 【Conclusion】 The gene recombinant S. lactis possesses an immunogenicity of S. mutans surface protein antigen and induces specific immune response in BALB/c mice.
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Key words:DNA, recombination; streptococcus lactis; caries/prevention & control; vaccines, synthetic
龋病是一种细菌感染性疾病，变形链球菌是主要的致病因子。目前认为免疫学防治是控制龋病的有效手段之一。应用分子生物学基因工程技术合成带有变形链球菌表面蛋白(PAc)的抗原结构基因(pac)的重组乳链球菌防龋疫苗，进行人工自动免疫，刺激机体产生免疫应答，从而提高抗龋能力的研究。本研究组已完成基因重组、克隆和重组体的分析鉴定等项工作[1～3]。为观察乳链球菌重组体的免疫原性和免疫反应性，本研究对实验动物 BALB/c鼠进行了基因重组乳链球菌防龋疫苗的灌胃免疫，并以酶联免疫吸附实验(ELISA)进行抗PAc的血清和唾液特异性IgG和IgA的测定。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 菌种与培养基
重组乳链球菌HL 107(pLF107)接种于含有5 mg/L红霉素的LM 17培养基中，30 ℃培养48 h。乳链球菌LM 0230，接种于LM 17培养基中，30 ℃培养48 h。变形链球菌Ingbritt，接种于LM 17培养基中，37 ℃厌氧培养48 h。
1.2 主要试剂
变形链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ冻干标准品(美国阿拉巴大学教授 Russell MW赠送)。羊抗鼠IgG、IgA，人IgG，碱性磷酸酶标记抗人IgG抗体，碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG皆为华美生物工程公司产品。
1.3 主要仪器设备
UV-265紫外分光光度计(日本岛津), 516MC微型ELISA自动检测仪(中国上海)。
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1.4 聚苯乙烯酶标性能的检测
取1∶100人IgG 100 μL包被微量板凹孔后，每孔内加入1∶100碱性磷酸酶(AP)标记抗人IgG抗体结合物，37 ℃温育1 h，PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。加入100 μL 4-硝基酚磷酸盐(1 g/L)反应底物显色。分别测得每孔λ=405 nm时的吸光度值A405，相邻两孔间A405平均值与总平均值之差在0.007～0.121之间，即相邻两孔的吸光度值的平均值与总平均值的误差在0.5%～8.5%之间，即符合要求(误差在0%～10%之间，聚苯乙烯酶标板的性能达到要求)，表明此批聚苯乙烯酶标板固相吸附性能良好，误差较小。
1.5 重组乳链球菌的口腔免疫
活化重组乳链球菌HL 107(pLF107)、乳链球菌LM 0230，30 ℃培养48 h。活化变形链球菌Ingbritt，37 ℃厌氧培养48 h。使细胞生长约至8×108/mL(A600=1.0)。8 000 r/min(型号GS-15R，半径9 cm)离心10 min，弃上清。用0.5 mL 0.5%福尔马林悬浮沉淀细胞，制成细菌悬液。选8周龄雄性鼠40只，随机分为4组，每组10只，第1～3组分别免疫上述3种细菌，第4组为未免疫对照组。用插管针取细菌悬液对小鼠灌胃，剂量为0.5 mL/只，于第1周连续3 d，每天1次，4周后用同样的抗原进行加强免疫，第6周再免疫1次，第7周收集唾液和血液样本。每只小鼠腹腔注射0.5 mL (12.5 g/L) 巴比妥麻醉，同时腹腔注射0.4 mL硫酸毛果云香碱(2 g/L)，刺激唾液溢出，取唾液和血清标本，-20 ℃保存待测。
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取提纯的变形链球菌表面蛋白抗原冻干品溶于0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 9.6)中，将10 mg/L PAc抗原溶液加入聚苯乙烯微量酶标板孔中，每孔100 μL，置于4 ℃冰箱过夜，次日弃去孔内抗原包被液，每孔加入 300 μL PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。每微量孔加入3% BSA/PBST 200 μL，37 ℃温育90 min，弃去封闭液，PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。将待检大白鼠血清、唾液分别按1∶50、1∶20的比例用PBST稀释，混匀。每孔加样10 μL，每样本一式3份，37 ℃温育2 h，弃去孔内样本液，用PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。选择好二抗的工作浓度，用3% BSA/PBST稀释羊抗鼠IgG，使其终浓度为5 mg/L，用3% BSA/PBST稀释羊抗鼠IgA，使其工作浓度1∶1 000。每孔中加入羊抗鼠IgG、IgA 100 μL，4 ℃过夜。次日弃去孔内余液，用300 μL PBST洗涤5次，每次5 min，干燥。选择好三抗的工作浓度，用3% BSA/PBST稀释碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG，使其终浓度1∶10 000。每孔内加入100 μL的酶标兔抗羊IgG，37 ℃温育4 h，用300 μL PBST洗涤5次，每次3 min，干燥。每孔内加入100 μL (1 g/L ) 4-硝基酚磷酸盐溶液(4-Nitrophenylphosphate)，37 ℃温育30 min，反应呈淡黄色。每孔加入50 μL H2SO4 (2 mol/L )终止反应，随后孔内颜色稍有加深。样本于λ=405 nm处测定光吸收值A405，计录实验结果，求每个样本三孔平均吸光值。
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2 结 果
重组乳链球菌HL 107、乳链球菌LM 0230、变形链球菌Ingbritt免疫BALB/c鼠后唾液、血清抗体形成水平的ELISA分析，比较各实验组BALB/c鼠血清、唾液中抗PAc-IgG、PAc-IgA抗体形成水平情况。结果显示各实验组的血清中抗PAc-IgG抗体形成水平不同，F检验有显著性差异(F=18.331，P<0.01，如表1)，q检验两两比较结果显示：重组乳链球菌HL 107灌胃组血清抗PAc-IgG抗体水平明显高于乳链球菌组、变形链球菌组和未免疫组，有统计学意义(P值分别<0.01、<0.05、<0.01)。各实验组中血清抗PAc-IgA抗体水平有统计学差异(F=2.863，0.01
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表1 BALB/c鼠的血清中抗PAc特异性IgG反应
Table 1 Serum PAc-specific IgG responses in BALB/c mice(n=10) Immunogen
A405
F
P
S.lactis HL 107
1.225±0.120
S.lactis LM 0230
1.091±0.057
18.331
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<0.01
S.mutans Ingbritt
1.339±0.122
None
1.085±0.043
表2 BALB/c鼠的血清中抗PAc特异性IgA反应
Table 2 Serum PAc-specific IgA responses in BALB/c mice(n=10) Immunogen
A405
F
P
, 百拇医药
S.lactis HL 107
0.066±0.026
S.lactis LM 0230
0.066±0.040
2.863
0.01
S.mutans Ingbritt
0.102±0.033
None
0.063±0.037
表3 BALB/c鼠的唾液中抗PAc特异性IgA反应
, 百拇医药
Table 3 Salivary PAc-specific IgA responses in BALB/c mice(n=10) Immunogen
A405
F
P
S.lactis HL 107
0.134±0.034
S.lactis LM 0230
0.076±0.029
7.27
<0.01
, http://www.100md.com
S.mutans Ingbritt
0.105±0.032
None
0.074±0.038
表4 BALB/c鼠的唾液中抗PAc特异性IgG反应
Table 4 Salivary PAc-specific IgG responses in BALB/c mice(n=10) Immunogen
A405
F
P
S.lactis HL 107
, 百拇医药
0.038±0.028
S.lactis LM 0230
0.036±0.034
0.2557
>0.05
S.mutans Ingbritt
0.031±0.020
None
0.040±0.025
3 讨 论
3.1 龋病的免疫学防治
, 百拇医药
不论是发展中国家还是发达国家龋病都是最普遍、医疗耗资最高的疾病之一[4]。Lehner[5]认为一种有效的免疫应答能够影响龋病过程。由于口腔微环境及牙齿组织的特殊性，尽管在天然情况下人类本身具有对变形链球菌产生体液免疫和细胞免疫的潜能，然而这种免疫反应往往是无效的。因此，加强免疫学反应是目前口腔龋病防治的研究热点。现已普遍认同变形链球菌的表面蛋白介导其粘附牙面和自身聚集过程，国内外学者应用分子生物学和免疫学的成就开始了变形链球菌的免疫研究，包括变形链球菌表面蛋白抗原基因的克隆和序列分析、基因重组疫苗、合成肽疫苗和单克隆抗体的研究和应用[6～9]。基于乳链球菌的安全性，其已长期被用于生产日常产品如酸奶和奶酪，因此它是最适合用于生产口服疫苗的宿主菌之一。本课题旨在构建能生产变形链球菌表面蛋白的乳链球菌菌株，研制基因重组防龋疫苗。现已完成基因重组克隆和重组体的分析鉴定等工作，本实验利用酶联免疫吸附实验检测基因重组乳链球菌对实验动物的免疫原性和免疫反应性。
3.2 抗PAc-IgG、抗PAc-IgA ELISA检测结果与分析
, 百拇医药
免疫球蛋白G(IgG)是血清Ig的主要成分，占全部Ig的75%，为抗细菌、抗外毒素、抗病毒和抗真菌的重要抗体。虽然免疫球蛋白G在血清(1.25 g/L)、龈沟液(0.35 g/L)和唾液中均占一定比例[6]，但血液中的免疫球蛋白G主要是通过穿过龈沟上皮进入龈沟液中发挥作用来抑制变形链球菌在牙面的定居。在变形链球菌全细胞细胞壁、抗原Ⅰ/Ⅱ及葡糖基转移酶的人工自动免疫研究中，人们常以各种方法测定IgG的产生量，对疫苗的免疫原性及其所引起的免疫应答进行分析和评价[5,6,10]。分泌型IgA是唾液中的一种有效防止龋病的抗体成分，能抑制变形链球菌在牙面的粘附。Hajishengallis等[9]研究发现变形链球菌对羟基磷灰石的粘附能力被分泌型IgA抑制。Katz等[10]报告用抗原Ⅰ/Ⅱ和CTB鼻内免疫普通鼠和定菌鼠产生唾液免疫应答，可以防止变形链球菌的定居及龋病的形成。
本研究以抗体作为指标，测定BALB/c鼠血清及唾液中抗PAc-IgG、抗PAc-IgA水平，主要目的是观察基因重组乳链球菌免疫能否引起BALB/c鼠对变形链球菌表面蛋白抗原(PAc)的免疫应答反应。结果提示重组乳链球菌HL107组血清中IgG明显高于乳链球菌组(P<0.01)、变形链球菌组(P<0.05)和未免疫组(P<0.01)，同时重组乳链球菌组的唾液中抗PAc-IgA的水平明显高于乳链球菌组(P<0.01)和未免疫组(P<0.01)，与变形链球菌组产生同样的免疫反应(P>0.05)。而与龋病保护性免疫无关的血清IgA和唾液IgG的水平在4组中均无差别(P>0.05)。说明携带变形链球菌表面蛋白抗原基因的重组乳链球菌免疫BALB/c鼠后，BALB/c鼠产生了特异性免疫应答及免疫表达产物血清抗PAc-IgG和唾液抗PAc-IgA，提示重组乳链球菌可以作为一种新的免疫原用于龋病的免疫学预防。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39270720)
作者简介：凌均(1953-)，女，四川宜宾人，博士，教授，长期从事牙体牙髓病学、有关龋病病因及防治的研究工作，尤其是对变形链球菌等主要致龋菌进行了深入的分子生物学研究，发表有关研究论文30篇.
参考文献：
[1] 凌均，樊明文. 基因重组乳链球菌的研究Ⅰ：质粒的提取和纯化[J]. 口腔医学纵横, 1993, 9(4):195.
[2] 凌均，樊明文. 基因重组乳链球菌防龋疫苗的研究Ⅱ：变形链球菌结构基因重组质粒对乳链球菌的克隆[J]. 华西口腔医学杂志, 1994, 12(2):86.
[3] 凌均，樊明文. 变形链球菌pac基因在乳链球菌中的表达[J]. 中华口腔医学杂志, 1996,31(4):241.
, 百拇医药
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[5] Lehner T. Immunology of dental caries, in immunology of oral disease[M]. 3rd ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1992. 68.
[6] Wu H Y, Russell M W. Induction of mucosal and systemic immune responses by intranasal immunization using recombinant cholera toxin B subunit as an adjuvant[J]. Vaccine, 1998,16(2-3):286.
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[7] Okahashi N,Sasakawa C,Yoshikawa M,et al. Cloning of a surface protein antigen gene from serotype c streptococcus mutans[J]. Mol Microbiol, 1989, 3(2):221.
[8] Takahashi T, Matsushita K, Nisizawa T, et al. Genetic control of immune response in mice to synthetic peptides of a streptococcus mutans surface protein antigen[J]. Infect Immun, 1992, 60(2):623.
[9] Hajishengallis G, Nikolova E, Russell M W. Inhibition of streptococcus mutans adherence to salive-coated hydroxyapatite by human secretory immunoglobulin A antibodies to the cell surface protein antigenⅠ/Ⅱ: reversal by IgA 1 protease cleavage[J]. Infect Immun, 1992, 60(12): 5057.
[10] Katz J , Harmon C C , Buckner G P, et al. Protective salivary immunoglobulin A response against streptococcus mutans infection after intranasal immunization with S. mutans antigen coupled to the B subunit of cholera toxin[J]. Infect Immun,1993,61(5):1964.
收稿日期：1999-11-01, 百拇医药