热化疗对人体结肠癌LoVo细胞中一氧化氮含量的影响
作者：卜淑芳 侯宝华 卿三华
单位：卜淑芳(郑州市中心医院内科 郑州 450007)；侯宝华 卿三华(第一军医大学南方医院普外科 广州 510515)
关键词：一氧化氮；LoVo细胞；热化疗
河南医科大学学报000116摘 要：目的：探讨热化疗对人结肠癌LoVo细胞株中一氧化氮(NO)含量的影响及其作用机制。方法：实验分为对照组，单纯加热组、单纯化疗组及热化疗组，处理后用铜-镉还原法测定各级培养基中的NO含量。结果：对照组NO含量(45.91±16.12) μmol/L，明显低于热化疗组(91.31±24.30) μmol/L和单纯加热组(67.67±15.48)μmol/L，P值分别<0.01及<0.05；热化疗组和单纯加热组明显高于单纯化疗组(47.03±16.03)μmol/L，P值分别<0.01及<0.05；热化疗组高于单纯加热组(P<0.05)；单纯化疗组高于对照组，但无统计学意义。结论：在肿瘤的热化疗中，热疗联合化疗和单纯加热能明显地增加LoVo细胞所致高浓度的NO，单纯化疗也可以增加NO浓度，其机制可能是这些因素激活肿瘤细胞内NO合成酶(NOS)产生过高浓度的NO，产生细胞毒作用。这可能将成为热化疗肿瘤的机制之一。
, 百拇医药
中图分类号：R735.35；R730.53
Effect of nitric oxide on LoVo cells after hyperthermia combined with MMC
BU Shufang
(Department of Internal Medicine, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou 450007)
HOU Baohua QING Sanhua
(Department of General Surgery, Nanfang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510515)
, 百拇医药
Abstract：Aim： To study the effect of nitric oxide (NO) on LoVo cells after hyperthermia combined with MMC and their mechanisms. Methods: The levels of NO were determined in cell culture medium of LoVo cells by Cu-Cd reduction method.Results: The levels of NO in control (45.9±16.12) μmol/L group were lower than those in chemohyperthermy(92.3±24.30) μmol/L and hyperthermia (67.67±15.48)μmol/L group (P<0.01，P<0.05 respectively). Levels of NO in chemohyperthermy and hyperthermia groups were higher than those in chemotherapy(47.03±16.32)μmol/L(P<0.01，P<0.05 respcevtively). The levels of NO in chemo-hyperthermy group were higher than those in hyperthermia group(P<0.05)， and those in chemotherapy group higher than in control group but without statistical significance.Conclusion: Chemohyperthermy and hyperthermia could remarkably enhance the levels of NO produced by LoVo cells. NO levels could also be enhanced by chemotherapy. It could be concluded that Nitric Oxide Synthase (NOS) in tumor cells might be activated by hyperthermia, chemohyperthermy and chemotherapy, and increased NO level which induced cytotoxic reaction. This may be one of the mechanisms of treatment with chemohyperthermy.
, 百拇医药
Key words：nitric oxide; LoVo cell; chemohyperthermy▲
一氧化氮(Nitric Oxide, NO)是一种分子小、结构简单而不稳定的自由基气体，NO对许多肿瘤细胞和微生物有细胞毒性[1]。进一步研究表明，许多肿瘤细胞中同样存在NO合成酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)[2]。为探讨NO与结肠癌热化疗的关系，作者用铜-镉还原法对LoVo细胞在体外进行热疗联合丝裂毒素C(MMC)化疗时其培养液中的NO含量进行测定，探讨热化疗对结肠癌细胞中NO含量的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 人结肠癌LoVo细胞株，由第一军医大学病理学教研室提供。LoVo细胞悬于含体积分数为20%的新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所生产)的细胞培养液[RPMI1640(GIBCO产品)，含青霉素100 IU/ml和链霉素100 IU/ml]中，37℃，体积分数为5%的CO2培养箱培养。
, 百拇医药
1.2 细胞处理 将细胞接种到24孔培养板(1×105/孔)中培养，在对数生长期时分组处理。①正常对照组：在孵箱中常规培养，不作任何处理。②单纯化疗组：MMC浓度为0.01 g/L，在37 ℃孵箱中培养。③单纯热疗组：在43 ℃(精度±0.5 ℃)电热恒温水浴箱作用30 min，然后移至37 ℃孵箱中继续培养。④热疗联合化疗组：MMC为0.01 g/L，加热和加热后处理方法同单纯加热组。
1.3 标本收集 细胞处理24 h后收集培养液，1 000 r/min，离心5 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存待测。
1.4 NO检测 采用铜-镉还原法测定NO含量。第一步：去蛋白，0.3 ml样品+1/20体积(0.015 ml)300 g/L的ZnSO4，离心(5 000 r/min,5～10 min)，取上清液0.25 ml+等体积50 g/L的NH4Cl(pH 9.0)充分混合(去ZnSO4),离心(3 000r/min,5min)。第二步：过柱(NO-3→NO-2)，取上清液0.5 ml过柱，0.5 g/L的NH4CI(pH 9.0)为洗脱液，弃去最初流出的1.5 ml液体，收集随后流出的2.5 ml洗脱液待比色。两样品之间过柱至少5 ml需用洗脱液冲洗。第三步：比色，2.5 ml洗脱液+1 ml Griess试剂，室温放置10 min后与纯洗脱液+Greiss试剂为空白对照，用分光光度计在540 nm波长处进行比色。第四步：制备标准曲线，将硝酸钠(NaNO3)配制成1～100 μmol/L的标准液，分别取0.5 ml按以上步骤操作，绘制标准曲线。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 样本均数间均采用非配对t检验。
2 结果
2.1 各组培养液NO含量比较 见表1。
表1 各组培养液NO含量比较 组别
n
c(NO)/(μmol.L-1)
对照组(1组)
15
45.91±16.12
单纯热疗组(2组)
15
, 百拇医药
67.67±15.48△
单纯化疗组(3组)
15
47.03±16.32
热疗联合化疗组(4组)
15
92.31±24.30*△
与1组比较*P<0.05；与3组比较△P<0.05；2组与4组比较P<0.05
单纯加热组和热化疗组NO的含量分别高于对照组、单纯化疗组；热化疗组NO的含量高于单纯加热组，且差异均有显著性。
, 百拇医药 3 讨论
NO是由L-精氨酸在NOS的作用下产生的。一般将NOS分成神经元型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱生型(iNOS)。其中nNOS和eNOS依赖于Ca2+/CaM，不受内毒素等诱导，统称为原生型酶(cNOS)，而iNOS不依赖于Ca2+/CaM，可由内毒素、细胞因子等诱导产生[3]。Jenkins等[4]检测出人结肠腺癌细胞株有iNOS表达。肿瘤中产生的NO根据其生成量的高低而具有双重作用，一方面，持续适当浓度(pmol或fmol水平)的NO生成，有利于肿瘤的生长，其原因可能是NO在这些肿瘤细胞信号传导途径中起作用，调节细胞增殖相关基因的表达，同时增加肿瘤血供和促进肿瘤血管生成；另一方面，肿瘤中产生高浓度(nmol水平)的NO，对肿瘤本身也是一种损害，因此具有细胞毒作用。本研究结果显示热化疗组和单纯加热组NO含量明显高于对照组(P<0.05)及单纯化疗组(P<0.05)，热化疗组高于单纯加热组(P<0.05)。结果表明，热化疗和热疗能明显提高LoVo细胞NO产量，其作用机制可能是这些因素激活肿瘤细胞内NOS，催化形成过高浓度的NO，产生细胞毒作用，这可能将成为热化疗治疗肿瘤的机制之一。热化疗组高于单纯化疗组和单纯加热组且具有统计学意义，说明在激活肿瘤细胞表达iNOS产生高水平的NO进而表现出细胞毒作用，热疗与化疗联合应用的协同作用明显强于单纯热疗和单纯化疗。
, 百拇医药
MMC是抗生素类的抗癌药物，除了常规的细胞毒作用外，还可作为血流调节剂。Sagar等[2]研究发现MMC在杀伤肿瘤的最小剂量时，能明显改变所有肿瘤的血流，故认为化学药物可能通过尚未认识的机制调节肿瘤血流，NO在其中可能起一定的作用。本实验单纯化疗(MMC)组NO含量低于热化疗组和单纯加热组(P<0.05)，其机制有待进一步研究。■
作者简介：卜淑芳，女，34岁，大学本科，主治医师，研究方向：消化道肿瘤的化疗
参考文献：
[1]Jenkins DC, Charles IG, Thomesn LL, et al. Roles of nitric oxide in tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92(10)：4 392
[2]Sagar SM, Singh G, Hodson DI, et al. Nitric oxide and anticancer therapy. Cancer Treat Rev,1995，21:159
, 百拇医药
[3]Nunokawa Y, Ishida S. Promoter analysis of human inducible nitric oxide synthase gene associated with cardiovascular homesotasis. Biochem Biphys Res Commun, 1994， 200:802
[4]Jenkins DC, Charles IG, Baylis SA, et al. Human colon cancer cell generation lines show a divers pattem of nitric oxide synthase gene expression and nitric oxide. Br J Cancer， 1994，70:847
(1999-03-01收稿), http://www.100md.com
单位：卜淑芳(郑州市中心医院内科 郑州 450007)；侯宝华 卿三华(第一军医大学南方医院普外科 广州 510515)
关键词：一氧化氮；LoVo细胞；热化疗
河南医科大学学报000116摘 要：目的：探讨热化疗对人结肠癌LoVo细胞株中一氧化氮(NO)含量的影响及其作用机制。方法：实验分为对照组，单纯加热组、单纯化疗组及热化疗组，处理后用铜-镉还原法测定各级培养基中的NO含量。结果：对照组NO含量(45.91±16.12) μmol/L，明显低于热化疗组(91.31±24.30) μmol/L和单纯加热组(67.67±15.48)μmol/L，P值分别<0.01及<0.05；热化疗组和单纯加热组明显高于单纯化疗组(47.03±16.03)μmol/L，P值分别<0.01及<0.05；热化疗组高于单纯加热组(P<0.05)；单纯化疗组高于对照组，但无统计学意义。结论：在肿瘤的热化疗中，热疗联合化疗和单纯加热能明显地增加LoVo细胞所致高浓度的NO，单纯化疗也可以增加NO浓度，其机制可能是这些因素激活肿瘤细胞内NO合成酶(NOS)产生过高浓度的NO，产生细胞毒作用。这可能将成为热化疗肿瘤的机制之一。
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中图分类号：R735.35；R730.53
Effect of nitric oxide on LoVo cells after hyperthermia combined with MMC
BU Shufang
(Department of Internal Medicine, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou 450007)
HOU Baohua QING Sanhua
(Department of General Surgery, Nanfang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510515)
, 百拇医药
Abstract：Aim： To study the effect of nitric oxide (NO) on LoVo cells after hyperthermia combined with MMC and their mechanisms. Methods: The levels of NO were determined in cell culture medium of LoVo cells by Cu-Cd reduction method.Results: The levels of NO in control (45.9±16.12) μmol/L group were lower than those in chemohyperthermy(92.3±24.30) μmol/L and hyperthermia (67.67±15.48)μmol/L group (P<0.01，P<0.05 respectively). Levels of NO in chemohyperthermy and hyperthermia groups were higher than those in chemotherapy(47.03±16.32)μmol/L(P<0.01，P<0.05 respcevtively). The levels of NO in chemo-hyperthermy group were higher than those in hyperthermia group(P<0.05)， and those in chemotherapy group higher than in control group but without statistical significance.Conclusion: Chemohyperthermy and hyperthermia could remarkably enhance the levels of NO produced by LoVo cells. NO levels could also be enhanced by chemotherapy. It could be concluded that Nitric Oxide Synthase (NOS) in tumor cells might be activated by hyperthermia, chemohyperthermy and chemotherapy, and increased NO level which induced cytotoxic reaction. This may be one of the mechanisms of treatment with chemohyperthermy.
, 百拇医药
Key words：nitric oxide; LoVo cell; chemohyperthermy▲
一氧化氮(Nitric Oxide, NO)是一种分子小、结构简单而不稳定的自由基气体，NO对许多肿瘤细胞和微生物有细胞毒性[1]。进一步研究表明，许多肿瘤细胞中同样存在NO合成酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)[2]。为探讨NO与结肠癌热化疗的关系，作者用铜-镉还原法对LoVo细胞在体外进行热疗联合丝裂毒素C(MMC)化疗时其培养液中的NO含量进行测定，探讨热化疗对结肠癌细胞中NO含量的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 人结肠癌LoVo细胞株，由第一军医大学病理学教研室提供。LoVo细胞悬于含体积分数为20%的新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所生产)的细胞培养液[RPMI1640(GIBCO产品)，含青霉素100 IU/ml和链霉素100 IU/ml]中，37℃，体积分数为5%的CO2培养箱培养。
, 百拇医药
1.2 细胞处理 将细胞接种到24孔培养板(1×105/孔)中培养，在对数生长期时分组处理。①正常对照组：在孵箱中常规培养，不作任何处理。②单纯化疗组：MMC浓度为0.01 g/L，在37 ℃孵箱中培养。③单纯热疗组：在43 ℃(精度±0.5 ℃)电热恒温水浴箱作用30 min，然后移至37 ℃孵箱中继续培养。④热疗联合化疗组：MMC为0.01 g/L，加热和加热后处理方法同单纯加热组。
1.3 标本收集 细胞处理24 h后收集培养液，1 000 r/min，离心5 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存待测。
1.4 NO检测 采用铜-镉还原法测定NO含量。第一步：去蛋白，0.3 ml样品+1/20体积(0.015 ml)300 g/L的ZnSO4，离心(5 000 r/min,5～10 min)，取上清液0.25 ml+等体积50 g/L的NH4Cl(pH 9.0)充分混合(去ZnSO4),离心(3 000r/min,5min)。第二步：过柱(NO-3→NO-2)，取上清液0.5 ml过柱，0.5 g/L的NH4CI(pH 9.0)为洗脱液，弃去最初流出的1.5 ml液体，收集随后流出的2.5 ml洗脱液待比色。两样品之间过柱至少5 ml需用洗脱液冲洗。第三步：比色，2.5 ml洗脱液+1 ml Griess试剂，室温放置10 min后与纯洗脱液+Greiss试剂为空白对照，用分光光度计在540 nm波长处进行比色。第四步：制备标准曲线，将硝酸钠(NaNO3)配制成1～100 μmol/L的标准液，分别取0.5 ml按以上步骤操作，绘制标准曲线。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 样本均数间均采用非配对t检验。
2 结果
2.1 各组培养液NO含量比较 见表1。
表1 各组培养液NO含量比较 组别
n
c(NO)/(μmol.L-1)
对照组(1组)
15
45.91±16.12
单纯热疗组(2组)
15
, 百拇医药
67.67±15.48△
单纯化疗组(3组)
15
47.03±16.32
热疗联合化疗组(4组)
15
92.31±24.30*△
与1组比较*P<0.05；与3组比较△P<0.05；2组与4组比较P<0.05
单纯加热组和热化疗组NO的含量分别高于对照组、单纯化疗组；热化疗组NO的含量高于单纯加热组，且差异均有显著性。
, 百拇医药 3 讨论
NO是由L-精氨酸在NOS的作用下产生的。一般将NOS分成神经元型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱生型(iNOS)。其中nNOS和eNOS依赖于Ca2+/CaM，不受内毒素等诱导，统称为原生型酶(cNOS)，而iNOS不依赖于Ca2+/CaM，可由内毒素、细胞因子等诱导产生[3]。Jenkins等[4]检测出人结肠腺癌细胞株有iNOS表达。肿瘤中产生的NO根据其生成量的高低而具有双重作用，一方面，持续适当浓度(pmol或fmol水平)的NO生成，有利于肿瘤的生长，其原因可能是NO在这些肿瘤细胞信号传导途径中起作用，调节细胞增殖相关基因的表达，同时增加肿瘤血供和促进肿瘤血管生成；另一方面，肿瘤中产生高浓度(nmol水平)的NO，对肿瘤本身也是一种损害，因此具有细胞毒作用。本研究结果显示热化疗组和单纯加热组NO含量明显高于对照组(P<0.05)及单纯化疗组(P<0.05)，热化疗组高于单纯加热组(P<0.05)。结果表明，热化疗和热疗能明显提高LoVo细胞NO产量，其作用机制可能是这些因素激活肿瘤细胞内NOS，催化形成过高浓度的NO，产生细胞毒作用，这可能将成为热化疗治疗肿瘤的机制之一。热化疗组高于单纯化疗组和单纯加热组且具有统计学意义，说明在激活肿瘤细胞表达iNOS产生高水平的NO进而表现出细胞毒作用，热疗与化疗联合应用的协同作用明显强于单纯热疗和单纯化疗。
, 百拇医药
MMC是抗生素类的抗癌药物，除了常规的细胞毒作用外，还可作为血流调节剂。Sagar等[2]研究发现MMC在杀伤肿瘤的最小剂量时，能明显改变所有肿瘤的血流，故认为化学药物可能通过尚未认识的机制调节肿瘤血流，NO在其中可能起一定的作用。本实验单纯化疗(MMC)组NO含量低于热化疗组和单纯加热组(P<0.05)，其机制有待进一步研究。■
作者简介：卜淑芳，女，34岁，大学本科，主治医师，研究方向：消化道肿瘤的化疗
参考文献：
[1]Jenkins DC, Charles IG, Thomesn LL, et al. Roles of nitric oxide in tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92(10)：4 392
[2]Sagar SM, Singh G, Hodson DI, et al. Nitric oxide and anticancer therapy. Cancer Treat Rev,1995，21:159
, 百拇医药
[3]Nunokawa Y, Ishida S. Promoter analysis of human inducible nitric oxide synthase gene associated with cardiovascular homesotasis. Biochem Biphys Res Commun, 1994， 200:802
[4]Jenkins DC, Charles IG, Baylis SA, et al. Human colon cancer cell generation lines show a divers pattem of nitric oxide synthase gene expression and nitric oxide. Br J Cancer， 1994，70:847
(1999-03-01收稿), http://www.100md.com