经交链孢酚处理胎儿食管上皮组织中EGFr、Rb基因的扩增*
作者：单杰 侯卫红 贺西章 安玉会 赵勤 李江滨
单位：单杰 侯卫红 安玉会 赵勤 李江滨(河南医科大学生物化学教研室 郑州 450052)；贺西章(巩义市人民医院检验科 巩义 451250)
关键词：食管；交链孢酚；癌基因；基因，抑制，肿瘤；基因扩增；胎儿
河南医科大学学报000113摘 要：目的：探讨互隔交链孢霉诱导食管癌的发生机制。方法：用交链孢酚(AOH)体外处理不同时间(24h, 1周和3周)胎儿食管上皮组织，提取该组织的DNA，从10例食管癌组织及10例癌旁组织中分别提取DNA，设正常胎儿食管上皮DNA为对照。EcoRI酶切,Southern转移，与EGFr癌基因，Rb抗癌基因探针杂交。结果:正常对照组中 EGFr、Rb无扩增及丢失；AOH诱导24 h的胎儿食管上皮中即有EGFr癌基因的扩增，并一直持续到第3周;而 AOH诱导24 h，1周和3周的胎儿食管上皮未发现抗癌基因Rb的丢失；食管癌组织中有2例EGFr扩增(2/10)， 2例Rb完全缺失和部分丢失(2/10)，癌旁组织中有4例EGFr扩增(4/10)，Rb无任何缺失(0/10)。结论:AOH激活了 EGFr癌基因, EGFr癌基因的激活可能是食管上皮癌变的启动性变化， Rb抗癌基因的丢失在 AOH诱导的食管癌发生中可能是一种较晚期的改变。
, 百拇医药
中图分类号：R329.28
EGFr and Rb gene amplification in fetal esophageal epithelium treated by alternariol
SHAN Jie HOU Weihong AN Yuhui ZHAO Qin LI Jiangbin
(Department of Biochemistry, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
HE Xizhang
(Clinical Laboratory, Gongyi hospital, Gongyi 451250)
Abstract：Aim: To study the mechanism of esophageal cancer induced by alternariol (AOH). Methods: DNA was extracted from the human fetal esophagus (HFE) treated with AOH for 24 hours,1 week and 3 weeks in vitro. As controls, DNA from normal HFE, and DNA from esophageal carcinoma tissues, “normal” epithelium tissue near carcinoma region were extracted respectively. DNA samples were digested with EcoRI enzyme and subjected to Southern blotting ,and hybridized with EGFr and Rb genes probed . Results: There was amplification of EGFr gene in HFE induced by AOH in 24 hours, and the amplification continues to the third week.There were not any deletion of Rb gene in HFE treated with AOH for 24 hours in the first week and the third week. Among 10 esophageal cancer tissues, there were amplification of EGFr gene in 2 cases,and complete or partial deletion of Rb gene in 2 cases and in 10 “normal” epithelium tissues near carcinoma region were found amplification of EGFr gene in 4 cases,no deletion of Rb gene. Conclusion: AOH could activate EGFr. The activation of EGFr gene is probably the initiated change in the canceration course of esophageal epithelium, and the inactivation of Rb anti-oncogene might be involved as late event in esophageal carcinogenesis.
, 百拇医药
Key words：esophagus; alternariol;oncogenes; genes, suppressor, tumor; gene amplication▲
对河南林县食管癌发生的流行病学研究证实：霉菌及其代谢毒素与肿瘤的发生有密切关系[1]。互隔交链孢霉是从林县粮食作物中分离出的一株优势污染菌，交链孢酚 (alternariol,AOH)是互隔交链孢霉的主要代谢产物之一。用 AOH处理胎儿食管上皮组织，可诱导食管上皮乳头状增生和鳞癌，激活胎儿食管上皮组织中 H-ras癌基因[1]。作者用AOH体外诱导人胎儿食管上皮组织，观察诱导不同时间的上皮组织中 EGFr癌基因和 Rb抗癌基因的改变，以期从癌基因和抗癌基因的角度探讨 AOH与食管癌的内在关系。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 AOH：从林县粮食中分离的互隔交链孢霉培养物中分离提纯。
1.1.2 胎儿食管上皮：取自6 h内正常中期妊娠水囊引产胎儿，共43例。由河南医科大学第一附属医院提供。
1.1.3 原发性食管癌组织及癌旁组织收集:原发性食管癌10例(取自河南医科大学第二附属医院手术切除的新鲜肿瘤组织)，同时收集了 10例经病理诊断的同组患者的癌旁“正常”组织。
1.2 方法
1.2.1 胎儿食管上皮组织的培养及AOH的处理:将胎儿食管粘膜剪成长2 mm的小块置于平皿内，加含体积分数为10%新生牛血清的Mc×5A完全培养液，于 37 ℃培养12～24 h，更换新鲜培养基。实验组加AOH终浓度为10 mg/ L继续培养，分别于24 h、1周和3周收集上皮组织块，用PBS洗2遍，置液氮保存。
, 百拇医药
1.2.2 DNA提取及纯度测定：将上述用AOH处理的胎儿食管上皮组织、食管癌和癌旁组织，按J.Sambrook的方法，提取DNA[2],测D(260 nm)/D(280 nm)比值均在1.80～1.90之间。
1.2.3 基因探针的制备：从大肠杆菌中提取PUC12,含人EGFr基因768 bp EcoRI插入片段的质粒。PGEM3.8含人Rb基因3.8 kb cDNA插入片段的质粒，分别用EcoRI酶切，电泳分离 768 bp， 3.8 kb的插入片段。用电洗脱收集目的基因片段，用α-32PdCTP作缺口翻译标记探针，探针放射比活性约为每μg DNA 1×10 min-1，PUC12由美国哥伦比亚大学Dr.Weinstein惠赠。Rb基因克隆由美国Dr.W H Lee惠赠。
1.2.4 Southern blot分析：样品 DNA经EcoRI酶切，在8 g/L琼脂糖中电泳，按Southern法印迹转移到Hybond-c膜上,固定，按Wahl法杂交[3]。55 ℃条件下洗膜 ，用Fuji X光胶片作放射自显影，-70 ℃冰箱爆光,时间依放射性强度而定。而后显影、定影、结果分析。
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2 结果
2.1 AOH处理的胎儿食管上皮组织和原发性食管癌组织中EGFr癌基因的扩增 样品 DNA用 EcoRI酶切后，与32P标记的768 bp EGFr探针杂交，显示出8.2，5.6，4.3和3.7 kb 4条不同的杂交带。密度扫描分析发现，AOH诱导24 h，1周和3周的胎儿食管上皮组织、食管癌组织(2/10)和癌旁“正常”组织(4/10)与正常对照组相比均有不同程度的 EGFr癌基因的扩增,扩增倍数在2.7～6.4倍之间。
2.2 AOH处理胎儿食管上皮组织和原发性食管癌组织中Rb抗癌基因的丢失 AOH诱导不同时间的胎儿食管上皮组织DNA，用限制性内切酶HindIII消化，与Rb抗癌基因3.8 kb片段探针杂交，同时用正常胎儿食管上皮DNA作对照，结果发现：AOH诱导的24h，1周和3周的胎儿食管上皮组织中未见任一区带的Rb基因丢失，而10例食管癌组织中有2例Rb基因完全丢失和部分丢失。
, http://www.100md.com
3 讨论
EGFr的相对分子质量为170000，是横跨细胞膜内外的单链多肽，细胞外部分能与其配体 EGFr和TGFα结合，细胞内部分有酪氨酸激酶活性。EGFr与其配体结合后，能激活细胞内酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶能磷酸化EGFr本身及细胞内蛋白质的酪氨酸残基，起着细胞生长信号的转导作用，从而调节细胞生长和分化。作者用AOH处理24 h的胎儿食管上皮组织中发现有EGFr基因的扩增，表明EGFr基因的改变是一种启动期的改变，推测这种改变可能与AOH诱导DNA结构的改变有关。由于EGFr基因扩增一直持续到3周后，并在食管癌及癌旁组织中发现有EGFr癌基因的扩增，因而与肿瘤的进展也有一定的关系。日本上田政和等人[4]研究结果表明EGFr的高表达与食管癌患者的生存率(高表达组低于低表达组，P<0.05)，淋巴结转移率(高表达组大于低表达组)密切相关，即高表达组将预后不良。从上述观察及分析可以看出，今后从术前活体组织检查中测定EGFr癌基因的扩增情况，对食管癌的早期诊断，决定手术治疗计划和判定预后有重要作用。
, 百拇医药
Rb基因是第一个分离克隆的抗癌基因，研究发现Rb基因的失活、丢失、突变与视网膜母细胞瘤及膀胱癌等有密切关系，Boynton等[5]利用PCR-EFLP分析，发现54%的食管鳞癌和36%的食管腺癌有 Rb基因的杂合性丢失，这些结果表明， Rb基因的丢失，失活可能参与了食管癌的病理形成和发展过程。作者用Southern blot杂交的方法发现了10例食管癌病人中有2例Rb抗癌基因的丢失。而AOH诱导24 h，1周和3周的胎儿食管上皮组织DNA中未发现Rb抗癌基因的丢失，表明这种改变可能发生于肿瘤形成的相对晚期。
以上结果表明，肿瘤的发生是一个涉及癌基因激活和抗癌基因丢失的多步骤发展过程，原癌基因的激活又和环境制癌物的作用密切相关。此实验直接从分子水平阐明了交链孢酚引起食管癌变的机制，也为食管癌的互隔交链孢霉病因提供了有力的证据。■
*河南省自然科学基金资助项目 964022700
, 百拇医药
作者简介：单杰，女，42岁，硕士，副教授，研究方向：肿瘤分子生物学，E-mail:ShanJie@163.net
参考文献：
[1]刘桂亭，钱玉珍，杨红艳，等.交链孢酚诱发人胚食管上皮癌的研究.河南医科大学学报,1990,5(2):115
[2]Sambrook J，Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning.Vol.2.2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 14
[3]Wahl GH，Stern M,Stark GR. Efficient transfer of large DNA fragments from agare gels to diazobenzyloxymethyl paper and rapid hybridization by using dexran sulfate.Proc Natl Acad Sci，1996,76:3 683
[4]陈志峰.判断食管癌预后的新因子.国外医学.肿癌学分册，1992,19(5):303
[5]Boynton RF. Frequent loss of heterozygosity at the retinoblastoma locus in human esophageal cancers. Cancer Res,1996,51(20):5776
(1998-05-20收稿), http://www.100md.com
单位：单杰 侯卫红 安玉会 赵勤 李江滨(河南医科大学生物化学教研室 郑州 450052)；贺西章(巩义市人民医院检验科 巩义 451250)
关键词：食管；交链孢酚；癌基因；基因，抑制，肿瘤；基因扩增；胎儿
河南医科大学学报000113摘 要：目的：探讨互隔交链孢霉诱导食管癌的发生机制。方法：用交链孢酚(AOH)体外处理不同时间(24h, 1周和3周)胎儿食管上皮组织，提取该组织的DNA，从10例食管癌组织及10例癌旁组织中分别提取DNA，设正常胎儿食管上皮DNA为对照。EcoRI酶切,Southern转移，与EGFr癌基因，Rb抗癌基因探针杂交。结果:正常对照组中 EGFr、Rb无扩增及丢失；AOH诱导24 h的胎儿食管上皮中即有EGFr癌基因的扩增，并一直持续到第3周;而 AOH诱导24 h，1周和3周的胎儿食管上皮未发现抗癌基因Rb的丢失；食管癌组织中有2例EGFr扩增(2/10)， 2例Rb完全缺失和部分丢失(2/10)，癌旁组织中有4例EGFr扩增(4/10)，Rb无任何缺失(0/10)。结论:AOH激活了 EGFr癌基因, EGFr癌基因的激活可能是食管上皮癌变的启动性变化， Rb抗癌基因的丢失在 AOH诱导的食管癌发生中可能是一种较晚期的改变。
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中图分类号：R329.28
EGFr and Rb gene amplification in fetal esophageal epithelium treated by alternariol
SHAN Jie HOU Weihong AN Yuhui ZHAO Qin LI Jiangbin
(Department of Biochemistry, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
HE Xizhang
(Clinical Laboratory, Gongyi hospital, Gongyi 451250)
Abstract：Aim: To study the mechanism of esophageal cancer induced by alternariol (AOH). Methods: DNA was extracted from the human fetal esophagus (HFE) treated with AOH for 24 hours,1 week and 3 weeks in vitro. As controls, DNA from normal HFE, and DNA from esophageal carcinoma tissues, “normal” epithelium tissue near carcinoma region were extracted respectively. DNA samples were digested with EcoRI enzyme and subjected to Southern blotting ,and hybridized with EGFr and Rb genes probed . Results: There was amplification of EGFr gene in HFE induced by AOH in 24 hours, and the amplification continues to the third week.There were not any deletion of Rb gene in HFE treated with AOH for 24 hours in the first week and the third week. Among 10 esophageal cancer tissues, there were amplification of EGFr gene in 2 cases,and complete or partial deletion of Rb gene in 2 cases and in 10 “normal” epithelium tissues near carcinoma region were found amplification of EGFr gene in 4 cases,no deletion of Rb gene. Conclusion: AOH could activate EGFr. The activation of EGFr gene is probably the initiated change in the canceration course of esophageal epithelium, and the inactivation of Rb anti-oncogene might be involved as late event in esophageal carcinogenesis.
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Key words：esophagus; alternariol;oncogenes; genes, suppressor, tumor; gene amplication▲
对河南林县食管癌发生的流行病学研究证实：霉菌及其代谢毒素与肿瘤的发生有密切关系[1]。互隔交链孢霉是从林县粮食作物中分离出的一株优势污染菌，交链孢酚 (alternariol,AOH)是互隔交链孢霉的主要代谢产物之一。用 AOH处理胎儿食管上皮组织，可诱导食管上皮乳头状增生和鳞癌，激活胎儿食管上皮组织中 H-ras癌基因[1]。作者用AOH体外诱导人胎儿食管上皮组织，观察诱导不同时间的上皮组织中 EGFr癌基因和 Rb抗癌基因的改变，以期从癌基因和抗癌基因的角度探讨 AOH与食管癌的内在关系。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 AOH：从林县粮食中分离的互隔交链孢霉培养物中分离提纯。
1.1.2 胎儿食管上皮：取自6 h内正常中期妊娠水囊引产胎儿，共43例。由河南医科大学第一附属医院提供。
1.1.3 原发性食管癌组织及癌旁组织收集:原发性食管癌10例(取自河南医科大学第二附属医院手术切除的新鲜肿瘤组织)，同时收集了 10例经病理诊断的同组患者的癌旁“正常”组织。
1.2 方法
1.2.1 胎儿食管上皮组织的培养及AOH的处理:将胎儿食管粘膜剪成长2 mm的小块置于平皿内，加含体积分数为10%新生牛血清的Mc×5A完全培养液，于 37 ℃培养12～24 h，更换新鲜培养基。实验组加AOH终浓度为10 mg/ L继续培养，分别于24 h、1周和3周收集上皮组织块，用PBS洗2遍，置液氮保存。
, 百拇医药
1.2.2 DNA提取及纯度测定：将上述用AOH处理的胎儿食管上皮组织、食管癌和癌旁组织，按J.Sambrook的方法，提取DNA[2],测D(260 nm)/D(280 nm)比值均在1.80～1.90之间。
1.2.3 基因探针的制备：从大肠杆菌中提取PUC12,含人EGFr基因768 bp EcoRI插入片段的质粒。PGEM3.8含人Rb基因3.8 kb cDNA插入片段的质粒，分别用EcoRI酶切，电泳分离 768 bp， 3.8 kb的插入片段。用电洗脱收集目的基因片段，用α-32PdCTP作缺口翻译标记探针，探针放射比活性约为每μg DNA 1×10 min-1，PUC12由美国哥伦比亚大学Dr.Weinstein惠赠。Rb基因克隆由美国Dr.W H Lee惠赠。
1.2.4 Southern blot分析：样品 DNA经EcoRI酶切，在8 g/L琼脂糖中电泳，按Southern法印迹转移到Hybond-c膜上,固定，按Wahl法杂交[3]。55 ℃条件下洗膜 ，用Fuji X光胶片作放射自显影，-70 ℃冰箱爆光,时间依放射性强度而定。而后显影、定影、结果分析。
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2 结果
2.1 AOH处理的胎儿食管上皮组织和原发性食管癌组织中EGFr癌基因的扩增 样品 DNA用 EcoRI酶切后，与32P标记的768 bp EGFr探针杂交，显示出8.2，5.6，4.3和3.7 kb 4条不同的杂交带。密度扫描分析发现，AOH诱导24 h，1周和3周的胎儿食管上皮组织、食管癌组织(2/10)和癌旁“正常”组织(4/10)与正常对照组相比均有不同程度的 EGFr癌基因的扩增,扩增倍数在2.7～6.4倍之间。
2.2 AOH处理胎儿食管上皮组织和原发性食管癌组织中Rb抗癌基因的丢失 AOH诱导不同时间的胎儿食管上皮组织DNA，用限制性内切酶HindIII消化，与Rb抗癌基因3.8 kb片段探针杂交，同时用正常胎儿食管上皮DNA作对照，结果发现：AOH诱导的24h，1周和3周的胎儿食管上皮组织中未见任一区带的Rb基因丢失，而10例食管癌组织中有2例Rb基因完全丢失和部分丢失。
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3 讨论
EGFr的相对分子质量为170000，是横跨细胞膜内外的单链多肽，细胞外部分能与其配体 EGFr和TGFα结合，细胞内部分有酪氨酸激酶活性。EGFr与其配体结合后，能激活细胞内酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶能磷酸化EGFr本身及细胞内蛋白质的酪氨酸残基，起着细胞生长信号的转导作用，从而调节细胞生长和分化。作者用AOH处理24 h的胎儿食管上皮组织中发现有EGFr基因的扩增，表明EGFr基因的改变是一种启动期的改变，推测这种改变可能与AOH诱导DNA结构的改变有关。由于EGFr基因扩增一直持续到3周后，并在食管癌及癌旁组织中发现有EGFr癌基因的扩增，因而与肿瘤的进展也有一定的关系。日本上田政和等人[4]研究结果表明EGFr的高表达与食管癌患者的生存率(高表达组低于低表达组，P<0.05)，淋巴结转移率(高表达组大于低表达组)密切相关，即高表达组将预后不良。从上述观察及分析可以看出，今后从术前活体组织检查中测定EGFr癌基因的扩增情况，对食管癌的早期诊断，决定手术治疗计划和判定预后有重要作用。
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Rb基因是第一个分离克隆的抗癌基因，研究发现Rb基因的失活、丢失、突变与视网膜母细胞瘤及膀胱癌等有密切关系，Boynton等[5]利用PCR-EFLP分析，发现54%的食管鳞癌和36%的食管腺癌有 Rb基因的杂合性丢失，这些结果表明， Rb基因的丢失，失活可能参与了食管癌的病理形成和发展过程。作者用Southern blot杂交的方法发现了10例食管癌病人中有2例Rb抗癌基因的丢失。而AOH诱导24 h，1周和3周的胎儿食管上皮组织DNA中未发现Rb抗癌基因的丢失，表明这种改变可能发生于肿瘤形成的相对晚期。
以上结果表明，肿瘤的发生是一个涉及癌基因激活和抗癌基因丢失的多步骤发展过程，原癌基因的激活又和环境制癌物的作用密切相关。此实验直接从分子水平阐明了交链孢酚引起食管癌变的机制，也为食管癌的互隔交链孢霉病因提供了有力的证据。■
*河南省自然科学基金资助项目 964022700
, 百拇医药
作者简介：单杰，女，42岁，硕士，副教授，研究方向：肿瘤分子生物学，E-mail:ShanJie@163.net
参考文献：
[1]刘桂亭，钱玉珍，杨红艳，等.交链孢酚诱发人胚食管上皮癌的研究.河南医科大学学报,1990,5(2):115
[2]Sambrook J，Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning.Vol.2.2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 14
[3]Wahl GH，Stern M,Stark GR. Efficient transfer of large DNA fragments from agare gels to diazobenzyloxymethyl paper and rapid hybridization by using dexran sulfate.Proc Natl Acad Sci，1996,76:3 683
[4]陈志峰.判断食管癌预后的新因子.国外医学.肿癌学分册，1992,19(5):303
[5]Boynton RF. Frequent loss of heterozygosity at the retinoblastoma locus in human esophageal cancers. Cancer Res,1996,51(20):5776
(1998-05-20收稿), http://www.100md.com