HLA-DR基因分型中三种DNA提取法的比较*
作者：曹孟德 秦东春 苏堤 岳保红 王东升 燕桂香 苏天水
单位：曹孟德 苏堤 王东升(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州 450052)；秦东春 岳保红 燕桂香 苏天水(河南医科大学第一附属医院检验科 郑州 450052)
关键词：HLA-DR基因分型；DNA提取法；酚-氯仿抽提法；NP-40法；快速盐析法
河南医科大学学报000139摘 要：目的:寻找简便快速的HLA-DR基因分型方法。方法：比较了标准酚-氯仿抽提法、NP-40法及快速盐析法抽提DNA对HLA-DR基因分型的影响。结果：3种方法抽提的DNA含量、纯度、琼脂糖凝胶电泳结果及用于HLA-DR基因分型的效果无差异，但酚-氯仿抽提法抽提DNA所需时间比NP-40法及快速盐析法长。结论：NP-40法及快速盐析法可作为HLA-DR快速基因分型时提取DNA的方法。
, 百拇医药
中图分类号:R617▲
Comparison among three procedures for extracting DNA used in HLA-DR genotyping
CAO Mengde SU Di WANG Dongsheng
(Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
QIN Dongchun YUE Baohong YAN Guixiang SU Tianshui
(Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
, 百拇医药
Abstract：Aim：To establish a simple and rapid method for HLA-DR genotyping.Methods:Two kinds of rapid DNA extraction procedures(NP-40 method and salting out method) were compared to the standard phenol-chloroform extraction in 25 blood samples.Results:NP-40 method and the salting out method were simple, rapid DNA extraction procedures. The DNA quality obtained by the two methods was comparable to that obtained by phenol-chloroform extraction technique. The DNAs extracted by three methods have been successfully used for HLA-DR genotyping and the results were completely concordant.Conclusion:The DNAs obtained by the NP-40 method and the rapid salting out method is suitable for clinical practice.
, 百拇医药
Key words：HLA-DR genotyping； DNA extraction； phenol-chloroform extraction；NP-40 method；salting out method▲
HLA的研究在器官移植配型、疾病相关性探讨、法医鉴定及人类学等领域具有广泛的应用价值，对HLA多态性的检测为这些领域的发展提供了可靠的技术方法和有价值的资料，在医学实践和科研活动中有着重要的意义。HLA基因分型能直接在DNA水平对HLA基因多态性进行分析，能检出血清学无法检出的型别，但是在HLA基因分型过程中，DNA提取的质量、纯度及速度是影响分型结果的准确性及临床应用的主要因素之一。为此，作者在建立序列特异性引物聚合酶链反应方法(PCR-SSP)用于快速HLA-DR基因分型时，对采用标准酚-氯仿法、NP-40法及快速盐析法抽提样本模板DNA对基因分型的影响，进行了同步对比研究，现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1. 1 材料
1.1.1 样本来源及处理：以25份全血为研究标本。采集静脉血4 ml，EDTA抗凝，离心(1 500 r/min)5 min后用毛细管吸取白细胞层，加20 ml红细胞裂解液，洗3次备用。
1.1.2 主要试剂：SDS，蛋白酶K，NP-40，重蒸饱和酚，乙醇，Tris, 琼脂糖,Taq酶，dNTPs。
1.1.3 主要仪器：DNA Thermal Cycler PCR III扩增仪，PE公司；TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；DYY-III6B型电泳仪，电泳槽，北京六一仪器厂。
1. 2 方法
1.2.1 引物的设计与合成：HLA-DRB1序列特异性引物的设计参照文献[1，2]，由中国科学院上海植物生理研究所贝克曼*PMG生物技术联合示范实验室合成，共24个，其中阳性对照引物一对。
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1.2.2 DNA的提取：
1.2.2.1 标准酚-氯仿抽提法：备用白细胞的一半加入1.4 ml白细胞核裂解液、120 μl 100 g/L SDS和蛋白酶K(终浓度250 mg/L),37 ℃消化过夜。加等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合物(体积比为25:24:1)和氯仿、异戊醇混合物(体积比为24:1)各抽提1次，留水相，加入1/10体积的3 mol/L 醋酸钠和2～2.5倍体积的冰无水乙醇,-20 ℃或-80 ℃沉淀2 h,再用体积分数为70% 的冰乙醇洗1次,自然干燥，100μl TE缓冲液溶解,4℃冰箱贮存备用。
1.2.2.2 快速盐析法：参照Miller等[3]的方法改进。上述备用白细胞的另一半加1 ml白细胞核裂解液,80μl100 g/L SDS和蛋白酶K(终浓度400 mg/L),56 ℃恒温水浴消化1h后,加入6 mol/L NaCl 300 μl 剧烈振荡15～30 s,离心(10 000 r/min)10 min,吸取上清液0.8～1.0 ml加入冰无水乙醇2 ml,上下颠倒数次至絮状DNA沉淀析出,挑出DNA放入体积分数为70%的冰乙醇洗1次,自然干燥,100 μl TE缓冲液溶解,4℃冰箱贮存备用。
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1.2.2.3 NP-40法：根据John等[4]报道的NP-40法，进行部分改进。取1mlEDTA抗凝血加1ml 溶液A(10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L KCl,10mmol/L MgCl2)及40μl NP-40混匀，1 500 r/min离心10min弃上清，加200μl溶液B(10mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L KCl,10 mmol/L MgCl2,0.5 mol/LNaCl,5 g/L SDS,2 mmol/L EDTA)悬浮沉淀后，加160 μl饱和重蒸酚混悬6 min，12 000 r/min 离心1 min，取上清加等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合物(体积比为25:24:1)和氯仿、异戊醇混合物(体积比为24:1)各抽提1次，留水相，加入1/10体积的3 mol/L 醋酸钠和2～2.5倍体积的冰无水乙醇,-20 ℃或-80 ℃沉淀2 h,再用体积分数为70%的冰乙醇洗1次,自然干燥,100 μl TE缓冲液溶解,4 ℃冰箱贮存备用。
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1.2.3 PCR-SSP基因分型：PCR反应管中反应体系为50 μl，含有模板DNA 50～100 ng，Taq DNA聚合酶1.5 U，dNTP各200 μmol，特异性引物1 μmol,阳性对照引物0.2 μmol。反应条件为：94 ℃，60 s；65 ℃，60 s；72 ℃，60 s。共25个循环，然后72 ℃延伸7 min。
1.2.4 扩增产物的检测：取10 μl加有载样缓冲液的PCR扩增产物加样至含有溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶中，在电压5～10 V/cm下电泳30 min后，在紫外透射仪上观察结果。
1.2.5 统计学处理：对3种方法的均值进行方差分析比较。
2 结果
2.1 DNA提取的结果及纯度测定 用3种DNA提取法所得的25份样本模板DNA经紫外分光光度法测定260 nm/280 nm的吸光度(A)值比率，酚-氯仿法为1.8～2.0,快速盐析法和NP-40法为1.7～2.0。DNA的含量因样本中有核细胞数量的多寡而有差异，但同一份样本用3种方法提取的DNA含量及纯度十分接近，其均数比较所得P值均大于0.05；此外，经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析发现，3种方法所提取的DNA带型整齐，无明显降解。
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2.2 HLA-DR基因分型结果 采用PCR-SSP基因分型方法，同时、同条件对3种方法制备的25份样本模板DNA进行HLA-DR基因分型，所得特异性产物条带及分型结果完全一致，重复率及成功率均达100%。
2.3 3种方法制备DNA耗时比较 通常情况下，酚-氯仿法耗时20～24 h，快速盐析法1.5 h，NP-40法2.5 h，可见后2种方法较酚-氯仿法耗时短。
3 讨论
分子生物学技术的应用使得DNA水平的HLA研究发展尤为迅速，多种DNA分型方法已相继建立，大大促进了基因分型技术在基础研究及临床上的广泛应用。常规的基因分型技术因模板DNA的提取及PCR扩增后的处理耗时太长，难以完全适合于临床分析。酚-氯仿法是最常用、最可靠的DNA提取方法之一，所得DNA纯度高，可满足各种检测技术的要求，但操作繁琐、耗时长；重蒸饱和酚处理复杂，易造成污染且有毒，影响了临床应用。有资料显示，常规的快速抽提法，如煮沸法、煮沸消化法，所获得的DNA用于仅相差几个碱基的HLA等位基因分型绝大多数难以成功[5]。作者对Miller等报道的盐析法和John等报道 NP-40法进行了改进，同酚-氯仿法相比，耗时大大缩短，操作极为简便，试剂方便易得，方法稳定可靠。试验结果显示，本研究中3种方法对于相同量的同一标本所提取的DNA量、纯度、完整性及用于HLA-DR基因分型的结果是一致的。因此，快速盐析法及NP-40法同酚-氯仿法一样，可用于人体各种样本有核细胞DNA的提取，所得DNA的质量可满足临床快速HLA-DR基因分型及所有血液DNA分子生物学科研、检测的需要。■
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*河南省科技攻关基金资助项目 971200277
作者简介：曹孟德，男，35岁，博士，副教授，研究方向：HLA及肿瘤免疫学
参考文献：
[1]Marsh SGE, Bodmer JG.HLA class II nucleotide sequences. Tissue Antigens,1992,39:229
[2]Olerup O, Zetterquist H.HLA-DR typing by PCR-amplification with sequences-specific primers in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens,1992,39:225
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[3]Miller S, Dykes D, Polesky H. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res,1988,16:1215
[4]John SWM, Weitzner G, Rozen R,et al. A rapid procedure for extracting genomic DNA from leukocytes. Nucleic Acid Res,1991,19(2):408
[5]谭建明，谢桐，徐琴君，等.快速盐析法提取DNA在HLA基因分型中的应用.中华器官移植杂志,1996,17:9
(1999-04-25收稿), http://www.100md.com
单位：曹孟德 苏堤 王东升(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州 450052)；秦东春 岳保红 燕桂香 苏天水(河南医科大学第一附属医院检验科 郑州 450052)
关键词：HLA-DR基因分型；DNA提取法；酚-氯仿抽提法；NP-40法；快速盐析法
河南医科大学学报000139摘 要：目的:寻找简便快速的HLA-DR基因分型方法。方法：比较了标准酚-氯仿抽提法、NP-40法及快速盐析法抽提DNA对HLA-DR基因分型的影响。结果：3种方法抽提的DNA含量、纯度、琼脂糖凝胶电泳结果及用于HLA-DR基因分型的效果无差异，但酚-氯仿抽提法抽提DNA所需时间比NP-40法及快速盐析法长。结论：NP-40法及快速盐析法可作为HLA-DR快速基因分型时提取DNA的方法。
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中图分类号:R617▲
Comparison among three procedures for extracting DNA used in HLA-DR genotyping
CAO Mengde SU Di WANG Dongsheng
(Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
QIN Dongchun YUE Baohong YAN Guixiang SU Tianshui
(Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
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Abstract：Aim：To establish a simple and rapid method for HLA-DR genotyping.Methods:Two kinds of rapid DNA extraction procedures(NP-40 method and salting out method) were compared to the standard phenol-chloroform extraction in 25 blood samples.Results:NP-40 method and the salting out method were simple, rapid DNA extraction procedures. The DNA quality obtained by the two methods was comparable to that obtained by phenol-chloroform extraction technique. The DNAs extracted by three methods have been successfully used for HLA-DR genotyping and the results were completely concordant.Conclusion:The DNAs obtained by the NP-40 method and the rapid salting out method is suitable for clinical practice.
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HLA的研究在器官移植配型、疾病相关性探讨、法医鉴定及人类学等领域具有广泛的应用价值，对HLA多态性的检测为这些领域的发展提供了可靠的技术方法和有价值的资料，在医学实践和科研活动中有着重要的意义。HLA基因分型能直接在DNA水平对HLA基因多态性进行分析，能检出血清学无法检出的型别，但是在HLA基因分型过程中，DNA提取的质量、纯度及速度是影响分型结果的准确性及临床应用的主要因素之一。为此，作者在建立序列特异性引物聚合酶链反应方法(PCR-SSP)用于快速HLA-DR基因分型时，对采用标准酚-氯仿法、NP-40法及快速盐析法抽提样本模板DNA对基因分型的影响，进行了同步对比研究，现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
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1. 1 材料
1.1.1 样本来源及处理：以25份全血为研究标本。采集静脉血4 ml，EDTA抗凝，离心(1 500 r/min)5 min后用毛细管吸取白细胞层，加20 ml红细胞裂解液，洗3次备用。
1.1.2 主要试剂：SDS，蛋白酶K，NP-40，重蒸饱和酚，乙醇，Tris, 琼脂糖,Taq酶，dNTPs。
1.1.3 主要仪器：DNA Thermal Cycler PCR III扩增仪，PE公司；TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；DYY-III6B型电泳仪，电泳槽，北京六一仪器厂。
1. 2 方法
1.2.1 引物的设计与合成：HLA-DRB1序列特异性引物的设计参照文献[1，2]，由中国科学院上海植物生理研究所贝克曼*PMG生物技术联合示范实验室合成，共24个，其中阳性对照引物一对。
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1.2.2 DNA的提取：
1.2.2.1 标准酚-氯仿抽提法：备用白细胞的一半加入1.4 ml白细胞核裂解液、120 μl 100 g/L SDS和蛋白酶K(终浓度250 mg/L),37 ℃消化过夜。加等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合物(体积比为25:24:1)和氯仿、异戊醇混合物(体积比为24:1)各抽提1次，留水相，加入1/10体积的3 mol/L 醋酸钠和2～2.5倍体积的冰无水乙醇,-20 ℃或-80 ℃沉淀2 h,再用体积分数为70% 的冰乙醇洗1次,自然干燥，100μl TE缓冲液溶解,4℃冰箱贮存备用。
1.2.2.2 快速盐析法：参照Miller等[3]的方法改进。上述备用白细胞的另一半加1 ml白细胞核裂解液,80μl100 g/L SDS和蛋白酶K(终浓度400 mg/L),56 ℃恒温水浴消化1h后,加入6 mol/L NaCl 300 μl 剧烈振荡15～30 s,离心(10 000 r/min)10 min,吸取上清液0.8～1.0 ml加入冰无水乙醇2 ml,上下颠倒数次至絮状DNA沉淀析出,挑出DNA放入体积分数为70%的冰乙醇洗1次,自然干燥,100 μl TE缓冲液溶解,4℃冰箱贮存备用。
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1.2.2.3 NP-40法：根据John等[4]报道的NP-40法，进行部分改进。取1mlEDTA抗凝血加1ml 溶液A(10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L KCl,10mmol/L MgCl2)及40μl NP-40混匀，1 500 r/min离心10min弃上清，加200μl溶液B(10mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L KCl,10 mmol/L MgCl2,0.5 mol/LNaCl,5 g/L SDS,2 mmol/L EDTA)悬浮沉淀后，加160 μl饱和重蒸酚混悬6 min，12 000 r/min 离心1 min，取上清加等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合物(体积比为25:24:1)和氯仿、异戊醇混合物(体积比为24:1)各抽提1次，留水相，加入1/10体积的3 mol/L 醋酸钠和2～2.5倍体积的冰无水乙醇,-20 ℃或-80 ℃沉淀2 h,再用体积分数为70%的冰乙醇洗1次,自然干燥,100 μl TE缓冲液溶解,4 ℃冰箱贮存备用。
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1.2.3 PCR-SSP基因分型：PCR反应管中反应体系为50 μl，含有模板DNA 50～100 ng，Taq DNA聚合酶1.5 U，dNTP各200 μmol，特异性引物1 μmol,阳性对照引物0.2 μmol。反应条件为：94 ℃，60 s；65 ℃，60 s；72 ℃，60 s。共25个循环，然后72 ℃延伸7 min。
1.2.4 扩增产物的检测：取10 μl加有载样缓冲液的PCR扩增产物加样至含有溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶中，在电压5～10 V/cm下电泳30 min后，在紫外透射仪上观察结果。
1.2.5 统计学处理：对3种方法的均值进行方差分析比较。
2 结果
2.1 DNA提取的结果及纯度测定 用3种DNA提取法所得的25份样本模板DNA经紫外分光光度法测定260 nm/280 nm的吸光度(A)值比率，酚-氯仿法为1.8～2.0,快速盐析法和NP-40法为1.7～2.0。DNA的含量因样本中有核细胞数量的多寡而有差异，但同一份样本用3种方法提取的DNA含量及纯度十分接近，其均数比较所得P值均大于0.05；此外，经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析发现，3种方法所提取的DNA带型整齐，无明显降解。
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2.2 HLA-DR基因分型结果 采用PCR-SSP基因分型方法，同时、同条件对3种方法制备的25份样本模板DNA进行HLA-DR基因分型，所得特异性产物条带及分型结果完全一致，重复率及成功率均达100%。
2.3 3种方法制备DNA耗时比较 通常情况下，酚-氯仿法耗时20～24 h，快速盐析法1.5 h，NP-40法2.5 h，可见后2种方法较酚-氯仿法耗时短。
3 讨论
分子生物学技术的应用使得DNA水平的HLA研究发展尤为迅速，多种DNA分型方法已相继建立，大大促进了基因分型技术在基础研究及临床上的广泛应用。常规的基因分型技术因模板DNA的提取及PCR扩增后的处理耗时太长，难以完全适合于临床分析。酚-氯仿法是最常用、最可靠的DNA提取方法之一，所得DNA纯度高，可满足各种检测技术的要求，但操作繁琐、耗时长；重蒸饱和酚处理复杂，易造成污染且有毒，影响了临床应用。有资料显示，常规的快速抽提法，如煮沸法、煮沸消化法，所获得的DNA用于仅相差几个碱基的HLA等位基因分型绝大多数难以成功[5]。作者对Miller等报道的盐析法和John等报道 NP-40法进行了改进，同酚-氯仿法相比，耗时大大缩短，操作极为简便，试剂方便易得，方法稳定可靠。试验结果显示，本研究中3种方法对于相同量的同一标本所提取的DNA量、纯度、完整性及用于HLA-DR基因分型的结果是一致的。因此，快速盐析法及NP-40法同酚-氯仿法一样，可用于人体各种样本有核细胞DNA的提取，所得DNA的质量可满足临床快速HLA-DR基因分型及所有血液DNA分子生物学科研、检测的需要。■
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作者简介：曹孟德，男，35岁，博士，副教授，研究方向：HLA及肿瘤免疫学
参考文献：
[1]Marsh SGE, Bodmer JG.HLA class II nucleotide sequences. Tissue Antigens,1992,39:229
[2]Olerup O, Zetterquist H.HLA-DR typing by PCR-amplification with sequences-specific primers in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens,1992,39:225
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[3]Miller S, Dykes D, Polesky H. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res,1988,16:1215
[4]John SWM, Weitzner G, Rozen R,et al. A rapid procedure for extracting genomic DNA from leukocytes. Nucleic Acid Res,1991,19(2):408
[5]谭建明，谢桐，徐琴君，等.快速盐析法提取DNA在HLA基因分型中的应用.中华器官移植杂志,1996,17:9
(1999-04-25收稿), http://www.100md.com