3种mRNA检测方法比较
作者：李珊珊 任秀花 闫爱华 方伟岗
单位：李珊珊(河南医科大学第一附属医院病理科,河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州450052)；方伟岗(北京医科大学病理系 北京 100083)；闫爱华 任秀花(河南医科大学癌前期研究室 郑州 450052)
关键词：Northern；blot；RT-PCR；原位杂交；mRNA
河南医科大学学报000208
摘 要：目的：比较3种检测mRNA表达的方法。方法：采用Nothern blot，RT-PCR，原位杂交法检测基因mRNA的表达。结果及结论：在使用Nothern blot杂交进行定量分析时，关键因素有：①RNA的质量；②探针标记效率；③洗膜的控制。RT-PCR检测很难用于定量分析。原位杂交法可进行细胞内mRNA的定位分析但不能确定mRNA的绝对含量。将这些方法结合使用，可全面了解基因mRNA的表达。
, 百拇医药
分类号：R73.74
Comparing three methods for detection of mRNA expressions
LI Shanshan
(Department of Pathology,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
REN Xiuhua,YAN Aihua
(Department of Precancerous Studies,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FANG Weigang
, http://www.100md.com
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083)
Abstract：Aim:To compare three methods for detecting expressions of a gene mRNA.Methods:Northern blot,RT-PCR,in situ hybridization were used for examining expressions of a gene mRNA.Results and Conclusion:The key issues in using Nothern blot for quantitative analysis are high quality RNA,efficiency of marked probe and control of washing membrane.RT-PCR is no suitable for quantitative analysis.In situ hybridization may be used for the located analysis of mRNA in a cell,but no confirmation for absolute content of mRNA in a cell.Overall information of mRNA expressions may be obtained by combination of these methods.
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Key words：Northern blot;RT-PCR;in situ hybridization;mRNA▲
检测某种基因的表达，了解该基因的功能，在肿瘤研究中是非常重要且常用的。基因表达的检测主要涉及到两个水平——mRNA水平和蛋白水平。mRNA水平检测，最常用的方法有Nothern blot杂交、逆转录-PCR以及原位杂交，这3种方法在研究基因表达的调控、基因的功能以及遗传变异等方面应用十分广泛，也是目前肿瘤研究中常用的分子生物学手段。作者在以往的研究工作中3种技术均涉及到，现将它们的特点及作者的一些体会介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系：人肺癌细胞系PG，PAa；人前列腺癌细胞系PC3M，PC3，采用体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基。人黑色素瘤细胞系WM35，WM1341b,WM983a,WM451，采用含体积分数15%小牛血清的RPMI 1640培养基。于37 ℃，体积分数5%CO2及恒定湿度条件下培养。以上细胞由北京医科大学病理系提供。
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1.1.2 组织标本：食管癌手术切除标本，来自河南医科大学第一附属医院及河南省肿瘤医院，组织学检查为鳞状细胞癌。
1.2 细胞总RNA的提取 取对数生长期细胞，经预冷的PBS洗，按每瓶(100 ml)细胞加入溶液D 1 ml(4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠，5 g/L十二烷基肌氨酸钠，0.1 mol/L α-巯基乙醇)，使之与细胞充分混匀，彻底裂解细胞。再依次加入0.1 ml 2 mol/L乙酸钠(pH 4.0)，混匀，1 ml水饱和酚，0.2 ml氯仿-异戊醇(体积比49∶1)，混匀并振荡，冰浴15 min。12 000 r/min离心20 min。取水相，加入等体积异丙醇，-20 ℃过夜。12 000 r/min再离心20 min，弃上清，沉淀溶于0.3 ml溶液D，加入等体积异丙醇置-20 ℃再沉淀1 h，离心弃上清，沉淀经体积分数75%乙醇洗，将沉淀(含RNA)溶于DEPC水，-70 ℃保存备用。RNA定量：取适当稀释的RNA样品，分别在紫外分光光度计260 nm和280 nm波长下读数，按1 OD值40 g/L RNA计算RNA的含量。
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1.3 Northern blot杂交
1.3.1 RNA甲醛变性凝胶电泳：制备12 g/L甲醛变性凝胶。在离心管中混合下列液体：RNA液10 μl(约20 μg),Loading buffer 30 μl(含甲酰胺，甲醛，10×MOPS，甘油，DEPC水，溴酚兰，溴化乙锭)。煮沸变性2 min，立即置冰浴，点样。恒压(60 V)进行电泳，待溴酚兰移至胶长的2/3时中止电泳。紫外灯下观察RNA质量。
1.3.2 转膜:同文献[1]。
1.3.3 探针制备:KAI1 cDNA探针制备过程见文献[1]。采用Primer-α-Gene标记体系(美国Promega公司)以α-32P-dCTP标记KAI1 cDNA探针。
1.3.4 杂交过程:同文献[1]。
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1.4 RT-PCR
1.4.1 逆转录反应：采用AMV逆转录酶及随机引物在42 ℃条件下进行逆转录(RNA模板量约2 μg)。
1.4.2 PCR反应：KAI1 cDNA引物序列：上游，5'-CAAGCTGAAGCAGGAGATGG-3'，下游，5'-CACAAGCAGATGGACAGGAC-3'，退火温度55 ℃，cDNA模板量0.5 μl(0.5 μg)。
1.5 原位杂交 采用KAI1 cDNA探针，以随机引物法标记地高辛-cDNA探针。杂交过程及结果判断同文献[2]。作者为了提高杂交效率，降低背景染色，在原位杂交操作时进行了一点改进，以体积分数100%甲酰胺代替湿盒内体积分数50%的甲酰胺。原位杂交技术即要考虑到提高组织和细胞的通透性，又不至使核酸破坏和流失。再则探针的标记效率在原位杂交中也是很重要的因素。作者认为有必要建立肯定的原位杂交阳性片，作为实验参照。因此在进行mRNA表达检测时，应根据情况选择适当的检测方法或结合使用这些方法，以对某一基因mRNA表达获得全面的了解。
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2 结果与讨论
2.1 Northern blot杂交 8个细胞系中KAI1 mRNA的表达是不一致的。KAI1是一个肿瘤转移抑制基因，在转移性的前列腺癌细胞系PC3,PC3M以及高转移潜能的人肺PG细胞中KAI1 mRNA不表达，而在无转移潜能的人肺腺癌细胞PAa中显现强表达；在4个黑色素瘤细胞系为中等程度表达。由此可见，Northern blot可用来进行RNA的定量分析。某一基因在不同细胞中的表达是有差异的，在不同细胞中某种特定mRNA的含量亦可不同。用Northern blot方法进行mRNA的定量分析，结果可靠，操作也较其他方法(如S1核酸酶法等)相对简单，因此该方法应用很广泛。作者认为在进行Northern blot杂交时成功与否有几个环节很重要：①RNA质量；②探针标记效率，最好采用试剂盒；③ 洗膜的控制，严格掌握洗膜时间，以确保特异信号清晰及尽可能低的背景信号。
2.2 RT-PCR 肿瘤转移抑制基因KAI1 mRNA在8种不同转移潜能人癌细胞系中均有表达且表达量也基本一致。由此可见RT-PCR法未能显现它们之间的差异。但该方法非常灵敏，特别适合于低丰度mRNA的检测[3]。它所需要的RNA量要比Northern blot少。由于PCR的高扩增倍数及较高的特异性，在检测特定基因的存在及表达时是非常有效的。但由于它的扩增倍数高达106以上，影响扩增效率的因素很多，准确定量很困难。作者认为相对定量法(半定量法)较容易，但它的前提是扩增过程保持在指数增长阶段，此时扩增产物含量与起始含量成正比。另外在半定量中另一个重要因素就是起始含量。可设置不同梯度浓度的起始含量，以获得最佳起始模板量。
, 百拇医药
2.3 原位杂交 KAI1 mRNA阳性信号呈紫蓝色位于胞浆内。原位杂交技术为研究单一细胞中编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，它即可检测mRNA的表达，又可观察mRNA的定位，是研究细胞内基因表达及有关因素调控的有效工具。而Northern blot分析和RT-PCR两种方法只用于检测某一特定的RNA片段，它们都只能证明细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明核酸分子在细胞或组织中存在的部位，不具有定位性，也不能反映组织、细胞、器官的差异。而原位杂交技术确定的是阳性细胞的数量，它不能确定mRNA的绝对含量，这一点又不如Northern blot和RT-PCR法。由于原位杂交涉及到组织细胞内mRNA的检测，那么如何使探针与细胞内mRNA更有效地结合便成了原位杂交成败的关键问题。
基金项目：博士研究生课题
参考文献：
[1]李珊珊，方伟岗，钟镐镐，等.肿瘤转移抑制基因KAI1在不同转移潜能癌细胞中的表达.中华医学杂志，1999，(9)：708
[2]李珊珊，方伟岗，晏梅，等.转移性和非转移性食管癌组织中KAI1基因的表达.河南医科大学学报，2000，35(2)：103
[3]K.B穆里斯，F.费里，R.吉布斯，等.PCR聚合酶链式反应.北京：科学出版社，1997.9
(收稿日期：1999-12-25), 百拇医药
单位：李珊珊(河南医科大学第一附属医院病理科,河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州450052)；方伟岗(北京医科大学病理系 北京 100083)；闫爱华 任秀花(河南医科大学癌前期研究室 郑州 450052)
关键词：Northern；blot；RT-PCR；原位杂交；mRNA
河南医科大学学报000208
摘 要：目的：比较3种检测mRNA表达的方法。方法：采用Nothern blot，RT-PCR，原位杂交法检测基因mRNA的表达。结果及结论：在使用Nothern blot杂交进行定量分析时，关键因素有：①RNA的质量；②探针标记效率；③洗膜的控制。RT-PCR检测很难用于定量分析。原位杂交法可进行细胞内mRNA的定位分析但不能确定mRNA的绝对含量。将这些方法结合使用，可全面了解基因mRNA的表达。
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分类号：R73.74
Comparing three methods for detection of mRNA expressions
LI Shanshan
(Department of Pathology,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
REN Xiuhua,YAN Aihua
(Department of Precancerous Studies,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FANG Weigang
, http://www.100md.com
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083)
Abstract：Aim:To compare three methods for detecting expressions of a gene mRNA.Methods:Northern blot,RT-PCR,in situ hybridization were used for examining expressions of a gene mRNA.Results and Conclusion:The key issues in using Nothern blot for quantitative analysis are high quality RNA,efficiency of marked probe and control of washing membrane.RT-PCR is no suitable for quantitative analysis.In situ hybridization may be used for the located analysis of mRNA in a cell,but no confirmation for absolute content of mRNA in a cell.Overall information of mRNA expressions may be obtained by combination of these methods.
, http://www.100md.com
Key words：Northern blot;RT-PCR;in situ hybridization;mRNA▲
检测某种基因的表达，了解该基因的功能，在肿瘤研究中是非常重要且常用的。基因表达的检测主要涉及到两个水平——mRNA水平和蛋白水平。mRNA水平检测，最常用的方法有Nothern blot杂交、逆转录-PCR以及原位杂交，这3种方法在研究基因表达的调控、基因的功能以及遗传变异等方面应用十分广泛，也是目前肿瘤研究中常用的分子生物学手段。作者在以往的研究工作中3种技术均涉及到，现将它们的特点及作者的一些体会介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系：人肺癌细胞系PG，PAa；人前列腺癌细胞系PC3M，PC3，采用体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基。人黑色素瘤细胞系WM35，WM1341b,WM983a,WM451，采用含体积分数15%小牛血清的RPMI 1640培养基。于37 ℃，体积分数5%CO2及恒定湿度条件下培养。以上细胞由北京医科大学病理系提供。
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1.1.2 组织标本：食管癌手术切除标本，来自河南医科大学第一附属医院及河南省肿瘤医院，组织学检查为鳞状细胞癌。
1.2 细胞总RNA的提取 取对数生长期细胞，经预冷的PBS洗，按每瓶(100 ml)细胞加入溶液D 1 ml(4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠，5 g/L十二烷基肌氨酸钠，0.1 mol/L α-巯基乙醇)，使之与细胞充分混匀，彻底裂解细胞。再依次加入0.1 ml 2 mol/L乙酸钠(pH 4.0)，混匀，1 ml水饱和酚，0.2 ml氯仿-异戊醇(体积比49∶1)，混匀并振荡，冰浴15 min。12 000 r/min离心20 min。取水相，加入等体积异丙醇，-20 ℃过夜。12 000 r/min再离心20 min，弃上清，沉淀溶于0.3 ml溶液D，加入等体积异丙醇置-20 ℃再沉淀1 h，离心弃上清，沉淀经体积分数75%乙醇洗，将沉淀(含RNA)溶于DEPC水，-70 ℃保存备用。RNA定量：取适当稀释的RNA样品，分别在紫外分光光度计260 nm和280 nm波长下读数，按1 OD值40 g/L RNA计算RNA的含量。
, 百拇医药
1.3 Northern blot杂交
1.3.1 RNA甲醛变性凝胶电泳：制备12 g/L甲醛变性凝胶。在离心管中混合下列液体：RNA液10 μl(约20 μg),Loading buffer 30 μl(含甲酰胺，甲醛，10×MOPS，甘油，DEPC水，溴酚兰，溴化乙锭)。煮沸变性2 min，立即置冰浴，点样。恒压(60 V)进行电泳，待溴酚兰移至胶长的2/3时中止电泳。紫外灯下观察RNA质量。
1.3.2 转膜:同文献[1]。
1.3.3 探针制备:KAI1 cDNA探针制备过程见文献[1]。采用Primer-α-Gene标记体系(美国Promega公司)以α-32P-dCTP标记KAI1 cDNA探针。
1.3.4 杂交过程:同文献[1]。
, http://www.100md.com
1.4 RT-PCR
1.4.1 逆转录反应：采用AMV逆转录酶及随机引物在42 ℃条件下进行逆转录(RNA模板量约2 μg)。
1.4.2 PCR反应：KAI1 cDNA引物序列：上游，5'-CAAGCTGAAGCAGGAGATGG-3'，下游，5'-CACAAGCAGATGGACAGGAC-3'，退火温度55 ℃，cDNA模板量0.5 μl(0.5 μg)。
1.5 原位杂交 采用KAI1 cDNA探针，以随机引物法标记地高辛-cDNA探针。杂交过程及结果判断同文献[2]。作者为了提高杂交效率，降低背景染色，在原位杂交操作时进行了一点改进，以体积分数100%甲酰胺代替湿盒内体积分数50%的甲酰胺。原位杂交技术即要考虑到提高组织和细胞的通透性，又不至使核酸破坏和流失。再则探针的标记效率在原位杂交中也是很重要的因素。作者认为有必要建立肯定的原位杂交阳性片，作为实验参照。因此在进行mRNA表达检测时，应根据情况选择适当的检测方法或结合使用这些方法，以对某一基因mRNA表达获得全面的了解。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 Northern blot杂交 8个细胞系中KAI1 mRNA的表达是不一致的。KAI1是一个肿瘤转移抑制基因，在转移性的前列腺癌细胞系PC3,PC3M以及高转移潜能的人肺PG细胞中KAI1 mRNA不表达，而在无转移潜能的人肺腺癌细胞PAa中显现强表达；在4个黑色素瘤细胞系为中等程度表达。由此可见，Northern blot可用来进行RNA的定量分析。某一基因在不同细胞中的表达是有差异的，在不同细胞中某种特定mRNA的含量亦可不同。用Northern blot方法进行mRNA的定量分析，结果可靠，操作也较其他方法(如S1核酸酶法等)相对简单，因此该方法应用很广泛。作者认为在进行Northern blot杂交时成功与否有几个环节很重要：①RNA质量；②探针标记效率，最好采用试剂盒；③ 洗膜的控制，严格掌握洗膜时间，以确保特异信号清晰及尽可能低的背景信号。
2.2 RT-PCR 肿瘤转移抑制基因KAI1 mRNA在8种不同转移潜能人癌细胞系中均有表达且表达量也基本一致。由此可见RT-PCR法未能显现它们之间的差异。但该方法非常灵敏，特别适合于低丰度mRNA的检测[3]。它所需要的RNA量要比Northern blot少。由于PCR的高扩增倍数及较高的特异性，在检测特定基因的存在及表达时是非常有效的。但由于它的扩增倍数高达106以上，影响扩增效率的因素很多，准确定量很困难。作者认为相对定量法(半定量法)较容易，但它的前提是扩增过程保持在指数增长阶段，此时扩增产物含量与起始含量成正比。另外在半定量中另一个重要因素就是起始含量。可设置不同梯度浓度的起始含量，以获得最佳起始模板量。
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2.3 原位杂交 KAI1 mRNA阳性信号呈紫蓝色位于胞浆内。原位杂交技术为研究单一细胞中编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，它即可检测mRNA的表达，又可观察mRNA的定位，是研究细胞内基因表达及有关因素调控的有效工具。而Northern blot分析和RT-PCR两种方法只用于检测某一特定的RNA片段，它们都只能证明细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明核酸分子在细胞或组织中存在的部位，不具有定位性，也不能反映组织、细胞、器官的差异。而原位杂交技术确定的是阳性细胞的数量，它不能确定mRNA的绝对含量，这一点又不如Northern blot和RT-PCR法。由于原位杂交涉及到组织细胞内mRNA的检测，那么如何使探针与细胞内mRNA更有效地结合便成了原位杂交成败的关键问题。
基金项目：博士研究生课题
参考文献：
[1]李珊珊，方伟岗，钟镐镐，等.肿瘤转移抑制基因KAI1在不同转移潜能癌细胞中的表达.中华医学杂志，1999，(9)：708
[2]李珊珊，方伟岗，晏梅，等.转移性和非转移性食管癌组织中KAI1基因的表达.河南医科大学学报，2000，35(2)：103
[3]K.B穆里斯，F.费里，R.吉布斯，等.PCR聚合酶链式反应.北京：科学出版社，1997.9
(收稿日期：1999-12-25), 百拇医药