四糖小培养在酵母样真菌鉴定中的应用
作者：郭小兵 陈小让 金雨琦 苏天水
单位：郭小兵(河南医科大学第一附属医院检验科 郑州 450052)；陈小让 金雨琦 苏天水(焦作市第一人民医院外二科 焦作 454150)
关键词：酵母样真菌；小培养；芽管
河南医科大学学报000219摘 要：目的：探讨四糖小培养在酵母样真菌检测中的应用。方法：采用四糖发酵、玉米-吐温琼脂小培养、芽管生成实验，对本院1996～1997 2 a内临床发现的202例酵母样真菌进行鉴定。结果：白色念珠菌感染占65%(含类星形念珠菌3%)，热带念珠菌占17%，近平滑念珠菌占5%，少见菌种及酵母菌占13%。从标本来源看，呼吸道标本占56.4%，泌尿道标本占19.0%，外伤标本占12.3%，消化道标本占8.4%，血液标本占2.9%，骨髓及脑积液标本各占0.5%。结论：检测结果和临床相符，四糖小培养法有较高的推广价值。
, 百拇医药
分类号：R446.5▲
由于广谱抗生素、免疫抑制剂以及激素的广泛使用，院内感染上升趋势日渐明显。其中，由酵母样真菌引起的感染日益增多。目前，国内许多医院已将酵母样真菌的实验室检查提上日程，但是，鉴定方法尚未完全规范[1]。作者利用四糖发酵、玉米-吐湿琼脂小培养及芽管生成实验，对本院1996～1997年分离的202例酵母样真菌进行鉴定，旨在寻求一种简单、有效的真菌检测方法，以便基层医院普及。
1 材料与方法
1.1 标本来源 本院各科室送检培养的各类标本。
1.2 实验材料 四糖发酵培养基：参照文献[2]自行配制，包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖及半乳糖培养基。玉米-吐温琼脂：参照文献[2]自行配制。按每管2 ml分装，灭菌后待用。血清：本院生化室提供。
, 百拇医药
1.3 方法
①将各标本分离接种于相应培养基平板，培养后，若有真菌样菌落，涂片染色后镜检，若确为酵母样真菌，则继续以下操作。②挑取纯菌落接种于四糖培养基中，37 ℃培养18～24 h，观察结果。③挑取菌落，接种于人血清培养基中，37 ℃培养，4 h内观察结果。④取玉米-吐温琼脂一支，加热溶化后，用无菌管吸取0.5 ml左右，在一洁净载玻片上，涂成“U”形，两边间距约0.5 cm，琼脂厚度约0.3 cm，冷凝后，用接种针挑取菌落，在“U”形琼脂内侧点种，而后用盖片盖好，移至放有饱浸硫酸铜溶液棉球的平皿内，室温培养24～48 h，观察结果。
四糖发酵管上观察4种糖发酵结果；小培养上观察厚膜孢子，假菌丝及生长形态；血清管内观察芽管生成。具体鉴定依据见文献[2]。
白色念珠菌与类星形念珠菌，在形态上不易区分，但两者利用半乳糖能力有异。近平滑念珠菌与克柔念珠菌则形态上有一定的差异[3]。酵母菌无芽管，无假菌丝。
, 百拇医药
2 结果
本院1996～1997年发现的202例酵母样真菌，分布状况见表1。
表1 酵母样真菌感染分布表 例 菌名
呼吸道
泌尿道
外伤
消化道
血液
其他
合计
白色念珠菌
70
, 百拇医药
24
15
11
4
1
125
类星型念珠菌
3
1
1
1
-
-
6
, 百拇医药
热带念珠菌
20
6
5
3
1
-
35
近平滑念珠菌
6
2
1
1
-
, http://www.100md.com
-
10
其 他
15
5
3
2
1
-
26
合 计
114
38
25
, 百拇医药
18
6
1
202
由表可知，白色念珠菌感染为主导，呼吸道感染最常见。
3 讨论
酵母样真菌在大自然的分布极其广泛。对人体而言，它们广泛存在于皮肤表面及人体与外界相通的腔道内，是重要的条件致病菌。即当有某种原因引起机体菌群失调或抵抗力下降时，它们会引起继发感染。不同患者其感染情况亦不同，从本院感染标本来源看，呼吸道标本感染较为严重，占56.4%，这与傅有荣等[4]的报道相一致。以下依次为泌尿标本19.0%，外伤标本12.3%，消化道标本8.4%，血液标本2.9%，骨髓及脑积液标本1.0%。
, 百拇医药
对于酵母样真菌的鉴定，一则依据形态学特性，二则依据生化反应结果。作者通过小培养，芽管生成实验观察形态，利用四糖发酵观察生化结果，从而有机地将二者结合起来，达到简单、准确地鉴定。该法对常见的酵母样真菌鉴定价值较大，实验过程中有几点体会：①念珠菌属真菌，一般可产生假菌丝，这往往会干扰对芽管的判定。基于假菌丝生成需时长，而芽管生成需时短，故芽管生成实验应在4 h内观察结果。②四糖发酵管中成分及其量与普通细菌鉴定有所不同，为保证实验结果的准确性及重复性，培养基最好自己配制，质量标准参考文献[2]。③小培养中，为保证透气度及便于观察，U型琼脂两边间距不可过窄，放置有硫酸铜的棉球，一即保证湿度，又可抑制普通细菌生长。
一般检验科室对酵母样真菌的鉴定，主要靠芽管生成实验。该法仅能简单地区分酵母菌与念珠菌，在念珠菌中，类星型及热带念珠菌亦可产生芽管，故单纯地依据该实验结果，不能够准确地分类，本方法参照多个指标，可达到准确分类的目的。
近年来，对于酵母样真菌的鉴定，出现了分子生物学技术[5]及微量快速法[6]。但是前者尚处于研究阶段，临床应用前景待定。后者则由于所用材料价格高且忽略形态学依据，故均未开展。
, http://www.100md.com
总之，传统真菌鉴定方法单一地依赖形态学或生化结果，而两者都不能准确鉴定。本方法综合两种指标，可以保证结果，且消耗低，重复性好，特别适合于基层医院推广使用。
参考文献：
[1]周贵民，谢灵.国内酵母菌感染和实验室诊断的现状及建议.中华医学检验杂志，1996，15(5)：303
[2]叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程.南京：东南大学出版社，1997.541，547
[3]王家俊.临床真菌检验.上海：上海医科大学出版社，1995.170
[4]傅有荣，张银旺，李杰.临床标本中酵母样真菌的鉴定与分析.医学新知杂志，1997，7(2)：64
[5]杨应宽，周贵民，张军民，等.应用聚合酶链反应检测18种46株酵母样真菌的探讨.中华医学检验杂志，1996，19(5)：270
[6]张银旺，傅有荣，谢文.酵母样真菌微量鉴定法的建立及评价.临床检验杂志，1996，14(3)：141
(收稿日期：1999-05-19), 百拇医药
单位：郭小兵(河南医科大学第一附属医院检验科 郑州 450052)；陈小让 金雨琦 苏天水(焦作市第一人民医院外二科 焦作 454150)
关键词：酵母样真菌；小培养；芽管
河南医科大学学报000219摘 要：目的：探讨四糖小培养在酵母样真菌检测中的应用。方法：采用四糖发酵、玉米-吐温琼脂小培养、芽管生成实验，对本院1996～1997 2 a内临床发现的202例酵母样真菌进行鉴定。结果：白色念珠菌感染占65%(含类星形念珠菌3%)，热带念珠菌占17%，近平滑念珠菌占5%，少见菌种及酵母菌占13%。从标本来源看，呼吸道标本占56.4%，泌尿道标本占19.0%，外伤标本占12.3%，消化道标本占8.4%，血液标本占2.9%，骨髓及脑积液标本各占0.5%。结论：检测结果和临床相符，四糖小培养法有较高的推广价值。
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分类号：R446.5▲
由于广谱抗生素、免疫抑制剂以及激素的广泛使用，院内感染上升趋势日渐明显。其中，由酵母样真菌引起的感染日益增多。目前，国内许多医院已将酵母样真菌的实验室检查提上日程，但是，鉴定方法尚未完全规范[1]。作者利用四糖发酵、玉米-吐湿琼脂小培养及芽管生成实验，对本院1996～1997年分离的202例酵母样真菌进行鉴定，旨在寻求一种简单、有效的真菌检测方法，以便基层医院普及。
1 材料与方法
1.1 标本来源 本院各科室送检培养的各类标本。
1.2 实验材料 四糖发酵培养基：参照文献[2]自行配制，包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖及半乳糖培养基。玉米-吐温琼脂：参照文献[2]自行配制。按每管2 ml分装，灭菌后待用。血清：本院生化室提供。
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1.3 方法
①将各标本分离接种于相应培养基平板，培养后，若有真菌样菌落，涂片染色后镜检，若确为酵母样真菌，则继续以下操作。②挑取纯菌落接种于四糖培养基中，37 ℃培养18～24 h，观察结果。③挑取菌落，接种于人血清培养基中，37 ℃培养，4 h内观察结果。④取玉米-吐温琼脂一支，加热溶化后，用无菌管吸取0.5 ml左右，在一洁净载玻片上，涂成“U”形，两边间距约0.5 cm，琼脂厚度约0.3 cm，冷凝后，用接种针挑取菌落，在“U”形琼脂内侧点种，而后用盖片盖好，移至放有饱浸硫酸铜溶液棉球的平皿内，室温培养24～48 h，观察结果。
四糖发酵管上观察4种糖发酵结果；小培养上观察厚膜孢子，假菌丝及生长形态；血清管内观察芽管生成。具体鉴定依据见文献[2]。
白色念珠菌与类星形念珠菌，在形态上不易区分，但两者利用半乳糖能力有异。近平滑念珠菌与克柔念珠菌则形态上有一定的差异[3]。酵母菌无芽管，无假菌丝。
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2 结果
本院1996～1997年发现的202例酵母样真菌，分布状况见表1。
表1 酵母样真菌感染分布表 例 菌名
呼吸道
泌尿道
外伤
消化道
血液
其他
合计
白色念珠菌
70
, 百拇医药
24
15
11
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125
类星型念珠菌
3
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热带念珠菌
20
6
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近平滑念珠菌
6
2
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其 他
15
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25
, 百拇医药
18
6
1
202
由表可知，白色念珠菌感染为主导，呼吸道感染最常见。
3 讨论
酵母样真菌在大自然的分布极其广泛。对人体而言，它们广泛存在于皮肤表面及人体与外界相通的腔道内，是重要的条件致病菌。即当有某种原因引起机体菌群失调或抵抗力下降时，它们会引起继发感染。不同患者其感染情况亦不同，从本院感染标本来源看，呼吸道标本感染较为严重，占56.4%，这与傅有荣等[4]的报道相一致。以下依次为泌尿标本19.0%，外伤标本12.3%，消化道标本8.4%，血液标本2.9%，骨髓及脑积液标本1.0%。
, 百拇医药
对于酵母样真菌的鉴定，一则依据形态学特性，二则依据生化反应结果。作者通过小培养，芽管生成实验观察形态，利用四糖发酵观察生化结果，从而有机地将二者结合起来，达到简单、准确地鉴定。该法对常见的酵母样真菌鉴定价值较大，实验过程中有几点体会：①念珠菌属真菌，一般可产生假菌丝，这往往会干扰对芽管的判定。基于假菌丝生成需时长，而芽管生成需时短，故芽管生成实验应在4 h内观察结果。②四糖发酵管中成分及其量与普通细菌鉴定有所不同，为保证实验结果的准确性及重复性，培养基最好自己配制，质量标准参考文献[2]。③小培养中，为保证透气度及便于观察，U型琼脂两边间距不可过窄，放置有硫酸铜的棉球，一即保证湿度，又可抑制普通细菌生长。
一般检验科室对酵母样真菌的鉴定，主要靠芽管生成实验。该法仅能简单地区分酵母菌与念珠菌，在念珠菌中，类星型及热带念珠菌亦可产生芽管，故单纯地依据该实验结果，不能够准确地分类，本方法参照多个指标，可达到准确分类的目的。
近年来，对于酵母样真菌的鉴定，出现了分子生物学技术[5]及微量快速法[6]。但是前者尚处于研究阶段，临床应用前景待定。后者则由于所用材料价格高且忽略形态学依据，故均未开展。
, http://www.100md.com
总之，传统真菌鉴定方法单一地依赖形态学或生化结果，而两者都不能准确鉴定。本方法综合两种指标，可以保证结果，且消耗低，重复性好，特别适合于基层医院推广使用。
参考文献：
[1]周贵民，谢灵.国内酵母菌感染和实验室诊断的现状及建议.中华医学检验杂志，1996，15(5)：303
[2]叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程.南京：东南大学出版社，1997.541，547
[3]王家俊.临床真菌检验.上海：上海医科大学出版社，1995.170
[4]傅有荣，张银旺，李杰.临床标本中酵母样真菌的鉴定与分析.医学新知杂志，1997，7(2)：64
[5]杨应宽，周贵民，张军民，等.应用聚合酶链反应检测18种46株酵母样真菌的探讨.中华医学检验杂志，1996，19(5)：270
[6]张银旺，傅有荣，谢文.酵母样真菌微量鉴定法的建立及评价.临床检验杂志，1996，14(3)：141
(收稿日期：1999-05-19), 百拇医药