血清P53蛋白检测对职业性肺癌的预报价值
作者：吴逸明 李卓炜 陈琛 马玉英 王新朝
单位：吴逸明 陈琛 马玉英 王新朝(河南医科大学劳动卫生学与卫生毒理学教研室 郑州 450052)；李卓炜(河南省卫生防疫站环境卫生科 郑州 450003)
关键词：多环芳烃混合物；血清；P53抑癌基因
河南医科大学学报000308 摘要 目的：探讨血清P53蛋白作为职业性肺癌早期监测指标的可能性和应用价值。方法：对长期接触多环芳烃混合物(PAHs)的23名焦炉工和18名沥青工进行外周血淋巴细胞染色体畸变检查初筛，检出染色体畸变者各16名，然后采用双抗夹心酶联免疫吸附试验方法(Sandwich-ELISA)测定畸变者血清P53蛋白水平。以12名正常献血员为对照组。结果：焦炉工和沥青工血清P53水平均值高于对照组(P<0.05)，其中10例高于对照组(
+2 s)。结论：血清P53水平可从基因水平反映PAHs对机体遗传物质的损伤作用，该指标有可能成为职业性肺癌早期监测的又一途径。
, 百拇医药
分类号 R13
The predication value of the detection of serum level of P53 protein in occupational lung cancer
WU Yiming, Chen Chen, MA Yuying, WANG Xinchao
(Department of Occupational Health and Health Toxiclogy, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
LI Zhuowei,(Department of Environment Health, Prevention and Antiepidemic Station of Henan Provincial, Zhengzhou 450003)
, 百拇医药
Abstract Aim：Discuss the application value and possibility of serum level of P53 protein as a early monitoring marker to the occupational lung cancer.Method:23 coke workers and 18 pitch workers were chosen as the exposure group,and the control group was composed of 15 non-exposed and healthy men.They were primarily assayed by the peripheral lymphocyte chromosomal aberration (CA).And 16 coke workers and 16 pitch workers and 12 men of the control were tested for serum level of P53 after reviewing the CA results. According to the method of the culture of peripheral lymphocyte and preparation of chromosome sample,the examination of CA was carried out. Serum level of P53 was determined by Sandwich-ELISA. Results: Serum level of P53 of exposed group was higher than that of control group (P<0.05).10 of the exposed group were determined as positive because their P53 level were greater than 2SD above the control average. Conclusion: The results showed that P53 protein was detectable in a proportion of coke and pitch workers,the serum level of P53 can reflect genetic injury of long-term exposure to PAHs. And thus,as a monitoring marker for early cancer, the detection of serum level of P53 has certain applicant value.Moreover, co-application of many genetic toxicologic effect markers, such as CA, will be an effective way to improve prediction of cancer.
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Key words polycyclic aromatic hydrocarbons; serum; P53 tumor suppressor gene
寻找和确定合适的早期监测指标一直是职业性肿瘤高危人群筛检的重要研究课题。新近发现，抑癌基因P53与职业性肺癌密切相关，其改变可发生在癌变的早期阶段，并于血清中出现相应的蛋白产物[1]。多环芳烃职业接触者是肺癌发生的高危人群[2]。作者利用传统指标染色体畸变作为初筛，检测了多环芳烃职业接触者——焦炉工和沥青工血清P53蛋白的水平，探讨了血清P53蛋白作为肺癌早期监测指标的可能性和预报价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象 选择职业性肺癌的高危人群焦炉工23名(某厂焦化分厂工人，年龄26～50岁，平均年龄39.9岁，工龄9～32 a，平均接毒工龄22.1 a)、沥青工18名(某厂碳素分厂工人，年龄32～57岁，平均年龄44.2岁，工龄7～38 a，平均接毒工龄22.4 a)作为暴露组，进行外周血淋巴细胞染色体畸变检测；对照组为健康献血员，12名，年龄24～47岁，平均37.4岁，均无职业接毒史。
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1.2 实验方法
1.2.1 染色体畸变标本的制作方法：采取肘部静脉血0.2 ml滴入1640培养基，37 ℃培养72 h。于中止培养前4 h加秋水仙素，终浓度0.2 mg/L。常规制片，双盲法阅片，观察100个中期相细胞，记录染色体结构和数目畸变数。
1.2.2 双抗夹心酶联免疫吸附试验(Sandwich-ELISA)检测人血清P53蛋白：抽取肘部静脉血，分离血清，-20 ℃冻存备用。取鼠抗人P53单克隆抗体DO-1(2 mg/L)50 μl(SantaCruz产品)包被40孔酶标板，湿盒内4 ℃放置过夜。甩尽孔内液体，加满PBS缓冲液，洗涤4次，5 min/次。每孔加200 μl 30 g/L BSA，37 ℃封闭1 h。用PBS缓冲液洗1次，含1 g/L NP 40的PBS洗2次，PBS再洗1次，5 min/次。将血清样品按体积比1∶2稀释后，各取50 μl加入孔内。每份血清均做双孔检测。同时以同样量加入双蒸水作为阴性对照孔，以重组人P53蛋白(本实验室自制)作阳性对照。加样后的酶标板置4 ℃，作用3 h。以上述同样方法洗板。用10 g/L BSA按体积比1∶1 000稀释兔抗人P53多克隆抗体CM-1(CA Midgley赠送)，每孔加 50 μl，4 ℃放置2 h，同样方法洗板。经与HRP-羊抗兔IgG孵育后加底物OPD显色20 min，以2 mol/L H2SO4中止反应。用DG3022A型酶联免疫检测仪在492 nm波长下测定各孔吸光度值作为P53含量的相对值，方法灵敏度为0.18 μg/L。以大于对照组(+2s)为P53阳性判断标准[1]。
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1.3 统计学处理 各组间血清P53蛋白水平的比较采用t或t′检验。
2 结果
2.1 焦炉工、沥青工和对照组人员基本情况、染色体畸变情况 23名焦炉工检出染色体畸变者18名，18名沥青工检出染色体畸变者16名。由于焦炉工染色体畸变者中有2例血清发生溶血，故实际检测血清P53水平例数为焦炉工16名、沥青工16名、对照组12名。
2.2 暴露组(焦炉工+沥青工)和对照组血清P53水平比较 P53水平相对值经正态性检验均符合正态分布，根据方差齐性检验，采用t或t′检验，结果见表1。
表1 焦炉工和对照组血清P53水平相对值的比较 组别
n
血清P53水平
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(±s)
t(t′)检验
t(t′)
P
暴露组
32
0.5075±0.269
2.06(t′)
0.047*
焦炉工
16
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0.4838±0.343
1.72(t)
0.097△
沥青工
16
0.5313±0.176
1.63(t′)
0.119△
对照组
12
0.3750±0.150
*与对照组相比P<0.05；△与对照组相比P>0.05
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表1提示焦炉工和沥青工组间和其分别与对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)。暴露组P53值与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。暴露组中有10例可判为血清P53蛋白阳性。
3 讨论
P53抑癌基因突变可出现于肺癌发生的早期阶段。申戈等[3]所测定的I期非小细胞肺癌中P53蛋白表达的阳性率可达48%。在异常增生的支气管上皮组织有P53突变蛋白的表达[2]；Mao等[4]采用PCR 技术在痰液标本中发现与肺癌组织同样的P53基因突变，能检出癌细胞克隆的最早的痰液标本取自临床确诊之前13个月，该研究表明：痰液细胞P53基因突变的测定能在一定程度上预报肺组织的癌变。由于突变的P53蛋白半衰期显著延长，细胞内P53水平的增高可能外溢，相应地导致体液中P53蛋白的出现。1977年Hanaoka等[5]在六价铬接触工人中发现，血清P53水平高于对照组，19%的接触者明显高于对照组。1997年Husgafvel等[6]在职业性肺癌研究中发现血清P53水平与组织内改变具有高度一致性(kappa=0.71,P=0.017)，此结果表明血清P53水平对于反映组织P53在基因或蛋白水平是很准确的，可作为一个风险预报的生物学指标。Micelli等[7]、Luo 等[1]分别研究了生物材料血清中的P53蛋白水平，均发现了阳性个体。
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多环芳烃类混合物(PAHs)的主要致癌成分B[a]P与P53基因体外作用的实验研究证明：B[a]P的活性产物BPDE在P53 基因非转录链的三个突变热点区域(外显子5，7，8)与DNA形成加合物；P53基因外显子5～8的1 086个碱基中，36%是B[a]P作用的靶位点；P53基因突变类型多为G:C→T:A颠换，这也正是BP修饰的碱基对[8]。以上研究均表明与PAHs有关的职业性肺癌发生过程中可能存在P53突变蛋白的表达。
本研究结果焦炉工和沥青工的P53蛋白相对值均分别高于对照组，但差异无统计学意义。焦炉工和沥青工合并为暴露组后与对照组相比，P53水平增高差异有显著性，这可能是检测例数较少的直接影响。通过进一步的分析发现，在焦炉工、沥青工中均有血清P53水平相对值远远高于对照组平均水平者，参照Luo等判断阳性的标准，将大于对照组+2s者作为阳性，则焦炉工、沥青工各有5例血清P53水平异常增高。 从工种分布来看，暴露组的10例P53阳性者中混捏工2例，调温工3例，皮带工2例，天车工、热修和筛焦工各1例，无一定规律。这可能与P53蛋白在细胞内积累引起自身免疫，继而使机体内产生P53抗体的免疫过程有关[9] 。因此在测定血清P53抗原的同时， 如能测定血清P53抗体水平，可能会对结果分析有一定帮助。另外，P53突变有多种类型，并不是所有的突变均能产生P53蛋白的过量表达[10] 。P53水平与肺组织P53表达状况并不完全一致[1] 。因而组织细胞P53基因变化情况并不能完全在血清水平上反映出来。血清学检测的这一局限性在高危人群的筛检过程中会造成漏检，但考虑到目前肿瘤尚无特异性早期检测手段，如能与相应指标如染色体畸变配合检测，将会提高预报性。
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综上所述，作者检测了职业性肺癌高危人群焦炉工和沥青工血清P53蛋白水平，其中10例为P53阳性。虽然检测样本数量有限，阳性个体的临床意义也有待进一步的随访研究，但从本次横断面调查结果来看，血清P53水平增高能够从基因水平反映长期接触PAHs对机体遗传物质的损伤作用，这一指标有可能为职业性肺癌早期监测开辟新的途径。
基金项目：河南省自然科学基金资助项目 984020300
研究方向：肺癌的病因学、预防、早期诊断和综合治疗，E-mail：ymwu@371.net
作者简介：吴逸明，男，55岁，教授，博士生导师，参考文献
[1]Luo JC,Zehab R,Anttila S,et al.Detection of serum P53 protein in lung cancer patients. J Occu Med, 1994,36(2):155
, 百拇医药
[2]Walker C,Robertson LJ,Myskow MW,et al.P53 expression in normal and dysplastic bronchial epithelium and in lung carcinomas.Br J Cancer,1994,70(2):297
[3]申戈，鲍云华，李国民,等. I 期非小细胞肺癌P53蛋白的表达及其临床意义. 中国癌症杂志, 2000, 10(1): 45
[4]Mao L,Hruban RH,Boyle JO,et al.Detection of oncogene mutations in sputum precedes diagnosis of lung cancer.Cancer Res,1994,54:1 634
[5]Hanaoka T,Yamano Y, Katasuno N, et al. Evaluated serum levels of pantropic of P53 protein in chromium workers. Scand J Work Environ Health,1977,3(1):37
, 百拇医药
[6]Husgafvel PK, Kannio A, Oksa P, et al. Mutation, tissue accumulations and serum levels of P53 in patients with occupational cancers from asbestosis and silica expose. Environ Mol Mutation,1997,30(2):224
[7]Micelli G,Donadeo A,Quaranta M.The P53 tumor suppressor gene: A preliminary clinical study in breast cancer patients.Cell Biophysis,1992,21:25
[8]Puisieux A,Lim S,Groopman J,et al.Selective targeting of P53 gene mutational hotspots in human cancers by etilogically defined carcinogens.Cancer Res,1991,51:6185
[9]郭华北，蒋秉坤.ELISA检测肺癌患者血清P53抗体.临床检验杂志，1995，13(5)：225
[10]Takakashi T,Damico D,Chiba I,et al.Identification of intronic point mutations as an alternative mechanism for P53 inactivation in lung cancer. J Clinic Invest,1990,86:363
2000-01-05收稿, http://www.100md.com
单位：吴逸明 陈琛 马玉英 王新朝(河南医科大学劳动卫生学与卫生毒理学教研室 郑州 450052)；李卓炜(河南省卫生防疫站环境卫生科 郑州 450003)
关键词：多环芳烃混合物；血清；P53抑癌基因
河南医科大学学报000308 摘要 目的：探讨血清P53蛋白作为职业性肺癌早期监测指标的可能性和应用价值。方法：对长期接触多环芳烃混合物(PAHs)的23名焦炉工和18名沥青工进行外周血淋巴细胞染色体畸变检查初筛，检出染色体畸变者各16名，然后采用双抗夹心酶联免疫吸附试验方法(Sandwich-ELISA)测定畸变者血清P53蛋白水平。以12名正常献血员为对照组。结果：焦炉工和沥青工血清P53水平均值高于对照组(P<0.05)，其中10例高于对照组(
+2 s)。结论：血清P53水平可从基因水平反映PAHs对机体遗传物质的损伤作用，该指标有可能成为职业性肺癌早期监测的又一途径。, 百拇医药
分类号 R13
The predication value of the detection of serum level of P53 protein in occupational lung cancer
WU Yiming, Chen Chen, MA Yuying, WANG Xinchao
(Department of Occupational Health and Health Toxiclogy, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
LI Zhuowei,(Department of Environment Health, Prevention and Antiepidemic Station of Henan Provincial, Zhengzhou 450003)
, 百拇医药
Abstract Aim：Discuss the application value and possibility of serum level of P53 protein as a early monitoring marker to the occupational lung cancer.Method:23 coke workers and 18 pitch workers were chosen as the exposure group,and the control group was composed of 15 non-exposed and healthy men.They were primarily assayed by the peripheral lymphocyte chromosomal aberration (CA).And 16 coke workers and 16 pitch workers and 12 men of the control were tested for serum level of P53 after reviewing the CA results. According to the method of the culture of peripheral lymphocyte and preparation of chromosome sample,the examination of CA was carried out. Serum level of P53 was determined by Sandwich-ELISA. Results: Serum level of P53 of exposed group was higher than that of control group (P<0.05).10 of the exposed group were determined as positive because their P53 level were greater than 2SD above the control average. Conclusion: The results showed that P53 protein was detectable in a proportion of coke and pitch workers,the serum level of P53 can reflect genetic injury of long-term exposure to PAHs. And thus,as a monitoring marker for early cancer, the detection of serum level of P53 has certain applicant value.Moreover, co-application of many genetic toxicologic effect markers, such as CA, will be an effective way to improve prediction of cancer.
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Key words polycyclic aromatic hydrocarbons; serum; P53 tumor suppressor gene
寻找和确定合适的早期监测指标一直是职业性肿瘤高危人群筛检的重要研究课题。新近发现，抑癌基因P53与职业性肺癌密切相关，其改变可发生在癌变的早期阶段，并于血清中出现相应的蛋白产物[1]。多环芳烃职业接触者是肺癌发生的高危人群[2]。作者利用传统指标染色体畸变作为初筛，检测了多环芳烃职业接触者——焦炉工和沥青工血清P53蛋白的水平，探讨了血清P53蛋白作为肺癌早期监测指标的可能性和预报价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象 选择职业性肺癌的高危人群焦炉工23名(某厂焦化分厂工人，年龄26～50岁，平均年龄39.9岁，工龄9～32 a，平均接毒工龄22.1 a)、沥青工18名(某厂碳素分厂工人，年龄32～57岁，平均年龄44.2岁，工龄7～38 a，平均接毒工龄22.4 a)作为暴露组，进行外周血淋巴细胞染色体畸变检测；对照组为健康献血员，12名，年龄24～47岁，平均37.4岁，均无职业接毒史。
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1.2 实验方法
1.2.1 染色体畸变标本的制作方法：采取肘部静脉血0.2 ml滴入1640培养基，37 ℃培养72 h。于中止培养前4 h加秋水仙素，终浓度0.2 mg/L。常规制片，双盲法阅片，观察100个中期相细胞，记录染色体结构和数目畸变数。
1.2.2 双抗夹心酶联免疫吸附试验(Sandwich-ELISA)检测人血清P53蛋白：抽取肘部静脉血，分离血清，-20 ℃冻存备用。取鼠抗人P53单克隆抗体DO-1(2 mg/L)50 μl(SantaCruz产品)包被40孔酶标板，湿盒内4 ℃放置过夜。甩尽孔内液体，加满PBS缓冲液，洗涤4次，5 min/次。每孔加200 μl 30 g/L BSA，37 ℃封闭1 h。用PBS缓冲液洗1次，含1 g/L NP 40的PBS洗2次，PBS再洗1次，5 min/次。将血清样品按体积比1∶2稀释后，各取50 μl加入孔内。每份血清均做双孔检测。同时以同样量加入双蒸水作为阴性对照孔，以重组人P53蛋白(本实验室自制)作阳性对照。加样后的酶标板置4 ℃，作用3 h。以上述同样方法洗板。用10 g/L BSA按体积比1∶1 000稀释兔抗人P53多克隆抗体CM-1(CA Midgley赠送)，每孔加 50 μl，4 ℃放置2 h，同样方法洗板。经与HRP-羊抗兔IgG孵育后加底物OPD显色20 min，以2 mol/L H2SO4中止反应。用DG3022A型酶联免疫检测仪在492 nm波长下测定各孔吸光度值作为P53含量的相对值，方法灵敏度为0.18 μg/L。以大于对照组(
+2s)为P53阳性判断标准[1]。, 百拇医药
1.3 统计学处理 各组间血清P53蛋白水平的比较采用t或t′检验。
2 结果
2.1 焦炉工、沥青工和对照组人员基本情况、染色体畸变情况 23名焦炉工检出染色体畸变者18名，18名沥青工检出染色体畸变者16名。由于焦炉工染色体畸变者中有2例血清发生溶血，故实际检测血清P53水平例数为焦炉工16名、沥青工16名、对照组12名。
2.2 暴露组(焦炉工+沥青工)和对照组血清P53水平比较 P53水平相对值经正态性检验均符合正态分布，根据方差齐性检验，采用t或t′检验，结果见表1。
表1 焦炉工和对照组血清P53水平相对值的比较 组别
n
血清P53水平
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(
±s)t(t′)检验
t(t′)
P
暴露组
32
0.5075±0.269
2.06(t′)
0.047*
焦炉工
16
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0.4838±0.343
1.72(t)
0.097△
沥青工
16
0.5313±0.176
1.63(t′)
0.119△
对照组
12
0.3750±0.150
*与对照组相比P<0.05；△与对照组相比P>0.05
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表1提示焦炉工和沥青工组间和其分别与对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)。暴露组P53值与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。暴露组中有10例可判为血清P53蛋白阳性。
3 讨论
P53抑癌基因突变可出现于肺癌发生的早期阶段。申戈等[3]所测定的I期非小细胞肺癌中P53蛋白表达的阳性率可达48%。在异常增生的支气管上皮组织有P53突变蛋白的表达[2]；Mao等[4]采用PCR 技术在痰液标本中发现与肺癌组织同样的P53基因突变，能检出癌细胞克隆的最早的痰液标本取自临床确诊之前13个月，该研究表明：痰液细胞P53基因突变的测定能在一定程度上预报肺组织的癌变。由于突变的P53蛋白半衰期显著延长，细胞内P53水平的增高可能外溢，相应地导致体液中P53蛋白的出现。1977年Hanaoka等[5]在六价铬接触工人中发现，血清P53水平高于对照组，19%的接触者明显高于对照组。1997年Husgafvel等[6]在职业性肺癌研究中发现血清P53水平与组织内改变具有高度一致性(kappa=0.71,P=0.017)，此结果表明血清P53水平对于反映组织P53在基因或蛋白水平是很准确的，可作为一个风险预报的生物学指标。Micelli等[7]、Luo 等[1]分别研究了生物材料血清中的P53蛋白水平，均发现了阳性个体。
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多环芳烃类混合物(PAHs)的主要致癌成分B[a]P与P53基因体外作用的实验研究证明：B[a]P的活性产物BPDE在P53 基因非转录链的三个突变热点区域(外显子5，7，8)与DNA形成加合物；P53基因外显子5～8的1 086个碱基中，36%是B[a]P作用的靶位点；P53基因突变类型多为G:C→T:A颠换，这也正是BP修饰的碱基对[8]。以上研究均表明与PAHs有关的职业性肺癌发生过程中可能存在P53突变蛋白的表达。
本研究结果焦炉工和沥青工的P53蛋白相对值均分别高于对照组，但差异无统计学意义。焦炉工和沥青工合并为暴露组后与对照组相比，P53水平增高差异有显著性，这可能是检测例数较少的直接影响。通过进一步的分析发现，在焦炉工、沥青工中均有血清P53水平相对值远远高于对照组平均水平者，参照Luo等判断阳性的标准，将大于对照组
+2s者作为阳性，则焦炉工、沥青工各有5例血清P53水平异常增高。 从工种分布来看，暴露组的10例P53阳性者中混捏工2例，调温工3例，皮带工2例，天车工、热修和筛焦工各1例，无一定规律。这可能与P53蛋白在细胞内积累引起自身免疫，继而使机体内产生P53抗体的免疫过程有关[9] 。因此在测定血清P53抗原的同时， 如能测定血清P53抗体水平，可能会对结果分析有一定帮助。另外，P53突变有多种类型，并不是所有的突变均能产生P53蛋白的过量表达[10] 。P53水平与肺组织P53表达状况并不完全一致[1] 。因而组织细胞P53基因变化情况并不能完全在血清水平上反映出来。血清学检测的这一局限性在高危人群的筛检过程中会造成漏检，但考虑到目前肿瘤尚无特异性早期检测手段，如能与相应指标如染色体畸变配合检测，将会提高预报性。, http://www.100md.com
综上所述，作者检测了职业性肺癌高危人群焦炉工和沥青工血清P53蛋白水平，其中10例为P53阳性。虽然检测样本数量有限，阳性个体的临床意义也有待进一步的随访研究，但从本次横断面调查结果来看，血清P53水平增高能够从基因水平反映长期接触PAHs对机体遗传物质的损伤作用，这一指标有可能为职业性肺癌早期监测开辟新的途径。
基金项目：河南省自然科学基金资助项目 984020300
研究方向：肺癌的病因学、预防、早期诊断和综合治疗，E-mail：ymwu@371.net
作者简介：吴逸明，男，55岁，教授，博士生导师，参考文献
[1]Luo JC,Zehab R,Anttila S,et al.Detection of serum P53 protein in lung cancer patients. J Occu Med, 1994,36(2):155
, 百拇医药
[2]Walker C,Robertson LJ,Myskow MW,et al.P53 expression in normal and dysplastic bronchial epithelium and in lung carcinomas.Br J Cancer,1994,70(2):297
[3]申戈，鲍云华，李国民,等. I 期非小细胞肺癌P53蛋白的表达及其临床意义. 中国癌症杂志, 2000, 10(1): 45
[4]Mao L,Hruban RH,Boyle JO,et al.Detection of oncogene mutations in sputum precedes diagnosis of lung cancer.Cancer Res,1994,54:1 634
[5]Hanaoka T,Yamano Y, Katasuno N, et al. Evaluated serum levels of pantropic of P53 protein in chromium workers. Scand J Work Environ Health,1977,3(1):37
, 百拇医药
[6]Husgafvel PK, Kannio A, Oksa P, et al. Mutation, tissue accumulations and serum levels of P53 in patients with occupational cancers from asbestosis and silica expose. Environ Mol Mutation,1997,30(2):224
[7]Micelli G,Donadeo A,Quaranta M.The P53 tumor suppressor gene: A preliminary clinical study in breast cancer patients.Cell Biophysis,1992,21:25
[8]Puisieux A,Lim S,Groopman J,et al.Selective targeting of P53 gene mutational hotspots in human cancers by etilogically defined carcinogens.Cancer Res,1991,51:6185
[9]郭华北，蒋秉坤.ELISA检测肺癌患者血清P53抗体.临床检验杂志，1995，13(5)：225
[10]Takakashi T,Damico D,Chiba I,et al.Identification of intronic point mutations as an alternative mechanism for P53 inactivation in lung cancer. J Clinic Invest,1990,86:363
2000-01-05收稿, http://www.100md.com