米非司酮对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用
作者：孙丽君 郑英 崔金全 王伟娟 黄壮士 谭丽
单位：河南医科大学第二附属医院妇产科 郑州 450003
关键词：米非司酮；Hela细胞；Ki-67抗原
河南医科大学学报000331 摘要 目的：探讨米非司酮对人子宫颈癌Hela细胞增殖的影响。方法：采用MTT测定，观察不同浓度米非司酮(10,5,2.5 μmol/L)对Hela细胞增殖的抑制作用；通过ABC免疫组化法，检测用药后Hela细胞Ki-67抗原表达的变化。结果：3个浓度的米非司酮对Hela细胞增殖均有抑制作用，并呈剂量依赖性，其中以10 μmol/L浓度抑制作用最强，抑制率达57.69%；2.5 μmol/L米非司酮可使Ki-67抗原表达明显减少。结论：米非司酮体外对PR阳性的人宫颈癌细胞有明显的抑制作用，通过降低细胞Ki-67抗原的表达而抑制其增殖。
, 百拇医药 分类号 R737.3
Effects of Mifepristone on cell proliferation of human cervical carcinoma cell lines Hela in vitro
SUN Lijun,ZHENG Ying,CUI Jinquan,WANG Weijuan,HUANG Zhuangshi,TAN Li
Department of Obstetrics and Gynecology,the second affiliated hospital,Henan Mecidcal University,Zhengzhou 450003
Abstract Aim:To investigate the effects of Mifepristone on cell proliferation of human cervical carcinoma cell lines Hela in vitro.Methods:The antiproliferation effects of three different concentrations of Mifepristone (10,5,2.5 μmol/L) on Hela cell lines were detected with MTT assay.Immunohistochemical technique ABC were used to determine the changes of Ki-67 antigen expression after treatment with Mifepristone.Results:Three different concentrations of Mifepriston dose dependently inhibited the proliferation of Hela cells.The inhibition by Mifepristone plateaued at 10 μmol/L(57.68% inhibition).Mifepristone at 2.5 μmol/L decreased the expression of Ki-67 antigen of Hela cells.Conclusion:In vitro,Mifepristone significantly inhibited the growth and the proliferation of human cervical carcinoma cell lines that are progestin receptor positive and reduced the expression of Ki-67 antigen of the cells.
, 百拇医药
Key word Mifepristone;Hela cell;Ki-67 antigen
米非司酮为一强效受体水平的孕激素及糖皮质激素拮抗剂。国外一些学者报道其对孕激素受体(Progestin Recepter 简称 PR)阳性的乳腺癌细胞有明显的抗增殖作用[1]。作者将其用于PR阳性的宫颈癌细胞，探讨其是否具有同样的抗增殖作用。
1 材料与方法
1.1 靶细胞 人宫颈癌Hela细胞株，购于中科院上海细胞生物学研究所。
1.2 试剂与仪器 胎牛血清，中科院血液病研究所提供；RPMI1640系美国Life Technologies公司产品；四氮甲唑兰(MTT)，美国Sigma公司产品；Ki-67多克隆抗体，美国Zymed公司产品，ABC-抗兔IgG免疫组化试剂盒，购于华美公司；米非司酮由上海华联制药厂提供。DG 3022酶联免疫检测仪，南京光学仪器厂生产。
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1.3 方法
1.3.1 细胞培养：将人宫颈癌Hela细胞按常规方法培养于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，加入青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml。取对数生长期细胞，以1×105/ml接种于96孔培养板中，置含体积分数为5%CO2，37 ℃培养箱中，24 h后换培养液。用药组使用含无水酒精溶解的米非司酮，终浓度分别为10 μmol/L，5 μmol/L，2.5 μmol/L；对照组使用体积分数为0.6%无水乙醇。继续培养4 d后测MTT，重复做3板。
1.3.2 MTT测定：参照温汉平法[2]，经酶联免疫检测仪以570 nm的波长测各孔吸光度A值。细胞增殖抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100%.
1.3.3 ABC免疫组化法检测Hela细胞Ki-67抗原的表达：取对数生长期的细胞5 ml(5×104/ml)，接种于100 ml培养瓶中，24 h后换培养液。用药组培养液含米非司酮2.5 μmol/L，对照组含体积分数为0.6%无水乙醇，每组各做3瓶。4 d后将细胞用质量分数0.25%胰酶消化，制成细胞涂片。每瓶3张涂片，进行ABC免疫组化实验。封片后在显微镜下观察结果，计数 100个细胞内Ki-67阳性细胞的平均数，以倪灿荣标准[3]判定阳性细胞。
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1.4 统计处理 所得实验结果均经SAS统计软件包处理，分别采用F检验及t检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 MTT测定结果 见表1。
表1 不同浓度米非司酮
对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用 分组
A(
±s)
抑制率/%
10.0 μmol/L
0.584 1±0.036 1*
, 百拇医药
57.69
5.0 μmol/L
0.851 4±0.052 8*
38.32
2.5 μmol/L
1.009 2±0.056 8*
26.89
对照组
1.380 4±0.085 1
F检验： *与对照组比较及用药组间两两比较P<0.001
2.2 Hela细胞Ki-67抗原免疫组化检测结果 见表2。
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表2 2组宫颈癌Hela细胞Ki-67抗原免疫组化检测结果 组别
样本号
Ki-67抗
原阳性率/%
平均值(±s)
用药组
1
43.86
44.20±0.64
2
44.65
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3
43.38
对照组
1
71.46
68.80±2.95
2
65.62
3
69.32
t检验，P<0.001
3 讨论
宫颈癌的发生与HPV感染有关，但HPV感染后发展成恶性肿瘤者占极少数，且要经过较长的潜伏期，可能与HPV感染致癌需要协同因子有关。研究表明性激素在HPV致癌过程中起着重要作用。Pater等[4]研究发现，在孕酮存在时HPV16DNA能与ras癌基因协同作用，促使胎鼠肾细胞发生恶性转化，认为孕酮调控HPV基因表达，也与细胞癌性转变有关[4]。
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米非司酮为强效孕激素及糖皮质激素拮抗剂，与孕激素受体结合，阻止受体复合物与DNA上的孕激素反应元件结合，阻止DNA转录。大量研究表明米非司酮对PR阳性的乳腺癌细胞有受体介导的细胞抑制及细胞毒作用[5]
将米非司酮作用于宫颈癌Hela细胞，通过MTT检测发现10 μmol/L，5 μmol/L，2.5 μmol/L 3个浓度对Hela细胞均有抑制作用，且随药物浓度的增加抑制作用加强，表现为剂量依赖性关系。Ki-67抗原为人增殖期细胞特异性核蛋白，其抗体可识别细胞周期中G1后期、S、G2及M期的细胞核及染色体，而G0及G1早期细胞不被标记，故可作为评估增殖细胞生长组分的指标之一[6]。本研究通过ABC免疫组化检测发现小剂量米非司酮即可使Hela细胞Ki-67抗原阳性细胞明显减少，Hela细胞可能被阻滞于G0/G1期，不能进入S、G2及M期，故细胞增殖受到抑制。
虽然治疗宫颈癌多选手术或放疗，但仍有一些患者不能耐受手术或放疗而需化疗。长期大剂量化疗可致耐药及毒副反应的发生。米非司酮临床已广泛应用于药物流产、抗早孕，疗效确切，且无明显毒副作用。本研究提示米非司酮在体外能抑制宫颈癌Hela细胞的增殖，此结果有可能为宫颈癌的药物治疗提供一种新的方法。
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基金项目：河南省教委自然科学研究基金资助项目 97320013
研究方向：生殖医学
作者简介：孙丽君，女，36岁，副教授，硕士，参考文献
[1]Klijn JG,Setyono-Han B,Sander HJ,et al.Pre-clinical and clinical treatment of breast cancer with antiprogestins.Hum Reprod,1994,9:181
[2]温汉平，王小宁，孙华蕴，等.肿瘤细胞体外药物实验MTT分析法.中华肿瘤杂志，1993，15：470
[3]倪灿荣主编.免疫组织化学实验技术及应用.北京：北京科学技术出版社，1993.360
, 百拇医药
[4]Pater A,Bayatpour M,Mary M.Oncogenic transformation by human papillomavirus type 16 deoxyribonucleic acid in the presence of progesterone or progestin from oral contraceptive.Am J Obstet Gynecol, 1990,162:1 099
[5]Bardon S,Vignon F,Montcourrier P,et al. Steroid receptor mediated cytotoxicity of an antiestrogen and an antiprogestin in breast cancer cells .Cancer Res,1987,47:1 441
[6]周丁华.肿瘤增殖力学的研究方法学.国外医学.肿瘤学分册，1995,22：136
2000-03-20收稿, 百拇医药
单位：河南医科大学第二附属医院妇产科 郑州 450003
关键词：米非司酮；Hela细胞；Ki-67抗原
河南医科大学学报000331 摘要 目的：探讨米非司酮对人子宫颈癌Hela细胞增殖的影响。方法：采用MTT测定，观察不同浓度米非司酮(10,5,2.5 μmol/L)对Hela细胞增殖的抑制作用；通过ABC免疫组化法，检测用药后Hela细胞Ki-67抗原表达的变化。结果：3个浓度的米非司酮对Hela细胞增殖均有抑制作用，并呈剂量依赖性，其中以10 μmol/L浓度抑制作用最强，抑制率达57.69%；2.5 μmol/L米非司酮可使Ki-67抗原表达明显减少。结论：米非司酮体外对PR阳性的人宫颈癌细胞有明显的抑制作用，通过降低细胞Ki-67抗原的表达而抑制其增殖。
, 百拇医药 分类号 R737.3
Effects of Mifepristone on cell proliferation of human cervical carcinoma cell lines Hela in vitro
SUN Lijun,ZHENG Ying,CUI Jinquan,WANG Weijuan,HUANG Zhuangshi,TAN Li
Department of Obstetrics and Gynecology,the second affiliated hospital,Henan Mecidcal University,Zhengzhou 450003
Abstract Aim:To investigate the effects of Mifepristone on cell proliferation of human cervical carcinoma cell lines Hela in vitro.Methods:The antiproliferation effects of three different concentrations of Mifepristone (10,5,2.5 μmol/L) on Hela cell lines were detected with MTT assay.Immunohistochemical technique ABC were used to determine the changes of Ki-67 antigen expression after treatment with Mifepristone.Results:Three different concentrations of Mifepriston dose dependently inhibited the proliferation of Hela cells.The inhibition by Mifepristone plateaued at 10 μmol/L(57.68% inhibition).Mifepristone at 2.5 μmol/L decreased the expression of Ki-67 antigen of Hela cells.Conclusion:In vitro,Mifepristone significantly inhibited the growth and the proliferation of human cervical carcinoma cell lines that are progestin receptor positive and reduced the expression of Ki-67 antigen of the cells.
, 百拇医药
Key word Mifepristone;Hela cell;Ki-67 antigen
米非司酮为一强效受体水平的孕激素及糖皮质激素拮抗剂。国外一些学者报道其对孕激素受体(Progestin Recepter 简称 PR)阳性的乳腺癌细胞有明显的抗增殖作用[1]。作者将其用于PR阳性的宫颈癌细胞，探讨其是否具有同样的抗增殖作用。
1 材料与方法
1.1 靶细胞 人宫颈癌Hela细胞株，购于中科院上海细胞生物学研究所。
1.2 试剂与仪器 胎牛血清，中科院血液病研究所提供；RPMI1640系美国Life Technologies公司产品；四氮甲唑兰(MTT)，美国Sigma公司产品；Ki-67多克隆抗体，美国Zymed公司产品，ABC-抗兔IgG免疫组化试剂盒，购于华美公司；米非司酮由上海华联制药厂提供。DG 3022酶联免疫检测仪，南京光学仪器厂生产。
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1.3 方法
1.3.1 细胞培养：将人宫颈癌Hela细胞按常规方法培养于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，加入青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml。取对数生长期细胞，以1×105/ml接种于96孔培养板中，置含体积分数为5%CO2，37 ℃培养箱中，24 h后换培养液。用药组使用含无水酒精溶解的米非司酮，终浓度分别为10 μmol/L，5 μmol/L，2.5 μmol/L；对照组使用体积分数为0.6%无水乙醇。继续培养4 d后测MTT，重复做3板。
1.3.2 MTT测定：参照温汉平法[2]，经酶联免疫检测仪以570 nm的波长测各孔吸光度A值。细胞增殖抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100%.
1.3.3 ABC免疫组化法检测Hela细胞Ki-67抗原的表达：取对数生长期的细胞5 ml(5×104/ml)，接种于100 ml培养瓶中，24 h后换培养液。用药组培养液含米非司酮2.5 μmol/L，对照组含体积分数为0.6%无水乙醇，每组各做3瓶。4 d后将细胞用质量分数0.25%胰酶消化，制成细胞涂片。每瓶3张涂片，进行ABC免疫组化实验。封片后在显微镜下观察结果，计数 100个细胞内Ki-67阳性细胞的平均数，以倪灿荣标准[3]判定阳性细胞。
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1.4 统计处理 所得实验结果均经SAS统计软件包处理，分别采用F检验及t检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 MTT测定结果 见表1。
表1 不同浓度米非司酮
对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用 分组
A(
±s)抑制率/%
10.0 μmol/L
0.584 1±0.036 1*
, 百拇医药
57.69
5.0 μmol/L
0.851 4±0.052 8*
38.32
2.5 μmol/L
1.009 2±0.056 8*
26.89
对照组
1.380 4±0.085 1
F检验： *与对照组比较及用药组间两两比较P<0.001
2.2 Hela细胞Ki-67抗原免疫组化检测结果 见表2。
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表2 2组宫颈癌Hela细胞Ki-67抗原免疫组化检测结果 组别
样本号
Ki-67抗
原阳性率/%
平均值(
±s)用药组
1
43.86
44.20±0.64
2
44.65
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3
43.38
对照组
1
71.46
68.80±2.95
2
65.62
3
69.32
t检验，P<0.001
3 讨论
宫颈癌的发生与HPV感染有关，但HPV感染后发展成恶性肿瘤者占极少数，且要经过较长的潜伏期，可能与HPV感染致癌需要协同因子有关。研究表明性激素在HPV致癌过程中起着重要作用。Pater等[4]研究发现，在孕酮存在时HPV16DNA能与ras癌基因协同作用，促使胎鼠肾细胞发生恶性转化，认为孕酮调控HPV基因表达，也与细胞癌性转变有关[4]。
, http://www.100md.com
米非司酮为强效孕激素及糖皮质激素拮抗剂，与孕激素受体结合，阻止受体复合物与DNA上的孕激素反应元件结合，阻止DNA转录。大量研究表明米非司酮对PR阳性的乳腺癌细胞有受体介导的细胞抑制及细胞毒作用[5]
将米非司酮作用于宫颈癌Hela细胞，通过MTT检测发现10 μmol/L，5 μmol/L，2.5 μmol/L 3个浓度对Hela细胞均有抑制作用，且随药物浓度的增加抑制作用加强，表现为剂量依赖性关系。Ki-67抗原为人增殖期细胞特异性核蛋白，其抗体可识别细胞周期中G1后期、S、G2及M期的细胞核及染色体，而G0及G1早期细胞不被标记，故可作为评估增殖细胞生长组分的指标之一[6]。本研究通过ABC免疫组化检测发现小剂量米非司酮即可使Hela细胞Ki-67抗原阳性细胞明显减少，Hela细胞可能被阻滞于G0/G1期，不能进入S、G2及M期，故细胞增殖受到抑制。
虽然治疗宫颈癌多选手术或放疗，但仍有一些患者不能耐受手术或放疗而需化疗。长期大剂量化疗可致耐药及毒副反应的发生。米非司酮临床已广泛应用于药物流产、抗早孕，疗效确切，且无明显毒副作用。本研究提示米非司酮在体外能抑制宫颈癌Hela细胞的增殖，此结果有可能为宫颈癌的药物治疗提供一种新的方法。
, http://www.100md.com
基金项目：河南省教委自然科学研究基金资助项目 97320013
研究方向：生殖医学
作者简介：孙丽君，女，36岁，副教授，硕士，参考文献
[1]Klijn JG,Setyono-Han B,Sander HJ,et al.Pre-clinical and clinical treatment of breast cancer with antiprogestins.Hum Reprod,1994,9:181
[2]温汉平，王小宁，孙华蕴，等.肿瘤细胞体外药物实验MTT分析法.中华肿瘤杂志，1993，15：470
[3]倪灿荣主编.免疫组织化学实验技术及应用.北京：北京科学技术出版社，1993.360
, 百拇医药
[4]Pater A,Bayatpour M,Mary M.Oncogenic transformation by human papillomavirus type 16 deoxyribonucleic acid in the presence of progesterone or progestin from oral contraceptive.Am J Obstet Gynecol, 1990,162:1 099
[5]Bardon S,Vignon F,Montcourrier P,et al. Steroid receptor mediated cytotoxicity of an antiestrogen and an antiprogestin in breast cancer cells .Cancer Res,1987,47:1 441
[6]周丁华.肿瘤增殖力学的研究方法学.国外医学.肿瘤学分册，1995,22：136
2000-03-20收稿, 百拇医药