口腔粘膜白斑发生发展中bcl-2、P21wafl蛋白的表达
作者：姜育红 何国斌 赵红宇 韩萌 裴迎宾 李新明 石爱梅
单位：姜育红 何国斌(河南医科大学口腔系 郑州 450052)；赵红宇 裴迎宾 李新明 石爱梅(河南医科大学第一附属医院口腔科 郑州 450005)；韩萌(郑州市口腔医院口腔科 郑州 450003)
关键词：单纯增生；不典型增生；鳞状细胞癌；口腔粘膜；白斑；bcl-2蛋白；P21wafl蛋白
河南医科大学学报000326 摘要 目的：探讨口腔粘膜白斑发生发展中bcl-2及P21wafl蛋白的表达。方法：利用免疫组织化学技术对13例正常口腔糊膜、39例口腔粘膜白斑及46例不同分级鳞癌的bcl-2、P21wafl蛋白表达进行研究。结果：正常口腔粘膜bcl-2均呈阴性，不典型增生性白斑bcl-2蛋白阳性表达率为52.17%，显著高于单纯增生性白斑(18.75%)及Ⅰ、Ⅱ级口腔鳞状细胞癌(18.18%，22.22%，P<0.05)。正常口腔粘膜P21waf1蛋白表达均呈阳性。单纯增生性白斑P21waf1蛋白阳性表达率为75.00%，显著高于不典型增生性白斑(26.09%)(P<0.05)及口腔鳞状细胞癌(28.26%)(P<0.05)，而P21wafl蛋白表达率在不典型增生性白斑和鳞癌之间差异无显著性(P>0.05)。P21wafl阳性标本阳性细胞计数随组织恶性程度增加而有增高趋势。结论：bcl-2蛋白表达在口腔粘膜恶性变的较早阶段起主要作用。P21waf1表达的下调是口腔白斑发生发展中的较早期事件，P21waf1表达率综合P21waf1阳性细胞计数在口腔粘膜白斑恶变潜能评价方面是一项有用的指标。
, 百拇医药
分类号 R782
Expression of bcl-2 protein and P21waf1 protein during the occurrence and development of oral mucosa leukoplakia.
JIANG Yuhong， HE Guobin，( Department of Stomatology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
ZHAO Hongyu，PEI Yingbin， LI Xinming，SHI Aimei
(Department of Stomatology, the First Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
, 百拇医药
HAN Meng，(Department of Stomatology, the Zhengzhou Oral Hospital, Zhengzhou 450052)
Abstract Aim: To investigate the expressions of bcl-2 protein and P21wafl protein in the progression of oral mucosa leukoplakia. Methods:13 cases of normal oral mucosa,39 cases of oral mucosa leukoplakia(LK) and 46 cases of squamous cell cancer(SCC) were examined by using immunohistochemical method.Results: None of normal controls showed bcl-2 positive staning.positire expression rate of bcl-2 protein was significantly higher in LK with dysplasia (52.17%) than that in LK with simple hyperplasia (18.75%， P<0.05)and that in grade I,Ⅱof SCC (18.18%, 22.22%, P<0.05) . All of normal oral mucosa showed P21waf1 positive staining. P21waf1-positive rate in LK with simple hyperplasia was 75.00%, which was significantly higher than that in LK with dysplasia (26.09%, P<0.05) and in SCC (28.26%，P<0.05). However, there were no significant differences of P21wafl-positive rates among LK with dysplasia and SCC(P>0.05) P21wafl-positive cell counting showed a tendency to increase with the malignant progression of oral mucosa lesions.Conclusion:The Expression of bcl-2 protein plays main role in which oral mucosa may transform to malignancy. The down-regulation of P21wafl expression is an early event in occurrence and development of oral musosa LK. P21wafl-positive rate and P21waf1-positive cell counting combined can serve as a useful indicator for the assessment of malignant potential of oral LK.
, http://www.100md.com
Key words simple hyperplasia; dysplasia; squamous cell carcinoma; oral mucosa; leukoplakia; bcl-2 protein;P21waf1 protein
口腔粘膜白斑(Oral Leukoplakia, OLK)为癌前病变，与口腔鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma, SCC)发生关系密切，约有3%～5%的OLK最终可发展为口腔SCC。目前认为肿瘤的发生是一个多阶段的过程，是一系列细胞遗传物质改变的结果[1]。肿瘤的发生不仅与肿瘤细胞增殖调控失调有关，而且也与肿瘤细胞的程序性死亡即凋亡受阻有关[2]。为探讨OLK发生发展过程中bcl-2、P21waf1蛋白的表达，作者选择OLK及口腔SCC作为研究对象，利用免疫组化技术分别检测bcl-2、P21waf1蛋白的表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本 河南医科大学第一附属医院病理科存档的蜡块。OLK 39例，其中单纯增生性白斑16例，不典型增生性白斑23例。不同分级的口腔SCC 46例。口腔整形手术中切取的13例正常口腔粘膜作为正常对照。
1.2 试剂与方法 鼠抗人bcl-2蛋白单抗及P21waf1蛋白单抗(Santa Cruz公司产品)及SP试剂盒(ZYMED公司产品)均购自北京中山生物技术公司。免疫组化染色步骤按SP试剂盒说明，每批染色均设立阳性及阴性对照。
1.3 结果判定 bcl-2阳性为胞浆着色，细胞胞浆被染成棕黄色。P21wafl蛋白染色以细胞核和(或)细胞浆被染成棕黄色，为P21wafl阳性细胞。以阳性细胞数大于5%的标本为阳性标本。阳性细胞计数为阳性细胞占总细胞计数百分率。各组标本的bcl-2及P21waf1蛋白表达阳性率以χ2检验或四格表确切概率法统计处理。P21waf1阳性细胞计数以
±s表示，用t检验处理。
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2 结果
2.1 OLK及SCC中bcl-2、P21wafl的表达 见表1。
表1 口腔OLK及SCC中bcl-2、P21wafl的表达 组织类型
例数
Bcl-2(+)
(%)
P21wafl(+)
(%)
P21wafl阳性细胞计数
正常对照
, http://www.100md.com
13
0(0)
13(100)
15.24±2.18
单纯增生性白斑
16
3(18.75a)
12(75.00a*)
16.27±1.88c*
不典型增生性白斑
23
, http://www.100md.com 12(52.17b)
6(26.09a*)
37.26±2.31c*
鳞癌
46
14(30.43c)
13(28.26)
46.88±4.97c*
Ⅰ
22
4(18.18d)
, http://www.100md.com
8(36.36d*)
46.15±3.69b*
Ⅱ
9
2(22.22e)
3(33.33d*)
47.25±4.07b*
Ⅲ
15
8(53.33f)
2(13.33d*)
, http://www.100md.com
49.25±11.47b*
“a*”两组间P<0.01；“c*”两组间P<0.05；b与a,b与c,b与d,b与e,d与f间相比P<0.05；“b*”两组间P>0.05；“d*”两组间P>0.05；a与c,e与f,b与f间P>0.05；
2.2 OLK及SCC中bcl-2、P21waf1的分布特征 正常口腔粘膜bcl-2均呈阴性。3例bcl-2阳性的口腔粘膜单纯增生性白斑，其中2例bcl-2阳性细胞遍布角质层以下的上皮各层，阴性细胞少见，另1例阳性细胞则较少，主要位于上皮下1/3区域。不典型增生性白斑与单纯增生性白斑阳性细胞分布特征相似。口腔SCC bcl-2阳性细胞可见于癌巢全层，但数量变化不一，着色程度呈现异质性变化。P21waf1在正常口腔粘膜表达全部为阳性，阳性细胞主要分布在上皮基底层以上数层细胞间，基底细胞偶呈阳性。单纯增生性白斑的阳性细胞分布及数量与正常口腔粘膜相似。不典型增生性白斑阳性细胞数量明显多于口腔粘膜单纯增生性白斑(P<0.05)，分布范围较广。口腔SCC阳性细胞计数显著高于不典型增生性白斑，阳性细胞主要分布于接近癌巢周边区。
, 百拇医药
3 讨论
bcl-2基因是Tsujimoto等[3]在研究B细胞白血病和非何杰金滤泡性淋巴瘤中高发的t(14；18)染色体易位时发现的。最初的研究表明bcl-2在许多B细胞恶性肿瘤中表达，可阻断淋巴细胞的凋亡过程，促进增殖细胞的存活，从而导致恶性淋巴瘤的发生。最近研究表明bcl-2在一些非造血系统恶性肿瘤如前列腺癌、大肠癌、食管癌、鼻咽癌和肺癌等中也有bcl-2蛋白的过表达，因此，bcl-2基因是一种广义的抗凋亡基因，可导致各种肿瘤的发生。最近有证据表明bcl-2蛋白过表达在口腔SCC的发生发展中起重要作用[4]。本实验13例正常口腔粘膜bcl-2蛋白表达均为阴性。这一结果提示在生理状态下口腔上皮细胞bcl-2蛋白含量极微，可能参与了上皮干细胞的增殖，分化的生理调节，在防止基底干细胞的成熟和分化，保持其持续的分裂增殖能力方面起重要作用。
OLK被公认是一种癌前病变，因具有癌变潜能而倍受关注。而上皮异常增生则代表癌性生长的起始。本实验结果显示不典型增生性OLK，bcl-2蛋白表达率明显高于单纯增生性OLK(P<0.05)，也显著高于分化较好的Ⅰ、Ⅱ级SCC(P<0.05)，提示bcl-2蛋白高表达在口腔粘膜恶性变的较早阶段起主要作用。现已明确口腔上皮角质形成细胞的分化成熟过程实际上是一个自我凋亡过程[5]，bcl-2是否正是抑制这一过程而使口腔粘膜上皮恶性变，这尚需证实。本实验结果还提示，bcl-2蛋白表达的检测有助于筛选高危口腔粘膜白斑，也可用于OLK恶变的评估。
, 百拇医药
P21waf1蛋白是一种细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白。细胞DNA损伤时，野生型P53蛋白作为转录因子启动P21waf1表达，P21waf1蛋白则通过对细胞周期依赖性激酶CDK活性的抑制，使细胞停滞在G1期，有利于损伤DNA修复。P21waf1基因在全身各组织恶性肿瘤中很少突变[6]。目前P21waf1蛋白作为一种重要的细胞周期调控蛋白而极受关注。本实验结果显示，口腔不典型增生性白斑P21waf1的表达率显著低于单纯增生性白斑及正常口腔粘膜(P<0.05)，但与口腔SCC之间无明显差别(P>0.05)，说明P21waf1表达的下调可能与口腔上皮癌前病变阶段的发生发展有关。而P21waf1阳性标本阳性细胞计数有随组织恶性程度增高而增高的趋势，且各组间差异有显著性(P<0.01)，这可能是由于上皮良恶性组织具有不同的细胞增殖活性。结果提示，P21waf1蛋白表达率综合P21waf1阳性细胞计数在口腔粘膜白斑恶变的评价方面是一项有用的指标，通过对这2项指标的监测，可评价白斑的恶变潜能，有利于口腔SCC的早发现、早诊断、早治疗。
, 百拇医药
基金项目：河南省教委科技攻关资助项目 9881170807
研究方向：口腔粘膜白斑发病机制及进展
作者简介：姜育红，女，34岁 ，硕士，参考文献
[1]Bishop JM. Molecular themes in oncogene. Cell, 1991; 64:235
[2]Williams GT, Smith CA. Molecular regulation of apoptosis genetic controls on cell death. Cell, 1993; 74:777
[3]Tsujimoto Y, Reed JC, Alpers JD, et al. Regulation of bcl-2 proto-oncogene expression during normal human lymphocyte proliferation. Science, 1984, 236:1 295
, 百拇医药
[4]Singh BB, Chandler FW, Whitaker SB, et al. Immunohistochemical evalution of bcl-2 oncoprotein in oral dysplasia and carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, 1998;85(6):692
[5]Harada H, Mitsuyasu T, Seta Y, et al. Overexpression of bcl0-2 protein inhibits terminal differentiation of oral keratinocytes in vitro. J Oral Pathol Med, 1998; 27:11
[6]Shiohara BM, EL-Deiry WS, Wada M, et al. Absence of WAFl mutation in a variety of human malignancies. Blood, 1994;84:3 781
1999-10-15收稿, 百拇医药
单位：姜育红 何国斌(河南医科大学口腔系 郑州 450052)；赵红宇 裴迎宾 李新明 石爱梅(河南医科大学第一附属医院口腔科 郑州 450005)；韩萌(郑州市口腔医院口腔科 郑州 450003)
关键词：单纯增生；不典型增生；鳞状细胞癌；口腔粘膜；白斑；bcl-2蛋白；P21wafl蛋白
河南医科大学学报000326 摘要 目的：探讨口腔粘膜白斑发生发展中bcl-2及P21wafl蛋白的表达。方法：利用免疫组织化学技术对13例正常口腔糊膜、39例口腔粘膜白斑及46例不同分级鳞癌的bcl-2、P21wafl蛋白表达进行研究。结果：正常口腔粘膜bcl-2均呈阴性，不典型增生性白斑bcl-2蛋白阳性表达率为52.17%，显著高于单纯增生性白斑(18.75%)及Ⅰ、Ⅱ级口腔鳞状细胞癌(18.18%，22.22%，P<0.05)。正常口腔粘膜P21waf1蛋白表达均呈阳性。单纯增生性白斑P21waf1蛋白阳性表达率为75.00%，显著高于不典型增生性白斑(26.09%)(P<0.05)及口腔鳞状细胞癌(28.26%)(P<0.05)，而P21wafl蛋白表达率在不典型增生性白斑和鳞癌之间差异无显著性(P>0.05)。P21wafl阳性标本阳性细胞计数随组织恶性程度增加而有增高趋势。结论：bcl-2蛋白表达在口腔粘膜恶性变的较早阶段起主要作用。P21waf1表达的下调是口腔白斑发生发展中的较早期事件，P21waf1表达率综合P21waf1阳性细胞计数在口腔粘膜白斑恶变潜能评价方面是一项有用的指标。
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分类号 R782
Expression of bcl-2 protein and P21waf1 protein during the occurrence and development of oral mucosa leukoplakia.
JIANG Yuhong， HE Guobin，( Department of Stomatology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
ZHAO Hongyu，PEI Yingbin， LI Xinming，SHI Aimei
(Department of Stomatology, the First Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
, 百拇医药
HAN Meng，(Department of Stomatology, the Zhengzhou Oral Hospital, Zhengzhou 450052)
Abstract Aim: To investigate the expressions of bcl-2 protein and P21wafl protein in the progression of oral mucosa leukoplakia. Methods:13 cases of normal oral mucosa,39 cases of oral mucosa leukoplakia(LK) and 46 cases of squamous cell cancer(SCC) were examined by using immunohistochemical method.Results: None of normal controls showed bcl-2 positive staning.positire expression rate of bcl-2 protein was significantly higher in LK with dysplasia (52.17%) than that in LK with simple hyperplasia (18.75%， P<0.05)and that in grade I,Ⅱof SCC (18.18%, 22.22%, P<0.05) . All of normal oral mucosa showed P21waf1 positive staining. P21waf1-positive rate in LK with simple hyperplasia was 75.00%, which was significantly higher than that in LK with dysplasia (26.09%, P<0.05) and in SCC (28.26%，P<0.05). However, there were no significant differences of P21wafl-positive rates among LK with dysplasia and SCC(P>0.05) P21wafl-positive cell counting showed a tendency to increase with the malignant progression of oral mucosa lesions.Conclusion:The Expression of bcl-2 protein plays main role in which oral mucosa may transform to malignancy. The down-regulation of P21wafl expression is an early event in occurrence and development of oral musosa LK. P21wafl-positive rate and P21waf1-positive cell counting combined can serve as a useful indicator for the assessment of malignant potential of oral LK.
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Key words simple hyperplasia; dysplasia; squamous cell carcinoma; oral mucosa; leukoplakia; bcl-2 protein;P21waf1 protein
口腔粘膜白斑(Oral Leukoplakia, OLK)为癌前病变，与口腔鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma, SCC)发生关系密切，约有3%～5%的OLK最终可发展为口腔SCC。目前认为肿瘤的发生是一个多阶段的过程，是一系列细胞遗传物质改变的结果[1]。肿瘤的发生不仅与肿瘤细胞增殖调控失调有关，而且也与肿瘤细胞的程序性死亡即凋亡受阻有关[2]。为探讨OLK发生发展过程中bcl-2、P21waf1蛋白的表达，作者选择OLK及口腔SCC作为研究对象，利用免疫组化技术分别检测bcl-2、P21waf1蛋白的表达。
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1 材料与方法
1.1 标本 河南医科大学第一附属医院病理科存档的蜡块。OLK 39例，其中单纯增生性白斑16例，不典型增生性白斑23例。不同分级的口腔SCC 46例。口腔整形手术中切取的13例正常口腔粘膜作为正常对照。
1.2 试剂与方法 鼠抗人bcl-2蛋白单抗及P21waf1蛋白单抗(Santa Cruz公司产品)及SP试剂盒(ZYMED公司产品)均购自北京中山生物技术公司。免疫组化染色步骤按SP试剂盒说明，每批染色均设立阳性及阴性对照。
1.3 结果判定 bcl-2阳性为胞浆着色，细胞胞浆被染成棕黄色。P21wafl蛋白染色以细胞核和(或)细胞浆被染成棕黄色，为P21wafl阳性细胞。以阳性细胞数大于5%的标本为阳性标本。阳性细胞计数为阳性细胞占总细胞计数百分率。各组标本的bcl-2及P21waf1蛋白表达阳性率以χ2检验或四格表确切概率法统计处理。P21waf1阳性细胞计数以
±s表示，用t检验处理。, 百拇医药
2 结果
2.1 OLK及SCC中bcl-2、P21wafl的表达 见表1。
表1 口腔OLK及SCC中bcl-2、P21wafl的表达 组织类型
例数
Bcl-2(+)
(%)
P21wafl(+)
(%)
P21wafl阳性细胞计数
正常对照
, http://www.100md.com
13
0(0)
13(100)
15.24±2.18
单纯增生性白斑
16
3(18.75a)
12(75.00a*)
16.27±1.88c*
不典型增生性白斑
23
, http://www.100md.com 12(52.17b)
6(26.09a*)
37.26±2.31c*
鳞癌
46
14(30.43c)
13(28.26)
46.88±4.97c*
Ⅰ
22
4(18.18d)
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8(36.36d*)
46.15±3.69b*
Ⅱ
9
2(22.22e)
3(33.33d*)
47.25±4.07b*
Ⅲ
15
8(53.33f)
2(13.33d*)
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49.25±11.47b*
“a*”两组间P<0.01；“c*”两组间P<0.05；b与a,b与c,b与d,b与e,d与f间相比P<0.05；“b*”两组间P>0.05；“d*”两组间P>0.05；a与c,e与f,b与f间P>0.05；
2.2 OLK及SCC中bcl-2、P21waf1的分布特征 正常口腔粘膜bcl-2均呈阴性。3例bcl-2阳性的口腔粘膜单纯增生性白斑，其中2例bcl-2阳性细胞遍布角质层以下的上皮各层，阴性细胞少见，另1例阳性细胞则较少，主要位于上皮下1/3区域。不典型增生性白斑与单纯增生性白斑阳性细胞分布特征相似。口腔SCC bcl-2阳性细胞可见于癌巢全层，但数量变化不一，着色程度呈现异质性变化。P21waf1在正常口腔粘膜表达全部为阳性，阳性细胞主要分布在上皮基底层以上数层细胞间，基底细胞偶呈阳性。单纯增生性白斑的阳性细胞分布及数量与正常口腔粘膜相似。不典型增生性白斑阳性细胞数量明显多于口腔粘膜单纯增生性白斑(P<0.05)，分布范围较广。口腔SCC阳性细胞计数显著高于不典型增生性白斑，阳性细胞主要分布于接近癌巢周边区。
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3 讨论
bcl-2基因是Tsujimoto等[3]在研究B细胞白血病和非何杰金滤泡性淋巴瘤中高发的t(14；18)染色体易位时发现的。最初的研究表明bcl-2在许多B细胞恶性肿瘤中表达，可阻断淋巴细胞的凋亡过程，促进增殖细胞的存活，从而导致恶性淋巴瘤的发生。最近研究表明bcl-2在一些非造血系统恶性肿瘤如前列腺癌、大肠癌、食管癌、鼻咽癌和肺癌等中也有bcl-2蛋白的过表达，因此，bcl-2基因是一种广义的抗凋亡基因，可导致各种肿瘤的发生。最近有证据表明bcl-2蛋白过表达在口腔SCC的发生发展中起重要作用[4]。本实验13例正常口腔粘膜bcl-2蛋白表达均为阴性。这一结果提示在生理状态下口腔上皮细胞bcl-2蛋白含量极微，可能参与了上皮干细胞的增殖，分化的生理调节，在防止基底干细胞的成熟和分化，保持其持续的分裂增殖能力方面起重要作用。
OLK被公认是一种癌前病变，因具有癌变潜能而倍受关注。而上皮异常增生则代表癌性生长的起始。本实验结果显示不典型增生性OLK，bcl-2蛋白表达率明显高于单纯增生性OLK(P<0.05)，也显著高于分化较好的Ⅰ、Ⅱ级SCC(P<0.05)，提示bcl-2蛋白高表达在口腔粘膜恶性变的较早阶段起主要作用。现已明确口腔上皮角质形成细胞的分化成熟过程实际上是一个自我凋亡过程[5]，bcl-2是否正是抑制这一过程而使口腔粘膜上皮恶性变，这尚需证实。本实验结果还提示，bcl-2蛋白表达的检测有助于筛选高危口腔粘膜白斑，也可用于OLK恶变的评估。
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P21waf1蛋白是一种细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白。细胞DNA损伤时，野生型P53蛋白作为转录因子启动P21waf1表达，P21waf1蛋白则通过对细胞周期依赖性激酶CDK活性的抑制，使细胞停滞在G1期，有利于损伤DNA修复。P21waf1基因在全身各组织恶性肿瘤中很少突变[6]。目前P21waf1蛋白作为一种重要的细胞周期调控蛋白而极受关注。本实验结果显示，口腔不典型增生性白斑P21waf1的表达率显著低于单纯增生性白斑及正常口腔粘膜(P<0.05)，但与口腔SCC之间无明显差别(P>0.05)，说明P21waf1表达的下调可能与口腔上皮癌前病变阶段的发生发展有关。而P21waf1阳性标本阳性细胞计数有随组织恶性程度增高而增高的趋势，且各组间差异有显著性(P<0.01)，这可能是由于上皮良恶性组织具有不同的细胞增殖活性。结果提示，P21waf1蛋白表达率综合P21waf1阳性细胞计数在口腔粘膜白斑恶变的评价方面是一项有用的指标，通过对这2项指标的监测，可评价白斑的恶变潜能，有利于口腔SCC的早发现、早诊断、早治疗。
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基金项目：河南省教委科技攻关资助项目 9881170807
研究方向：口腔粘膜白斑发病机制及进展
作者简介：姜育红，女，34岁 ，硕士，参考文献
[1]Bishop JM. Molecular themes in oncogene. Cell, 1991; 64:235
[2]Williams GT, Smith CA. Molecular regulation of apoptosis genetic controls on cell death. Cell, 1993; 74:777
[3]Tsujimoto Y, Reed JC, Alpers JD, et al. Regulation of bcl-2 proto-oncogene expression during normal human lymphocyte proliferation. Science, 1984, 236:1 295
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[4]Singh BB, Chandler FW, Whitaker SB, et al. Immunohistochemical evalution of bcl-2 oncoprotein in oral dysplasia and carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, 1998;85(6):692
[5]Harada H, Mitsuyasu T, Seta Y, et al. Overexpression of bcl0-2 protein inhibits terminal differentiation of oral keratinocytes in vitro. J Oral Pathol Med, 1998; 27:11
[6]Shiohara BM, EL-Deiry WS, Wada M, et al. Absence of WAFl mutation in a variety of human malignancies. Blood, 1994;84:3 781
1999-10-15收稿, 百拇医药