反相高效液相色谱法测定杜仲中京尼平苷、京尼平苷酸及绿原酸的含量
作者：戚向阳 陈维军 张声华
单位：戚向阳 陈维军 张声华(华中农业大学食科系 武汉 430070)
关键词：反相高效液相色谱法；杜仲；京尼平苷；京尼平苷酸；绿原酸
药物分析杂志000108 摘要 目的：建立同时测定杜仲中京尼平苷、京尼平苷酸及绿原酸的反相高效液相色谱法。方法：采用YWG-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,10 μm)，以甲醇-水-冰乙酸(19∶81∶1.5)为流动相，检测波长240 nm。结果：京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的加样回收率分别为90.8%～112.7%，102.8%～107.8%，91.6%～93.1%；精密度(RSD)分别为2.3%，1.7%，1.2%，n=5。结论：不同产地杜仲皮及叶中京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的含量相差很大。
A RP-HPLC Method for the Determination of Geniposide,Geniposidic Acid and Chlorogenic Acid in Eucommia ulmoides Oliv.
, http://www.100md.com
Qi Xiangyang Chen Weijun Zhang Shenghua
(Department of Food Science,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070)
Abstract：Objective：To establish a new RP-HPLC method for simultaneous determination of geniposide(GP),geniposidic acid(GA) and chlorogenic acid (CGA) in E.ulmoides Oliv.Method:GA,CGA and GP were analysed by using C18 column (250 mm×4.6 mm，10 μm)with detector at 240 nm,and the mobile phase consisting of CH3OH-H2O-CH3COOH(19∶81∶1.5).Results:The recoveries of GA,CGA and GP were 90.8%～112.7%，102.8%～107.8%，91.6%～93.1% and the precision(RSD)were 2.3%，1.7%，1.2%,n=5,respectively.Conclusion:Quantitative analysis showed that there were considerable difference of the content of GA,CGA and GP in the leaves and barks of E.ulmoides Oliv.from different growing areas.
, 百拇医药
Key words：RP-HPLC,E.ulmoides Oliv.,geniposide,geniposidic acid,chlorogenic acid▲
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)系杜仲科杜仲属植物，为我国名贵药材。具有消炎抑菌、补肾降压、增强免疫功能及抗癌、抗疲劳、抗衰老等多种药理作用，其中，京尼平苷(geniposide,GP)、京尼平苷酸(geniposidic acid,GA)及绿原酸(chlorogenic acid,CGA)为杜仲中重要的生物活性成分[1，2]。而目前对杜仲中这3种生物活性成分定量分析报道甚少[3～5]，作为杜仲的主产地，我国具有十分丰富的杜仲资源，为充分合理地开发利用杜仲资源，本文采用反相高效液相色谱法同时对杜仲皮、叶中京尼平苷、京尼平苷酸及绿原酸进行了定性、定量分析。方法简便、快速、准确，有助于杜仲产品的开发及质量评定。
1 仪器、样品与试剂
, 百拇医药
Shimadzu LC-6A高效液相色谱泵，SPD-6AV紫外检测器，C-R3A Chromatopac自动积分仪；YWG-G18色谱柱(250 mm×4.6 mm，10 μm，中国科学院大连化学物理研究所)。
杜仲皮、杜仲叶均采自湖北郧西县、通城县，经湖北中医学院陈绪伦教授鉴定为杜仲树皮、杜仲树叶。
甲醇、冰乙酸均为分析纯；京尼平苷酸、京尼平苷由日本Takeshi Deyama博士赠送，绿原酸由德国进口，纯度99%以上。
2 对照品溶液及样品溶液制备
2.1 对照品溶液的配制 准确称取各种对照品适量，用甲醇溶解后置于25 mL容量瓶，并稀释至刻度，配制成含京尼平苷酸0.099 mg.mL-1、绿原酸0.089 7 mg.mL-1、京尼平苷0.114 mg.mL-1的对照品混合溶液。
, 百拇医药
2.2 样品溶液的配制 准确称取样品粉末一定量，用10倍的水于40 ℃下浸提5次，每次30 min。合并水提取液，真空浓缩至一定体积后，用水定容至25 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤。
3 色谱条件
流动相：甲醇-水-冰乙酸(19∶81∶1.5)；检测波长：240 nm；柱温：室温；流速：1 mL.min-1；紫外检测器：0.04 AUFS；进样量：5 μL。
根据对照品的保留时间定性，按峰面积计算各组分的含量。
4 方法与结果
4.1 检测波长的选择 京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的对照品溶液的紫外分析结果表明，3种成分在240 nm左右均有较强的吸收，因此，选择240 nm为紫外检测波长。
, 百拇医药
4.2 流动相的选择 选用C18柱，用不同比例的甲醇-水为流动相进行分离，发现甲醇-水(19∶81)时，京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷可分离，但在中性溶剂系统中色谱峰有拖尾，主要是由于京尼平苷酸、绿原酸中的羧基、酚羟基产生电离，因而在固定相表面存在双保留机制，为此，在流动相中加入少量冰乙酸(pH 2.5)，使酚羟基及羧基的电离被抑制，改善峰形。故本文选定甲醇-水-冰乙酸(19∶81∶1.5)为流动相。杜仲样品与对照品的分析图谱见图1。
图1 杜仲样品与对照品的HPLC分析图谱
A.对照品 B.杜仲皮 C.杜仲叶
1.京尼平苷酸 2.绿原酸 3.京尼平苷
4.3 线性关系 将配制的对照品混合溶液依次进样2，5，10，15，20 μL，按上述色谱条件进行分析，京尼平苷酸、绿原酸和京尼平苷的回归方程分别为：
, 百拇医药
S=1 539 082.2C-49 387.5 r=0.999 9
S=1 191 940.0C-84 558 r=0.999 4
S=1 260 879.7C-85 234.4 r=0.999 9
其中C为进样量(μg)，S为峰面积(μV.s)。表明当京尼平苷酸、绿原酸和京尼平苷的进样量分别在0.198～1.98，0.179～1.794，0.228～2.280 μg范围内线性关系良好。
4.4 提取方法的选择 对同一批杜仲样品分别采用下列方法进行处理。a.甲醇热回流提取法：将5.0 g左右的杜仲皮粉末置于索氏提取器中，加氯仿60 mL加热回流6 h后，残渣再用甲醇60 mL加热回流提取一定时间(4，7，10 h)，甲醇提取液经真空浓缩后，用甲醇定容至25 mL。 b.溶剂浸提法：分别以水及20%，40%，60%，80%，100%的甲醇水溶液为提取溶液，每次取杜仲皮粉末约5.0 g，用溶剂50 mL于40 ℃下提取5次，每次30 min，提取溶液经过滤及真空浓缩后，用水定容至25 mL。
, 百拇医药
将制备的样品溶液按所选色谱条件进行HPLC分析，由测定结果可知，在其它条件一致的情况下，高浓度的甲醇溶液不利于京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的浸提，以水的浸提效果最佳。且以低温水作为浸提溶剂，分析成本低，安全无毒，并避免了甲醇热回流提取法中因高温长时间加热造成的绿原酸的损失，缩短了分析时间，因此，选用水浸提法对杜仲样品进行处理。
4.5 精密度的试验 对同一份杜仲样品平行测定5次，京尼平苷酸、京尼平苷及绿原酸含量的RSD分别为2.3%，1.2%，1.7%，n=5。
4.6 回收率试验 取已测定含量的样品1.500 0g，加入一定量的混合对照品溶液进行回收率测定，结果见表1。
表1 回收率测定结果(n=3) 组分
添加量/mg
平均回收率/%
, http://www.100md.com
RSD/%
京尼平苷酸
0.0495
112.7
3.3
0.198
91.6
4.0
0.396
90.8
3.4
绿原酸
0.0449
, 百拇医药
102.8
1.9
0.179
107.8
2.6
0.359
103.3
0.7
京尼平苷
0.0570
91.6
1.6
0.228
, http://www.100md.com
93.1
2.1
0.456
92.2
2.9
4.7 样品测定 根据上述的水浸提法制备样品溶液，按本文色谱条件测定了湖北郧西及通城的杜仲皮、叶，结果见表2。实验结果表明，不同产地的杜仲皮及叶中京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的含量差异很大，且同一产地的杜仲皮、叶中这3种成分的含量有一定的互补性，杜仲叶中富含杜仲皮中含量较少的绿原酸，但其京尼平苷酸的含量却远远低于杜仲皮，且未检出京尼平苷。因此，不能简单地以叶代皮。表2 样品的测定(mg.g-1，n=3) 样品
京尼平苷酸
, 百拇医药 绿原酸
京尼平苷
郧西杜仲皮
2.687
0.217
0.0736
郧西杜仲叶
0.449
10.03
—
通城杜仲皮
3.429
0.317
, 百拇医药
0.236
通城杜仲叶
1.240
9.753
—
注：“—”表示未检出
5 结论
实验结果表明，采用C18柱，以甲醇-水-冰乙酸(19∶81∶1.5)为流动相可同时分析杜仲中京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的含量。本实验选用的水浸提法较传统的回流提取法提取效率明显提高[3，5]，尤其适合热敏成分的提取。为评定杜仲及杜仲制品的质量提供了可靠的测定方法。
参考文献：
, 百拇医药
[1]张康健，张檀编.中国神树—杜仲.第一版.北京：经济管理出版社，1997.1
[2]肖崇厚主编.中药化学.第一版.上海：上海科学技术出版社，1987.396
[3]孟芹，吴孝林，曹桂华.杜仲原生皮和再生皮质量对比分析.中草药，1994，25(7)：350
[4]张风云,毛富春，张康健.毛细管电泳法筛选提取杜仲叶中绿原酸的方法.西北药学杂志，1996，11(2)：66
[5]张风云，毛富春，张康健等.杜仲叶中绿原酸的测定方法比较.西北林学院学报，1996，11(2)：54
收稿日期：1998-10-09, 百拇医药
单位：戚向阳 陈维军 张声华(华中农业大学食科系 武汉 430070)
关键词：反相高效液相色谱法；杜仲；京尼平苷；京尼平苷酸；绿原酸
药物分析杂志000108 摘要 目的：建立同时测定杜仲中京尼平苷、京尼平苷酸及绿原酸的反相高效液相色谱法。方法：采用YWG-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,10 μm)，以甲醇-水-冰乙酸(19∶81∶1.5)为流动相，检测波长240 nm。结果：京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的加样回收率分别为90.8%～112.7%，102.8%～107.8%，91.6%～93.1%；精密度(RSD)分别为2.3%，1.7%，1.2%，n=5。结论：不同产地杜仲皮及叶中京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的含量相差很大。
A RP-HPLC Method for the Determination of Geniposide,Geniposidic Acid and Chlorogenic Acid in Eucommia ulmoides Oliv.
, http://www.100md.com
Qi Xiangyang Chen Weijun Zhang Shenghua
(Department of Food Science,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070)
Abstract：Objective：To establish a new RP-HPLC method for simultaneous determination of geniposide(GP),geniposidic acid(GA) and chlorogenic acid (CGA) in E.ulmoides Oliv.Method:GA,CGA and GP were analysed by using C18 column (250 mm×4.6 mm，10 μm)with detector at 240 nm,and the mobile phase consisting of CH3OH-H2O-CH3COOH(19∶81∶1.5).Results:The recoveries of GA,CGA and GP were 90.8%～112.7%，102.8%～107.8%，91.6%～93.1% and the precision(RSD)were 2.3%，1.7%，1.2%,n=5,respectively.Conclusion:Quantitative analysis showed that there were considerable difference of the content of GA,CGA and GP in the leaves and barks of E.ulmoides Oliv.from different growing areas.
, 百拇医药
Key words：RP-HPLC,E.ulmoides Oliv.,geniposide,geniposidic acid,chlorogenic acid▲
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)系杜仲科杜仲属植物，为我国名贵药材。具有消炎抑菌、补肾降压、增强免疫功能及抗癌、抗疲劳、抗衰老等多种药理作用，其中，京尼平苷(geniposide,GP)、京尼平苷酸(geniposidic acid,GA)及绿原酸(chlorogenic acid,CGA)为杜仲中重要的生物活性成分[1，2]。而目前对杜仲中这3种生物活性成分定量分析报道甚少[3～5]，作为杜仲的主产地，我国具有十分丰富的杜仲资源，为充分合理地开发利用杜仲资源，本文采用反相高效液相色谱法同时对杜仲皮、叶中京尼平苷、京尼平苷酸及绿原酸进行了定性、定量分析。方法简便、快速、准确，有助于杜仲产品的开发及质量评定。
1 仪器、样品与试剂
, 百拇医药
Shimadzu LC-6A高效液相色谱泵，SPD-6AV紫外检测器，C-R3A Chromatopac自动积分仪；YWG-G18色谱柱(250 mm×4.6 mm，10 μm，中国科学院大连化学物理研究所)。
杜仲皮、杜仲叶均采自湖北郧西县、通城县，经湖北中医学院陈绪伦教授鉴定为杜仲树皮、杜仲树叶。
甲醇、冰乙酸均为分析纯；京尼平苷酸、京尼平苷由日本Takeshi Deyama博士赠送，绿原酸由德国进口，纯度99%以上。
2 对照品溶液及样品溶液制备
2.1 对照品溶液的配制 准确称取各种对照品适量，用甲醇溶解后置于25 mL容量瓶，并稀释至刻度，配制成含京尼平苷酸0.099 mg.mL-1、绿原酸0.089 7 mg.mL-1、京尼平苷0.114 mg.mL-1的对照品混合溶液。
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2.2 样品溶液的配制 准确称取样品粉末一定量，用10倍的水于40 ℃下浸提5次，每次30 min。合并水提取液，真空浓缩至一定体积后，用水定容至25 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤。
3 色谱条件
流动相：甲醇-水-冰乙酸(19∶81∶1.5)；检测波长：240 nm；柱温：室温；流速：1 mL.min-1；紫外检测器：0.04 AUFS；进样量：5 μL。
根据对照品的保留时间定性，按峰面积计算各组分的含量。
4 方法与结果
4.1 检测波长的选择 京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的对照品溶液的紫外分析结果表明，3种成分在240 nm左右均有较强的吸收，因此，选择240 nm为紫外检测波长。
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4.2 流动相的选择 选用C18柱，用不同比例的甲醇-水为流动相进行分离，发现甲醇-水(19∶81)时，京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷可分离，但在中性溶剂系统中色谱峰有拖尾，主要是由于京尼平苷酸、绿原酸中的羧基、酚羟基产生电离，因而在固定相表面存在双保留机制，为此，在流动相中加入少量冰乙酸(pH 2.5)，使酚羟基及羧基的电离被抑制，改善峰形。故本文选定甲醇-水-冰乙酸(19∶81∶1.5)为流动相。杜仲样品与对照品的分析图谱见图1。
图1 杜仲样品与对照品的HPLC分析图谱
A.对照品 B.杜仲皮 C.杜仲叶
1.京尼平苷酸 2.绿原酸 3.京尼平苷
4.3 线性关系 将配制的对照品混合溶液依次进样2，5，10，15，20 μL，按上述色谱条件进行分析，京尼平苷酸、绿原酸和京尼平苷的回归方程分别为：
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S=1 539 082.2C-49 387.5 r=0.999 9
S=1 191 940.0C-84 558 r=0.999 4
S=1 260 879.7C-85 234.4 r=0.999 9
其中C为进样量(μg)，S为峰面积(μV.s)。表明当京尼平苷酸、绿原酸和京尼平苷的进样量分别在0.198～1.98，0.179～1.794，0.228～2.280 μg范围内线性关系良好。
4.4 提取方法的选择 对同一批杜仲样品分别采用下列方法进行处理。a.甲醇热回流提取法：将5.0 g左右的杜仲皮粉末置于索氏提取器中，加氯仿60 mL加热回流6 h后，残渣再用甲醇60 mL加热回流提取一定时间(4，7，10 h)，甲醇提取液经真空浓缩后，用甲醇定容至25 mL。 b.溶剂浸提法：分别以水及20%，40%，60%，80%，100%的甲醇水溶液为提取溶液，每次取杜仲皮粉末约5.0 g，用溶剂50 mL于40 ℃下提取5次，每次30 min，提取溶液经过滤及真空浓缩后，用水定容至25 mL。
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将制备的样品溶液按所选色谱条件进行HPLC分析，由测定结果可知，在其它条件一致的情况下，高浓度的甲醇溶液不利于京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的浸提，以水的浸提效果最佳。且以低温水作为浸提溶剂，分析成本低，安全无毒，并避免了甲醇热回流提取法中因高温长时间加热造成的绿原酸的损失，缩短了分析时间，因此，选用水浸提法对杜仲样品进行处理。
4.5 精密度的试验 对同一份杜仲样品平行测定5次，京尼平苷酸、京尼平苷及绿原酸含量的RSD分别为2.3%，1.2%，1.7%，n=5。
4.6 回收率试验 取已测定含量的样品1.500 0g，加入一定量的混合对照品溶液进行回收率测定，结果见表1。
表1 回收率测定结果(n=3) 组分
添加量/mg
平均回收率/%
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RSD/%
京尼平苷酸
0.0495
112.7
3.3
0.198
91.6
4.0
0.396
90.8
3.4
绿原酸
0.0449
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102.8
1.9
0.179
107.8
2.6
0.359
103.3
0.7
京尼平苷
0.0570
91.6
1.6
0.228
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93.1
2.1
0.456
92.2
2.9
4.7 样品测定 根据上述的水浸提法制备样品溶液，按本文色谱条件测定了湖北郧西及通城的杜仲皮、叶，结果见表2。实验结果表明，不同产地的杜仲皮及叶中京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的含量差异很大，且同一产地的杜仲皮、叶中这3种成分的含量有一定的互补性，杜仲叶中富含杜仲皮中含量较少的绿原酸，但其京尼平苷酸的含量却远远低于杜仲皮，且未检出京尼平苷。因此，不能简单地以叶代皮。表2 样品的测定(mg.g-1，n=3) 样品
京尼平苷酸
, 百拇医药 绿原酸
京尼平苷
郧西杜仲皮
2.687
0.217
0.0736
郧西杜仲叶
0.449
10.03
—
通城杜仲皮
3.429
0.317
, 百拇医药
0.236
通城杜仲叶
1.240
9.753
—
注：“—”表示未检出
5 结论
实验结果表明，采用C18柱，以甲醇-水-冰乙酸(19∶81∶1.5)为流动相可同时分析杜仲中京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的含量。本实验选用的水浸提法较传统的回流提取法提取效率明显提高[3，5]，尤其适合热敏成分的提取。为评定杜仲及杜仲制品的质量提供了可靠的测定方法。
参考文献：
, 百拇医药
[1]张康健，张檀编.中国神树—杜仲.第一版.北京：经济管理出版社，1997.1
[2]肖崇厚主编.中药化学.第一版.上海：上海科学技术出版社，1987.396
[3]孟芹，吴孝林，曹桂华.杜仲原生皮和再生皮质量对比分析.中草药，1994，25(7)：350
[4]张风云,毛富春，张康健.毛细管电泳法筛选提取杜仲叶中绿原酸的方法.西北药学杂志，1996，11(2)：66
[5]张风云，毛富春，张康健等.杜仲叶中绿原酸的测定方法比较.西北林学院学报，1996，11(2)：54
收稿日期：1998-10-09, 百拇医药