一种适合基层单位使用的超氧阴离子检测法
作者：姚余有 周爱武 李常玉
单位：安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230022
关键词：自由基；分析；超氧化物类；分析
安徽医科大学学报990225 中国图书资料分类法分类号 R340.5
超氧阴离子
是氧自由基的主要成份，现代医学证实其与心脏病、糖尿病、自身免疫性疾病有关〔1〕。故药物的抗能力将预示其可能有改善上述疾病病情的作用。目前，测量的方法主要有化学发光法和电子自旋捕获法〔2〕，以上两法需要化学发光仪或电子自旋捕获仪，不适合基层单位使用。为此我们进行了本研究。
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1 材料与方法
1.1 材料 黄嘌呤(X，AR级)，还原性辅酶Ⅰ(NADH，AR级)：上海东风生化试剂公司产品；黄嘌呤氧化酶(XO)：Sigma公司产品；硫酸甲酯吩嗪(phenazine methosulphate PMS,AR级)：Fluka公司产品；氯化硝基四唑氮蓝(NBT，AR级)：华美公司进口分装；Vit E(AR级)：Merck公司产品。
1.2 仪器 721分光光度计：上海第三分析仪器厂产品。
1.3 实验方法
1.3.1 X-XO体系产生的检测〔3〕
1.3.1.1 温度和反应时间对X-XO体系产生的影响。反应总体积2 ml，内含X 100 μmol.L-1、NBT 300 μmol.L-1、0.1 mol.L-1 PBS(pH 7.4)，分别于25℃、37℃、40℃预温5 min后，加入XO(14 U.L-1)起动反应，于560 nm处动态测量不同温度、不同时间吸光度(A)值。A值反映NBT还原量，间接反映产生量。
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1.3.1.2 NBT浓度对X-XO体系产生检测的影响。反应总体积2 ml，内含X 100 μmol.L-1，不同浓度的NBT和0.1 mol.L-1 PBS(pH 7.4)，37℃预温5 min后加入XO(终浓度14 U.L-1)动态检测A值。
1.3.1.3 XO浓度对X-XO体系产生检测的影响。反应总体积2 ml，内含X 100 μmol.L-1，NBT 300 μmol.L-1和0.1 mol.L-1 PBS (pH 7.4)，37℃预温5 min后加入不同浓度XO，反应30 min后立即测定A值。
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1.3.2 非酶体系产生的检测
1.3.2.1 温度和反应时间对非酶体系产生的影响。反应总体积2 ml，内含NADH 78 μmol.L-1、NBT 50 μmol.L-1、0.1 mol.L-1PBS(pH 7.4)，分别于25℃、37℃、40℃预温5 min后，以PMS(10 μmol.L-1)起动反应，560 nm处动态观察A值。
1.3.2.2 NBT浓度对非酶体系产生检测的影响。反应总体积2 ml,内含NADH 78 μmol.L-1、不同浓度NBT和0.1 mol.L-1 PBS(pH 7.4)。预温5 min后，以PMS(10 μmol.L-1)起动反应，动态观察NBT浓度对A值的影响。
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1.3.2.3 PMS浓度对非酶体系产生检测的影响。反应总体积2 ml，内含NADH 78 μmol.L-1、NBT 50 μmol.L-1和0.1 mol.L-1 PBS(pH 7.4)。37℃预温5 min，以不同浓度PMS起动反应,10 min后立即测定A值。
2 结果
2.1 X-XO产生的检测
2.1.1 温度和反应时间对X-XO体系产生引起NBT还原的影响 将酶反应体系分别置于25℃、37℃、40℃ 3个环境中，并动态测定A值。结果表明：37℃环境中，X-XO体系产生引起NBT还原量明显高于25℃和40℃( t检验，P<0.01)。结果还表明37℃反应30 min,时间—吸光度曲线趋于平稳，且A值在0.5左右，提示37℃温育30 min测定A值较为合适。
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2.1.2 NBT浓度对X-XO体系产生检测的影响 向X-XO体系分别加入不同浓度NBT，并动态检测A值，结果表明：NBT 300 μmol.L-1组与NBT 150 μmol.L-1组A值明显不同(t检验，P<0.01)，但与NBT 600 μmol.L-1组无差别，提示当X浓度为100 μmol.L-1，XO浓度为14 U.L-1时，NBT浓度为300 μmol.L-1较合适。2.1.3 XO浓度对X-XO体系产生检测的影响 按图1分组，结果显示：A值随XO浓度的上升而迅速增加，但当XO浓度增到28 U.L-1后曲线趋于平稳。
图1 XO浓度对X-XO体系产生检测的影响
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反应总体积2 ml，内含X 100 μmol.L-1、NBT 300 μmol.L-1及PBS，用不同浓度XO启动反应，37℃，30 min后测A值。n=4。与XO 7 U.L-1组相比：**P<0.01；与XO 28 U.L-1组相比：＃＃P<0.01
2.2 非酶体系产生的检测
2.2.1 温度和反应时间对非酶体系产生引起NBT还原的影响 按上法将非酶体系分别置于25℃、37℃、40℃环境中，动态测定A值。结果表明：37℃组NBT还原量明显高于25℃组(t检验，P<0.01) ，但与40℃组无差别，提示37℃环境下非酶体产生量高于25℃环境。结果还表明：在37℃条件下非酶体系反应10 min，时间—吸光度曲线趋向平稳，说明37℃、反应10 min测定A值较为适宜。
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2.2.2 NBT浓度对非酶体系产生检测的影响 向NADH-PMS反应体系中分别加入不同浓度NBT，结果表明：NBT 50 μmol.L-1组A值明显高于NBT 25 μmol.L-1组(t检验，P<0.01)，但与NBT 100 μmol.L-1组无差别。提示当NADH浓度为78 μmol.L-1，PMS浓度为10 μmol.L-1时，NBT浓度为50 μmol.L-1较为适宜。
2.2.3 PMS浓度对非酶体系产生检测的影响 按图2分组，结果显示：PMS 10 μmol.L-1与PMS 5 μmol.L-1组A值明显不同，但与20 μmol.L-1组差异较小。提示当NADH浓度为78 μmol.L-1，NBT浓度为50 μmol.L-1时，PMS浓度为10 μmol.L-1较合适。
图2 PMS浓度对非酶体系产生检测的影响
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反应总体积2 ml，内含NADH 78 μmol.L-1、NBT 50 μmol.L-1及PBS，用不同浓度PMS启动反应，37℃，10 min后测A值。n=4。与PMS 5 μmol.L-1相比：**P<0.01
2.3 测定方法间的比较 向酶体系(内含X 100 μmol.L-1，NBT 300 μmol.L-1，XO 14 U.L-1)和非酶体系(内含NADH 78 μmol.L-1，NBT 50 μmol.L-1，PMS 10 μmol.L-1)分别加入250 μmol.L-1和500 μmol.L-1两个不同浓度Vit E，37℃温育30 min(酶体系)或10 min(非酶体系)测定A值，结果显示两个不同浓度Vit E对酶体系产生抑制率为9.2%和11.2%，对非酶体系产生抑制率为8.3%和9.8%，与电子自旋捕获法测定结果9.4%十分相近。
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3 讨论
体内氧自由基可由多种途径产生，正常情况下氧自由基可调节花生四烯酸代谢，刺激吞噬细胞的杀菌功能以及免疫过程〔4〕。但氧自由基过多可引起组织细胞损伤和死亡，导致各种疾病〔1〕，是主要的氧自由基，故对进行检测将有着重要的意义。
本研究发现，37℃环境下X-XO体系产生量最多，且反应30 min，时间—吸光度曲线趋于稳定，故笔者认为：X-XO体系产生检测宜选用37℃反应30 min较为适宜。结果还显示当X浓度100 μmol.L-1、XO浓度为14 U.L-1时，NBT 300 μmol.L-1组与NBT 150 μmol.L-1组差异有显著性，但与NBT 600 μmol.L-1组无差别，提示在上述反应条件下NBT终浓度为300 μmol.L-1较为适宜。尽管结果显示XO 28 U.L-1组产生量明显高于XO 14 U.L-1组，但由于XO价格昂贵，且当XO浓度为14 U.L-1、37℃反应30 min时，A值已达0.5以上，故我们认为酶体系中XO浓度为14 U.L-1较妥。
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非酶体系产生模型主要用于探讨药物对是否有直接清除作用。本研究结果表明：37℃环境下，非酶体系产生明显高于25℃环境，但与40℃环境无差别，且反应10 min后时间—吸光度曲线趋于平稳，提示37℃反应10 min作为检测非酶体系产生条件较为适宜，且按结果NBT浓度选用50 μmol.L-1，PMS浓度选用10 μmol.L-1为佳。
Vit E为公认的抗氧化剂，用本方法测得Vit E对产生的抑制率与用电子自旋捕获法测得结果十分相近〔5〕，进一步证实了本实验方法的可靠性和实用性。
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作者简介：姚余有，男，32岁，硕士，讲师
参考文献
1 李文杰. 自由基与疾病. 见：方允中，李文杰主编. 自由基与酶. 北京：科学技术出版社，1989：193～230
2 张兆辉，余绍组，王镇涛. 四甲吡嗪对活性氧自由基的清除作用. 中国药理学报，1994；15(3)：229～231
3 Robak J, Gryglewski R J. Flavoids are scavenger of superoxide anion. Biochem Pharmacol,1988;37(5):837～841
4 李文杰. 自由基与疾病. 见：方允中，李文杰主编. 自由基与酶. 北京：科学技术出版社，1989:163～191
5 句海松，李小洁，赵保路. 沙棘总黄酮对活性氧自由基的清除作用. 中国药理学通报，1990；6(2)：97～100
1998-06-09收稿，1998-12-22修回, 百拇医药
单位：安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230022
关键词：自由基；分析；超氧化物类；分析
安徽医科大学学报990225 中国图书资料分类法分类号 R340.5
超氧阴离子
是氧自由基的主要成份，现代医学证实其与心脏病、糖尿病、自身免疫性疾病有关〔1〕。故药物的抗能力将预示其可能有改善上述疾病病情的作用。目前，测量的方法主要有化学发光法和电子自旋捕获法〔2〕，以上两法需要化学发光仪或电子自旋捕获仪，不适合基层单位使用。为此我们进行了本研究。, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 黄嘌呤(X，AR级)，还原性辅酶Ⅰ(NADH，AR级)：上海东风生化试剂公司产品；黄嘌呤氧化酶(XO)：Sigma公司产品；硫酸甲酯吩嗪(phenazine methosulphate PMS,AR级)：Fluka公司产品；氯化硝基四唑氮蓝(NBT，AR级)：华美公司进口分装；Vit E(AR级)：Merck公司产品。
1.2 仪器 721分光光度计：上海第三分析仪器厂产品。
1.3 实验方法
1.3.1 X-XO体系产生
的检测〔3〕1.3.1.1 温度和反应时间对X-XO体系产生
的影响。反应总体积2 ml，内含X 100 μmol.L-1、NBT 300 μmol.L-1、0.1 mol.L-1 PBS(pH 7.4)，分别于25℃、37℃、40℃预温5 min后，加入XO(14 U.L-1)起动反应，于560 nm处动态测量不同温度、不同时间吸光度(A)值。A值反映NBT还原量，间接反映产生量。, 百拇医药
1.3.1.2 NBT浓度对X-XO体系产生
检测的影响。反应总体积2 ml，内含X 100 μmol.L-1，不同浓度的NBT和0.1 mol.L-1 PBS(pH 7.4)，37℃预温5 min后加入XO(终浓度14 U.L-1)动态检测A值。1.3.1.3 XO浓度对X-XO体系产生
检测的影响。反应总体积2 ml，内含X 100 μmol.L-1，NBT 300 μmol.L-1和0.1 mol.L-1 PBS (pH 7.4)，37℃预温5 min后加入不同浓度XO，反应30 min后立即测定A值。, 百拇医药
1.3.2 非酶体系产生
的检测1.3.2.1 温度和反应时间对非酶体系产生
的影响。反应总体积2 ml，内含NADH 78 μmol.L-1、NBT 50 μmol.L-1、0.1 mol.L-1PBS(pH 7.4)，分别于25℃、37℃、40℃预温5 min后，以PMS(10 μmol.L-1)起动反应，560 nm处动态观察A值。1.3.2.2 NBT浓度对非酶体系产生
检测的影响。反应总体积2 ml,内含NADH 78 μmol.L-1、不同浓度NBT和0.1 mol.L-1 PBS(pH 7.4)。预温5 min后，以PMS(10 μmol.L-1)起动反应，动态观察NBT浓度对A值的影响。, http://www.100md.com
1.3.2.3 PMS浓度对非酶体系产生
检测的影响。反应总体积2 ml，内含NADH 78 μmol.L-1、NBT 50 μmol.L-1和0.1 mol.L-1 PBS(pH 7.4)。37℃预温5 min，以不同浓度PMS起动反应,10 min后立即测定A值。2 结果
2.1 X-XO产生
的检测2.1.1 温度和反应时间对X-XO体系产生
引起NBT还原的影响 将酶反应体系分别置于25℃、37℃、40℃ 3个环境中，并动态测定A值。结果表明：37℃环境中，X-XO体系产生引起NBT还原量明显高于25℃和40℃( t检验，P<0.01)。结果还表明37℃反应30 min,时间—吸光度曲线趋于平稳，且A值在0.5左右，提示37℃温育30 min测定A值较为合适。, 百拇医药
2.1.2 NBT浓度对X-XO体系产生
检测的影响 向X-XO体系分别加入不同浓度NBT，并动态检测A值，结果表明：NBT 300 μmol.L-1组与NBT 150 μmol.L-1组A值明显不同(t检验，P<0.01)，但与NBT 600 μmol.L-1组无差别，提示当X浓度为100 μmol.L-1，XO浓度为14 U.L-1时，NBT浓度为300 μmol.L-1较合适。2.1.3 XO浓度对X-XO体系产生检测的影响 按图1分组，结果显示：A值随XO浓度的上升而迅速增加，但当XO浓度增到28 U.L-1后曲线趋于平稳。图1 XO浓度对X-XO体系产生检测的影响, http://www.100md.com
反应总体积2 ml，内含X 100 μmol.L-1、NBT 300 μmol.L-1及PBS，用不同浓度XO启动反应，37℃，30 min后测A值。n=4。与XO 7 U.L-1组相比：**P<0.01；与XO 28 U.L-1组相比：＃＃P<0.01
2.2 非酶体系产生
的检测2.2.1 温度和反应时间对非酶体系产生
引起NBT还原的影响 按上法将非酶体系分别置于25℃、37℃、40℃环境中，动态测定A值。结果表明：37℃组NBT还原量明显高于25℃组(t检验，P<0.01) ，但与40℃组无差别，提示37℃环境下非酶体产生量高于25℃环境。结果还表明：在37℃条件下非酶体系反应10 min，时间—吸光度曲线趋向平稳，说明37℃、反应10 min测定A值较为适宜。, http://www.100md.com
2.2.2 NBT浓度对非酶体系产生
检测的影响 向NADH-PMS反应体系中分别加入不同浓度NBT，结果表明：NBT 50 μmol.L-1组A值明显高于NBT 25 μmol.L-1组(t检验，P<0.01)，但与NBT 100 μmol.L-1组无差别。提示当NADH浓度为78 μmol.L-1，PMS浓度为10 μmol.L-1时，NBT浓度为50 μmol.L-1较为适宜。2.2.3 PMS浓度对非酶体系产生
检测的影响 按图2分组，结果显示：PMS 10 μmol.L-1与PMS 5 μmol.L-1组A值明显不同，但与20 μmol.L-1组差异较小。提示当NADH浓度为78 μmol.L-1，NBT浓度为50 μmol.L-1时，PMS浓度为10 μmol.L-1较合适。图2 PMS浓度对非酶体系产生检测的影响, http://www.100md.com
反应总体积2 ml，内含NADH 78 μmol.L-1、NBT 50 μmol.L-1及PBS，用不同浓度PMS启动反应，37℃，10 min后测A值。n=4。与PMS 5 μmol.L-1相比：**P<0.01
2.3 测定方法间的比较 向酶体系(内含X 100 μmol.L-1，NBT 300 μmol.L-1，XO 14 U.L-1)和非酶体系(内含NADH 78 μmol.L-1，NBT 50 μmol.L-1，PMS 10 μmol.L-1)分别加入250 μmol.L-1和500 μmol.L-1两个不同浓度Vit E，37℃温育30 min(酶体系)或10 min(非酶体系)测定A值，结果显示两个不同浓度Vit E对酶体系产生
抑制率为9.2%和11.2%，对非酶体系产生抑制率为8.3%和9.8%，与电子自旋捕获法测定结果9.4%十分相近。, 百拇医药
3 讨论
体内氧自由基可由多种途径产生，正常情况下氧自由基可调节花生四烯酸代谢，刺激吞噬细胞的杀菌功能以及免疫过程〔4〕。但氧自由基过多可引起组织细胞损伤和死亡，导致各种疾病〔1〕，
是主要的氧自由基，故对进行检测将有着重要的意义。本研究发现，37℃环境下X-XO体系产生
量最多，且反应30 min，时间—吸光度曲线趋于稳定，故笔者认为：X-XO体系产生检测宜选用37℃反应30 min较为适宜。结果还显示当X浓度100 μmol.L-1、XO浓度为14 U.L-1时，NBT 300 μmol.L-1组与NBT 150 μmol.L-1组差异有显著性，但与NBT 600 μmol.L-1组无差别，提示在上述反应条件下NBT终浓度为300 μmol.L-1较为适宜。尽管结果显示XO 28 U.L-1组产生量明显高于XO 14 U.L-1组，但由于XO价格昂贵，且当XO浓度为14 U.L-1、37℃反应30 min时，A值已达0.5以上，故我们认为酶体系中XO浓度为14 U.L-1较妥。, http://www.100md.com
非酶体系产生
模型主要用于探讨药物对是否有直接清除作用。本研究结果表明：37℃环境下，非酶体系产生明显高于25℃环境，但与40℃环境无差别，且反应10 min后时间—吸光度曲线趋于平稳，提示37℃反应10 min作为检测非酶体系产生条件较为适宜，且按结果NBT浓度选用50 μmol.L-1，PMS浓度选用10 μmol.L-1为佳。Vit E为公认的抗氧化剂，用本方法测得Vit E对
产生的抑制率与用电子自旋捕获法测得结果十分相近〔5〕，进一步证实了本实验方法的可靠性和实用性。, http://www.100md.com
作者简介：姚余有，男，32岁，硕士，讲师
参考文献
1 李文杰. 自由基与疾病. 见：方允中，李文杰主编. 自由基与酶. 北京：科学技术出版社，1989：193～230
2 张兆辉，余绍组，王镇涛. 四甲吡嗪对活性氧自由基的清除作用. 中国药理学报，1994；15(3)：229～231
3 Robak J, Gryglewski R J. Flavoids are scavenger of superoxide anion. Biochem Pharmacol,1988;37(5):837～841
4 李文杰. 自由基与疾病. 见：方允中，李文杰主编. 自由基与酶. 北京：科学技术出版社，1989:163～191
5 句海松，李小洁，赵保路. 沙棘总黄酮对活性氧自由基的清除作用. 中国药理学通报，1990；6(2)：97～100
1998-06-09收稿，1998-12-22修回, 百拇医药