人外周血淋巴细胞C-有丝分裂效应的研究
作者：王安莲 王秋萍 王维
单位：安徽省职业病防治研究所工业毒理研究室，合肥 230022
关键词：淋巴细胞；有丝分裂指数；药物作用；秋水仙碱；药理学；非整倍性
安徽医科大学学报990309
摘要 目的 研究秋水仙素(Ce)和秋水仙碱(Cd)对人外周血淋巴细胞有丝分裂效应的影响。方法 应用外周血淋巴细胞培养法，分析有丝分裂指数(MI)和C-有丝分裂效应。结果 Ce和Cd的MI与相应对照组相比，差异有显著性(P<0.01)，C-有丝分裂效应Ce和Cd处理组与相应对照组之间差异亦有显著性(P<0.01)。MI和C-有丝分裂效应，Cd的作用均较Ce强。并对C-有丝分裂效应与非整倍体诱导活性之间的关系进行了讨论。结论 C-有丝分裂效应可作为化合物非整倍体诱导活性的评价指标。
, http://www.100md.com
自由词 C-有丝分裂效应； 秋水仙素； 秋水仙碱
中国图书资料分类法分类号 R394.2
C-mitotic effects in human lymphocytes induced
by Colchine and Colcemid
Wang Anlian, Wang Qiuping, Wang Wei et al
(Anhui Institute of Treatment and Prevention of Occupational Diseases, Hefei 230022)
Abstract Objective To study the effect of Colchine(Ce) and Colcemid(Cd) on C-mitotic effects in human lymphocytes. Methods The mitotic index and C-mitoses were analysed in human lymphocytes by conventional cell culture method. Results MI of Ce and Cd was significantly higher than in the controls. The corresponding frequencies of cells in class C-E were significant different between the treatment groups and the control ones. Either MI or C-mitoses of Cd was more strong than Ces. The correlation between C-mitotic effects and the induction of aneupolidy were discussed. Conclusion The C-mitotic effects might provide a useful measurement for the indication of aneuploidy of chemicals.
, 百拇医药
MeSH lymphocytes; mitotic; index/drug eff; colchicine/pharmacol; aneupolidy
Free words C-mitotic effects; Colchine; Colcemid
C-有丝分裂是Levan(1939)发现的，又称秋水仙素效应。如果以秋水仙素处理培养细胞，往往出现有丝分裂指数提高，后期比例下降，染色体高度浓缩及染色单体互斥角度增加等一系列细胞毒性现象，它与诱发非整倍体的能力有良好的一致性〔1～3〕。C-有丝分裂简便、快速，因此被欧共体非整倍体委员会推荐为环境化合物中非整体诱导剂的初筛方法〔3，4〕。
秋水仙碱(Colcemid, Cd)是化学合成的秋水仙素(Colchine, Ce)的衍生物，和Ce一样，Cd也被非常广泛地应用于细胞遗传学研究中。Ce和Cd对人外周血淋巴细胞系统C-有丝分裂效应的影响，国内未见报道。为建立该实验方法，用于实际工作，我们对Ce和Cd诱发人外周围血淋巴细胞C-丝分裂效应和有丝分裂指数进行了分析。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 药物及血标本 Ce和Cd由上海生化试剂厂生产。实验用静脉血采自3例健康供血员，其中男性2人，女性1人，年龄30～35岁。
1.2 方法 按常规法建立淋巴细胞培养物，即取0.5 ml全血加入4.5 ml RPMI 1640(Gibco)培养基(含20%小牛血清，2%植物血球凝集素)中，每组2瓶，37℃培养，72 h收获细胞，收获前5 h加入处理物Ce和Cd，浓度分别为5、2 mg.L-1和10、2.5 mg.L-1。
1.3 标本制备与分析 常规气干法制片，Giemsa染色，双盲法分析MI和C-有丝分裂。
1.3.1 MI观察 每张片子计数1 000个细胞，计算有丝分裂百分率，有丝分裂指数的改变以MI因子(FMI)表示，即MI的变化则以处理组的平均MI与相应的阴性对照的平均MI之比(factor)来表示〔2〕。
, 百拇医药
1.3.2 C-有丝分裂效应分析 每张片子分析100个染色体分散良好的中期相，并按以下标准将其划分为5组〔2〕。
A：所有的染色体都具有细长而且相互平行的染色单体。
B：大多数染色体具有相互平行的染色单体。
C：大多数染色单体出现轻微的收缩和相互分开，并有3条或3条以上染色体的姐妹染色单体位于一条直线上。
D：染色单体呈现较强烈的收缩和相互分开，而且有至少5条(包括5条)染色体其两条染色单体几乎位于一条直线上。
E：染色单体收缩成点状。
计数每组细胞的数目，求出C～E组细胞所占的百分比。药物处理诱发的C-有丝分裂效应，则以被处理培养相C～E组细胞的算术平均数与相应阴性对照培养物C～E组细胞的算术平均数之比(factor)来表示。
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1.4 统计学处理 在Ce和Cd处理组及其相应的阴性对照之间，对MI和C-有丝分裂进行t检验。
2 结果与讨论
2.1 外周血淋巴细胞HT Ce和Cd都是著名的有丝分裂抑制剂。Ce是从秋水仙属(Colchium)植物中提取出来的，Cd则是化学合成的Ce衍生物。两者均是通过结合于微管蛋白(tabulin)β亚基的末端而影响微管的装配，进而抑制有丝分裂纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期〔5〕。MI是指处于有丝分裂期的细胞在全部分析中所占的百分比，它可能决定于两个因素，即从间期进入有丝分裂的细胞数和克服了有丝分裂抑制剂的阻止而进入新时期的细胞数。Vijayalaxmi的报道〔6〕说明了这种观点。本次研究Ce和Cd处理的外周血淋巴细胞MI高于相应的对照组(表1，P<0.01)，其生物学机制还不是很清楚，有可能是通过阻止纺缍体的形成和抑制DNA合成两种途径来影响人外周血淋巴细胞MI〔3〕。Ce浓度较Cd高一倍的情况下，MI值相差不大，说明Cd对人外周血淋巴细胞MI的影响较Ce强。
, 百拇医药
表1 人外周血淋巴细胞有丝分裂指数(
±s,n=10) 化合物
剂量
(mg.L-1)
MI(%)
处理组
对照组
factor
Ce
5
8.70±0.81**
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2.41±0.35
3.61
20
9.75±0.86**
2.23±0.25
4.37
Cd
2.5
7.25±0.74**
2.40±0.15
3.02
10
, 百拇医药
10.93±0.91**
2.38±0.25
4.59
与对照组比较：**P<0.012.2 人外周血淋巴细胞C-有丝分裂效应 C-有丝分裂是细胞在受到纺锤体毒剂作用时，分裂虽然停止在中期，但染色单体的收缩和相互分开仍然继续进行的现象。根据染色单体收缩和分开的程度，把中期相划分为几个阶段，并对处于不同阶段的细胞进行统计分析，则称为C-有丝分裂效应分析。如表2所示，Ce和Cd能强烈地导致人外周血淋巴细胞C-有丝分裂效应，处理组与相应对照组比较，差异都有显著性(P<0.01)。Cd的作用较Ce强。
表2 人外周血淋巴细胞C-有丝分裂效应(±s,n=10) 化合物
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剂量
(mg.L-1)
C～E组细胞数(%)
处理组
对照组
factor
Ce
5
78.22±3.68**
17.00±1.00
4.61
20
, 百拇医药
80.28±4.30**
19.00±0.50
4.23
Cd
2.5
70.50±3.24**
17.50±0.50
4.41
10
77.25±4.21**
18.50±1.50
, http://www.100md.com
4.89
与对照组比较：**P<0.012.3 C-有丝分裂效应与非整倍体的关系 Miller等利用C-有丝分裂效应分方法评价了Ce，长春花碱(VCR)等10余种化合物的纺锤体毒性，并与它们诱发非整倍体的能力进行了比较，发现二者之间有良好的一致性〔1～3〕。并且已有大量的工作表明，Cd在研究过的所有离体培养细胞中均能诱发染色体数目异常。小鼠骨髓细胞微核分析和染色体计数的结果也表明Cd能诱发非整倍体〔8，9〕。
非整倍体(Aneuploidy)是指细胞的染色体多或少了一条或几条，是导致人类死胎、自发流产和出生缺陷如先天愚型等的主要原因〔9〕。在体细胞中非整倍体与肿瘤尤其是白血病有着密切的关系〔3〕，大多数有丝分裂抑制剂都可导致C-有丝分裂，因而具有诱发非整倍体的潜能〔1，2，10〕。在我国化学物质日益增多的情况下，为保护环境提高人类健康素质，将非整倍体诱发剂检测引入人类生存环境的监测，显然是降低人类遗传负荷提高人类生存环境质量的重要环节。作者认为C-有丝分裂分析简便且比较省时，可以作为化合物非整倍体诱导活性的评价指标，用该方法对非整倍体诱导剂进行筛选更具有重要的现实意义。
, 百拇医药
作者简介：王安莲，女，36岁，主管医师
参考文献
1 Sugatha TV, Hegde MJ. C-mitotic effects of richloroethytene (TLE) on bone marrow cells of mice. Mutat Res, 1998;413(2):151～158
2 Miller BM, Adder ID. Suspect spindle poisons analysis of C-mitotic effects in mouse bone marrow cells. Mutagenesis, 1989;4(3):208～215
3 Parry JM, Parry EM, Bourner R et al. The detection and evaluation of aneugenic chemicals. Mutat Res, 1996;353(1，2):11～40
, 百拇医药
4 Parry JM, Sors A. The detection and assement of the aneugenic potential of environmental chemicals: the Europena Community Aneuploidy Project. Mutat Res, 1993;287(1):3～16
5 史庆华，Adler ID,张锡然. 秋水仙碱诱发小鼠骨髓细胞C-有丝分裂效应的研究，细胞生物学杂志， 1996；18(4)：172～176
6 Vijayalaxmi, Reiter RJ, Leal BZ et al. Effect of metatonin on mitotic and proliferation indices, and sister chromitid exchange in human blood lymphocytes. Mutat Res, 1996;351(2):187～192
, 百拇医药
7 Sbrana I, Sibio AD, Scarecelli AL. C-mitosis and numerical chromosome aberration analysis in human lymphocytes: 10 known or suspected spindle poisons. Mutat Res, 1993;287(1):57～70
8 Bourner R, Parry EM, Parry JM. Chemically induced aneuploidy: investigation into chromosome specific effects in mitosis. Mutat Res, 1998;404(1，2):191～197
9 Hernandez A, Reynoso MC, Soto F et al. Aneuploidis, chromosome aberrations and dominant gene Mutations detected in 113913 consecative newborn children in mexico. Mutat Res, 1990;232(1):23～29
10 Onfelt A. Spindle disturbances in mammalian cells: Ⅲ Toxicity, C-mitosis and aneuploid with 22 different compounds, specific and unspecific mechanisms. Mutat Res, 1987;182(3):135～154
1999-01-21收稿，1999-03-17修回, 百拇医药
单位：安徽省职业病防治研究所工业毒理研究室，合肥 230022
关键词：淋巴细胞；有丝分裂指数；药物作用；秋水仙碱；药理学；非整倍性
安徽医科大学学报990309
摘要 目的 研究秋水仙素(Ce)和秋水仙碱(Cd)对人外周血淋巴细胞有丝分裂效应的影响。方法 应用外周血淋巴细胞培养法，分析有丝分裂指数(MI)和C-有丝分裂效应。结果 Ce和Cd的MI与相应对照组相比，差异有显著性(P<0.01)，C-有丝分裂效应Ce和Cd处理组与相应对照组之间差异亦有显著性(P<0.01)。MI和C-有丝分裂效应，Cd的作用均较Ce强。并对C-有丝分裂效应与非整倍体诱导活性之间的关系进行了讨论。结论 C-有丝分裂效应可作为化合物非整倍体诱导活性的评价指标。
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自由词 C-有丝分裂效应； 秋水仙素； 秋水仙碱
中国图书资料分类法分类号 R394.2
C-mitotic effects in human lymphocytes induced
by Colchine and Colcemid
Wang Anlian, Wang Qiuping, Wang Wei et al
(Anhui Institute of Treatment and Prevention of Occupational Diseases, Hefei 230022)
Abstract Objective To study the effect of Colchine(Ce) and Colcemid(Cd) on C-mitotic effects in human lymphocytes. Methods The mitotic index and C-mitoses were analysed in human lymphocytes by conventional cell culture method. Results MI of Ce and Cd was significantly higher than in the controls. The corresponding frequencies of cells in class C-E were significant different between the treatment groups and the control ones. Either MI or C-mitoses of Cd was more strong than Ces. The correlation between C-mitotic effects and the induction of aneupolidy were discussed. Conclusion The C-mitotic effects might provide a useful measurement for the indication of aneuploidy of chemicals.
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MeSH lymphocytes; mitotic; index/drug eff; colchicine/pharmacol; aneupolidy
Free words C-mitotic effects; Colchine; Colcemid
C-有丝分裂是Levan(1939)发现的，又称秋水仙素效应。如果以秋水仙素处理培养细胞，往往出现有丝分裂指数提高，后期比例下降，染色体高度浓缩及染色单体互斥角度增加等一系列细胞毒性现象，它与诱发非整倍体的能力有良好的一致性〔1～3〕。C-有丝分裂简便、快速，因此被欧共体非整倍体委员会推荐为环境化合物中非整体诱导剂的初筛方法〔3，4〕。
秋水仙碱(Colcemid, Cd)是化学合成的秋水仙素(Colchine, Ce)的衍生物，和Ce一样，Cd也被非常广泛地应用于细胞遗传学研究中。Ce和Cd对人外周血淋巴细胞系统C-有丝分裂效应的影响，国内未见报道。为建立该实验方法，用于实际工作，我们对Ce和Cd诱发人外周围血淋巴细胞C-丝分裂效应和有丝分裂指数进行了分析。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 药物及血标本 Ce和Cd由上海生化试剂厂生产。实验用静脉血采自3例健康供血员，其中男性2人，女性1人，年龄30～35岁。
1.2 方法 按常规法建立淋巴细胞培养物，即取0.5 ml全血加入4.5 ml RPMI 1640(Gibco)培养基(含20%小牛血清，2%植物血球凝集素)中，每组2瓶，37℃培养，72 h收获细胞，收获前5 h加入处理物Ce和Cd，浓度分别为5、2 mg.L-1和10、2.5 mg.L-1。
1.3 标本制备与分析 常规气干法制片，Giemsa染色，双盲法分析MI和C-有丝分裂。
1.3.1 MI观察 每张片子计数1 000个细胞，计算有丝分裂百分率，有丝分裂指数的改变以MI因子(FMI)表示，即MI的变化则以处理组的平均MI与相应的阴性对照的平均MI之比(factor)来表示〔2〕。
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1.3.2 C-有丝分裂效应分析 每张片子分析100个染色体分散良好的中期相，并按以下标准将其划分为5组〔2〕。
A：所有的染色体都具有细长而且相互平行的染色单体。
B：大多数染色体具有相互平行的染色单体。
C：大多数染色单体出现轻微的收缩和相互分开，并有3条或3条以上染色体的姐妹染色单体位于一条直线上。
D：染色单体呈现较强烈的收缩和相互分开，而且有至少5条(包括5条)染色体其两条染色单体几乎位于一条直线上。
E：染色单体收缩成点状。
计数每组细胞的数目，求出C～E组细胞所占的百分比。药物处理诱发的C-有丝分裂效应，则以被处理培养相C～E组细胞的算术平均数与相应阴性对照培养物C～E组细胞的算术平均数之比(factor)来表示。
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1.4 统计学处理 在Ce和Cd处理组及其相应的阴性对照之间，对MI和C-有丝分裂进行t检验。
2 结果与讨论
2.1 外周血淋巴细胞HT Ce和Cd都是著名的有丝分裂抑制剂。Ce是从秋水仙属(Colchium)植物中提取出来的，Cd则是化学合成的Ce衍生物。两者均是通过结合于微管蛋白(tabulin)β亚基的末端而影响微管的装配，进而抑制有丝分裂纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期〔5〕。MI是指处于有丝分裂期的细胞在全部分析中所占的百分比，它可能决定于两个因素，即从间期进入有丝分裂的细胞数和克服了有丝分裂抑制剂的阻止而进入新时期的细胞数。Vijayalaxmi的报道〔6〕说明了这种观点。本次研究Ce和Cd处理的外周血淋巴细胞MI高于相应的对照组(表1，P<0.01)，其生物学机制还不是很清楚，有可能是通过阻止纺缍体的形成和抑制DNA合成两种途径来影响人外周血淋巴细胞MI〔3〕。Ce浓度较Cd高一倍的情况下，MI值相差不大，说明Cd对人外周血淋巴细胞MI的影响较Ce强。
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表1 人外周血淋巴细胞有丝分裂指数(
±s,n=10) 化合物剂量
(mg.L-1)
MI(%)
处理组
对照组
factor
Ce
5
8.70±0.81**
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2.41±0.35
3.61
20
9.75±0.86**
2.23±0.25
4.37
Cd
2.5
7.25±0.74**
2.40±0.15
3.02
10
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10.93±0.91**
2.38±0.25
4.59
与对照组比较：**P<0.012.2 人外周血淋巴细胞C-有丝分裂效应 C-有丝分裂是细胞在受到纺锤体毒剂作用时，分裂虽然停止在中期，但染色单体的收缩和相互分开仍然继续进行的现象。根据染色单体收缩和分开的程度，把中期相划分为几个阶段，并对处于不同阶段的细胞进行统计分析，则称为C-有丝分裂效应分析。如表2所示，Ce和Cd能强烈地导致人外周血淋巴细胞C-有丝分裂效应，处理组与相应对照组比较，差异都有显著性(P<0.01)。Cd的作用较Ce强。
表2 人外周血淋巴细胞C-有丝分裂效应(
±s,n=10) 化合物, http://www.100md.com
剂量
(mg.L-1)
C～E组细胞数(%)
处理组
对照组
factor
Ce
5
78.22±3.68**
17.00±1.00
4.61
20
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80.28±4.30**
19.00±0.50
4.23
Cd
2.5
70.50±3.24**
17.50±0.50
4.41
10
77.25±4.21**
18.50±1.50
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与对照组比较：**P<0.012.3 C-有丝分裂效应与非整倍体的关系 Miller等利用C-有丝分裂效应分方法评价了Ce，长春花碱(VCR)等10余种化合物的纺锤体毒性，并与它们诱发非整倍体的能力进行了比较，发现二者之间有良好的一致性〔1～3〕。并且已有大量的工作表明，Cd在研究过的所有离体培养细胞中均能诱发染色体数目异常。小鼠骨髓细胞微核分析和染色体计数的结果也表明Cd能诱发非整倍体〔8，9〕。
非整倍体(Aneuploidy)是指细胞的染色体多或少了一条或几条，是导致人类死胎、自发流产和出生缺陷如先天愚型等的主要原因〔9〕。在体细胞中非整倍体与肿瘤尤其是白血病有着密切的关系〔3〕，大多数有丝分裂抑制剂都可导致C-有丝分裂，因而具有诱发非整倍体的潜能〔1，2，10〕。在我国化学物质日益增多的情况下，为保护环境提高人类健康素质，将非整倍体诱发剂检测引入人类生存环境的监测，显然是降低人类遗传负荷提高人类生存环境质量的重要环节。作者认为C-有丝分裂分析简便且比较省时，可以作为化合物非整倍体诱导活性的评价指标，用该方法对非整倍体诱导剂进行筛选更具有重要的现实意义。
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作者简介：王安莲，女，36岁，主管医师
参考文献
1 Sugatha TV, Hegde MJ. C-mitotic effects of richloroethytene (TLE) on bone marrow cells of mice. Mutat Res, 1998;413(2):151～158
2 Miller BM, Adder ID. Suspect spindle poisons analysis of C-mitotic effects in mouse bone marrow cells. Mutagenesis, 1989;4(3):208～215
3 Parry JM, Parry EM, Bourner R et al. The detection and evaluation of aneugenic chemicals. Mutat Res, 1996;353(1，2):11～40
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4 Parry JM, Sors A. The detection and assement of the aneugenic potential of environmental chemicals: the Europena Community Aneuploidy Project. Mutat Res, 1993;287(1):3～16
5 史庆华，Adler ID,张锡然. 秋水仙碱诱发小鼠骨髓细胞C-有丝分裂效应的研究，细胞生物学杂志， 1996；18(4)：172～176
6 Vijayalaxmi, Reiter RJ, Leal BZ et al. Effect of metatonin on mitotic and proliferation indices, and sister chromitid exchange in human blood lymphocytes. Mutat Res, 1996;351(2):187～192
, 百拇医药
7 Sbrana I, Sibio AD, Scarecelli AL. C-mitosis and numerical chromosome aberration analysis in human lymphocytes: 10 known or suspected spindle poisons. Mutat Res, 1993;287(1):57～70
8 Bourner R, Parry EM, Parry JM. Chemically induced aneuploidy: investigation into chromosome specific effects in mitosis. Mutat Res, 1998;404(1，2):191～197
9 Hernandez A, Reynoso MC, Soto F et al. Aneuploidis, chromosome aberrations and dominant gene Mutations detected in 113913 consecative newborn children in mexico. Mutat Res, 1990;232(1):23～29
10 Onfelt A. Spindle disturbances in mammalian cells: Ⅲ Toxicity, C-mitosis and aneuploid with 22 different compounds, specific and unspecific mechanisms. Mutat Res, 1987;182(3):135～154
1999-01-21收稿，1999-03-17修回, 百拇医药