地高辛标记探针原位杂交在人巨细胞病毒感染鼠脑神经元研究中的应用
作者：王明丽 史百芬 李京培 毕克菊 胡 勇 黄升海 任 斌
单位：王明丽 史百芬 李京培 毕克菊 胡 勇 黄升海 任 斌 安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032
关键词：地高辛配基；原位杂交；巨细胞病毒感染；神经元；鼠；大脑皮质
安徽医科大学学报990403
摘要：目的 建立一种适用于检测人巨细胞病毒(HCMV)感染新生乳鼠大脑皮质神经元原代培养物中病毒DNA的原位杂交法。方法 制备和培养新生乳鼠大脑皮质神经元并进行病毒感染；在感染后的第3，5天及第1～4周连续取样用地高辛标记的HCMV即刻早期抗原(MIE)和晚期抗原(LA)寡核苷酸特异性探针分别进行核酸原位杂交，检测受染神经元内相应病毒核酸及分布。结果 MIE寡核苷酸探针可在HCMV感染后第4～7天检出神经元核内HCMV DNA；而LA寡核苷酸探针则可稳定地检出感染后第7～28天细胞培养物中的相应病毒核酸；并显示：HCMV DNA杂交阳性信号在感染的早期主要分布在核内，呈灶性；而在感染的晚期，杂交阳性信号均匀分布于受染神经元的核内及胞浆内。结论 地高辛标记的HCMV DNA MIE和LA寡核苷酸探针在病毒感染机制研究以及临床诊断等方面，具有广泛的应用前景。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号：R977； R512.99； R373.9； R392
Application of digoxigenin-labelled probe in the study
of the neurons of newborn mice from the cerebral cortex
with human cytomegalovirus infection
Wang Mingli, Shi Baifen, Li Jingpei et al
(Department of Microbiology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
, 百拇医药
Abstract Objective To develop an appropriate method of in situ hybridization using digoxigenin (Dig)-labelled oligodeoxynucleotide probes for detection of human cytomegalovirus (HCMV) DNA in the primary cultured neurons of newborn mice from the cerebral cortex. Methods The cerebral cortex neurons were prepared and cultured and HCMV infection model was made. The cells were observed and recorded by photography under microscope, and the cell samples were taken for the viral DNA detection and its intracelluar location was analysed with in situ hybridization using Dig-labelled HCMV immediate early antigen (MIE) and late antigen (LA) oligodeoxynucleotide probes at 24，72 h……1,2,3 and 4 weeks of postinfection, respectively. Results The viral DNA was demonstrated within the nuclei of neurons during 4～5 th day of postinfection by in situ hybridization using MIE probe, but the viral DNA was seen in the nuclei and the cellular cytoplasm of the neurons during 7～28 th day using LA probe. Conclusion The established methods shows considerable potential for diagnosis of HCMV infection and for pathogenicity researches.
, 百拇医药
MeSH digoxigenin; in situ hybridization; cytomegalovirus; neurons; mouse
Free word cerebral cortex
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)是引起先天性中枢神经系统(CNS)感染的重要病原体之一。在胎儿、新生儿中，可致先天弱智、小头畸形等。HCMV还是器官移植失败和艾滋病患者并发感染致死的主要病因。我们借助于已建立的HCMV体外感染原代培养新生乳鼠大脑皮质神经元模型，采用地高辛(Digoxigenin, Dig)标记的HCMV DNA探针，建立了一种特异、敏感、简便的原位杂交法，为探讨该病毒感染大脑皮质神经元致病机理中的作用提供有用工具。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 病毒 HCMV AD169株由上海医科大学微生物学教研室提供，用人胚成纤维细胞(HF)培养增殖。使用前，将病毒在HF细胞上多次传代，以增加病毒毒力；按Gibson〔1〕的CPE终点稀释法以在24～48 h内出现病毒致细胞变作用(CPE)达“
～
”的病毒悬液在HF细胞上滴定TCID50；以6.0 log TCID50/ml的病毒作为实验用毒种。
1.2 细胞 人成纤维细胞株(HF)及原代兔肾细胞均由本室自制。本研究采用的HF株为6～8代。
1.3 主要试剂 所用主要化学及分子生物学试剂分别购自Sigma公司、Promega公司和华美生物工程公司；地高辛DNA标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。
, 百拇医药
1.4 HCMV MIE和LA寡核苷酸探针序列合成与标记 HCMV DNA MIE(即刻早期抗原)和LA(晚期抗原)寡核苷酸探针片段序列位置参考文献〔2〕设计，MIE寡核苷酸探针序列：5′GAGGCTATTGTAGCCTACACTTTGG3′，序列位点为第900～925核苷酸；LA寡核苷酸探针片段序列为5′GTCGCCTGCACTGCCAGGTGCTTCG3′，序列位点第2 301～2 325核苷酸。DNA合成仪固相亚磷酸三酯法合成并纯化(中国科学院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室)。上述两种Digoxigenin标记的探针制备及检测按Boehringer Mannheim公司说明书进行。
1.5 HCMV感染体外培养的新生乳鼠大脑皮质神经元模型的建立 实验用Balb/c新生乳鼠由本校实验动物中心提供。原代培养物的制备基本参照吴希如等〔3〕介绍的方法进行。将细胞接种至盛有已预先覆盖鼠尾胶原薄膜盖玻片的塑料培养皿内，最终细胞浓度1×109.L-1。置37℃，5% CO2饱和湿度的CO2培养箱内培养，48 h后，分别于相应孔内加入细胞分裂抑制剂5-氟-2脱氧尿苷15 mg.L-1和尿苷35 mg.L-1以抑制非神经元的过度增殖。再经48 h后，于每个试验孔内分别加入100 TCID50病毒悬液0.1 ml，同时以相同病毒量感染HF细胞作为阳性对照。
, 百拇医药
观察和鉴定方法：每隔2～3天于倒置显微镜下观察、摄影记录、换液；并在病毒感染后的第24，48，72 h……和第1～4周分别连续取样，用于原位杂交检测等。
1.6 原位杂交 载有单层细胞培养物的盖玻片经4%多聚甲醛固定后，用0.2 mol.L-1 HCl作用20 min，Pronase K(20 mg.L-1)37℃作用10 min；再用含甘氨酸(2 g.L-1)PBS洗5 min×2，RNase A(100 mg.L-1)37℃作用30 min，经上述甘氨酸PBS洗涤后，再以40 g.L-1多聚甲醛后固定。再洗涤后，在细胞单层上滴加适量预热的杂交液，37℃作用30 min，用预热杂交液稀释DNA探针并置100℃变性5 min后速冷；倾去预杂交液，加入DNA探针(1～3 mg.L-1)；细心地盖上硅化盖玻片，边缘用石蜡油封闭后，置37℃杂交过夜。2×SSC、0.1% SDS洗10 min×2，0.1×SSC、0.1% SDS洗15 min×2后，按试剂盒说明书操作，进行免疫显色检测，出现颜色反应后，以TE终止反应。出现蓝紫色颗粒显色点为阳性杂交信号。常规脱水、透明、封固、照相记录。
, 百拇医药
每次实验均设如下对照：阴性对照①HSV-1感染的人成纤维细胞(HF)对照；②无标记探针的HCMV感染的新生乳鼠细胞培养物对照；③正常新生乳鼠脑神经细胞培养物对照。阳性对照：HCMV感染HF细胞培养物。
2 结果
2.1 新生乳鼠大脑皮质神经元原代培养物形态观察 在倒置显微镜下，于鼠尾胶原片上培养48 h内的多数细胞呈小圆簇附于薄膜上，并有小突起细胞簇向外伸出。培养96 h以后，扁平多角形细胞开始形成，增多。两周后，形成神经胶质细胞层，具有各种长度和厚度的突起的神经元分散在胶质层上，突出的网络更加密集，与远处细胞相互接触。培养至3～4周时，未见明显细胞退变现象(图1A)。
图1 HCMV感染后2周新生乳鼠脑神经元的光镜观察
, 百拇医药
A 正常神经元(↑，×200)； B HCMV感染的神经元(×200)
HCMV感染的神经元在培养第1周时可见到少数胶质细胞出现变圆肿胀，神经元形态明显改变发生在培养的第2周以后，镜下观察时可见神经元胞核肿胀，胞浆颗粒增多，折光性减弱，突起断裂。随着时间的延长，细胞裂解液化(图1B)。
2.2 原位杂交最适条件探索
2.2.1 消化液中蛋白酶K浓度的选择 经选用含10，20，50和100 mg.L-1四种不同浓度蛋白酶K的消化液作用于原代培养的HCMV感染的细胞单层后，进行原位杂交的结果发现，蛋白酶K浓度在10 mg.L-1时无杂交信号出现；而当蛋白酶K浓度大于100 mg.L-1时，细胞结构明显受损，出现破碎脱落现象，不利于结合细胞形态观察。蛋白酶K浓度以取20～50 mg.L-1为宜。
, 百拇医药
2.2.2 杂交温度的选择 在25℃、37℃和42℃三种杂交温度下过夜进行的原位杂交结果显示，25℃时出现明显的非特异性反应，对照和试验组均有较多的背景斑点；用37℃和42℃杂交结果较好，对照组没有背景斑点出现。
2.3 原位杂交的特异性 用Dig标记的HCMV MIE和LA寡核苷酸探针分别与HSV-1感染的和用预杂交液代替杂交液的HCMV感染的新生乳鼠大脑皮质神经元进行杂交，结果与正常新生乳鼠大脑皮质神经元一样，无杂交信号出现(图2A)；同样，用上述Dig标记的探针与HCMV感染的新生乳鼠大脑皮质神经元进行杂交，在镜下即可观察到与HCMV感染的HF细胞相一致的结果，即在受染的细胞核内(图2B)及胞浆内(图2C)出现相应病毒核酸存在的蓝紫色杂交阳性信号。
, http://www.100md.com
图2 新生乳鼠大脑皮质神经元原位杂交结果
A 正常细胞对照无杂交信号(×400)；
B HCMV感染神经元核内阳性杂交信号(×1 000)；
C HCMV感染神经元核内及胞浆内阳性杂交信号(×400)
2.4 两种Dig标记HCMV寡核苷酸探针原位杂交检测结果 对42片载有感染HCMV新生乳鼠大脑皮质神经元不同培养时间的盖玻片和同时设置的36片正常新生乳鼠大脑皮质神经元盖玻片进行了原位杂交检测，结果显示：用Dig标记的HCMV MIE和LA寡核苷酸探针与正常新生乳鼠大脑皮质原代培养的神经元原位杂交均为阴性；而受HCMV感染的神经元，MIE寡核苷酸探针在感染后的第4～5天即可在核内检出相应病毒核酸，杂交阳性信号呈灶性分布(见图2B)；随着感染时间的延长，用LA寡核苷酸探针则可在感染后第10～28天神经元的核内和胞浆内稳定地检出该病毒核酸；镜下可见蓝紫色杂交阳性信号已充满整个细胞(见图2C)，表明此时细胞结构已全部被病毒破坏。因此，同一批样本同时分别使用两种探针检测，可避免假阴性，提高准确性。
, 百拇医药
3 讨论
HCMV AD169株作为HCMV标准毒株已在体外广泛传代并冷藏多年，已有实验证实，HCMV AD169株在体外除可感染人成纤维细胞株外，还可感染巨噬细胞〔4〕、外周血单核细胞〔5〕、脑毛细血管内皮细胞〔6〕和神经细胞〔7〕；在实验动物体内可致家兔〔8〕和小白鼠〔9〕全身感染。此表明，经过长期体外传代的AD169株宿主范围已变得相当广泛。本研究经体外活细胞病毒感染物观察及Dig标记HCMV特异性寡核苷酸探针进行原位杂交检测证实，HCMV AD169株可感染新生乳鼠脑神经细胞。这更进一步表明，此毒株基因组已发生变异，且变异部位可能发生在编码病毒包膜基因组上，导致病毒包膜上氨基酸的种类及排列顺序发生相应变化，使病毒宿主范围变宽。这些，将有待今后研究证实。
HCMV感染体外人脑神经细胞培养物的研究已有报道，但实验所需的人胚脑组织来源受限，不易得到。我们在新生乳鼠脑组织制备的原代细胞培养物上试用HCMV感染，根据观察鉴定结果证明，HCMV确能感染新生乳鼠脑神经细胞，有明显CPE，且CPE主要特征与在人细胞来源的培养物上一致。由于新生乳鼠价廉，易得，取材方便，且新生乳鼠脑神经细胞可被HCMV感染，这将促进对HCMV致中枢神经系统感染发生机制的更深入的基础研究。促进抗HCMV感染药物和疫苗研制的基础研究。
, 百拇医药
本研究采用德国Boehringer Mannheim公司推出的新型Dig DNA标记及检测系统，从实验结果来看，有如下优点：①杂交结果直接与细胞类型、细胞形态相联系，经感染处理后，细胞着色有深有浅，提示同一细胞受感染病变的程度不同；也表明不同细胞有不同的感染状态。②本法操作相对简便，只需少量细胞便可。③用地高辛标记探针，避免了使用同位素，灵敏度与同位素相当，又没有生物素标记探针有内源性生物素干扰的缺点。这使得检测本底更低，特异性更高，定位更精确。
基金项目：安徽省教委自然科学基金资助项目和安徽省科委自然科学基金资助项目(95-医-018)
作者简介：王明丽，43岁，副教授
参考文献
1 Gibson W, Structural and nonstructural proteins of strain colburn cytomegalovirus. Virology, 1981;111:516～537
, 百拇医药
2 Smith KL, Kulski JK, Cobain T et al. Detection of cytomegalovirus in blood donor by the polymerase chain reaction. Transfusion, 1993;33(6):497～503
3 吴希如，张 一，马守兴等.胚鼠大脑皮层神经细胞的体外原代分离单层培养方法.北京医学院学报，1983；15(3)：169～172
4 Ibanez CE, Schrier R, Ghazal P et al. Human cytomegalovirus productively infects primary differentiated macrophages. J Virol, 1991;65(12):6 581～6 588
5 Sderberg C, Larsson S, Bergstedt-Lindqvist S et al. Definition of a subset of Human peripheril blood mononulcear cells that are permissive to human cytomegalovius infection. J Virol, 1993;67(14):3 166～3 175
, http://www.100md.com
6 Lathey JL. Wiley CA, Verity MA et al. Cultured human brain capillary endothelial cells are permissive for infection by human cytomegalovirus. Virology, 1990;176:266～273
7 Mccarthy M, Resnick L, Taub F et al. Infection of human neural cell aggregate cultures with a clinical isolate of cytomegalovirus. J Neuropathol Experimental Neurol, 1991;50(4):441～450
8 高又新，杨占秋，文 莉等.巨细胞病毒AD169株家兔感染机制的动物模型研究.中华微生物学和免疫学杂志，1992；12(5)：324
9 李天宪，赵 林，冯 锋等.人巨细胞病毒小鼠模型的建立.微生物学报，1996；36(4)：292～294
1999-06-15收稿, 百拇医药
单位：王明丽 史百芬 李京培 毕克菊 胡 勇 黄升海 任 斌 安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032
关键词：地高辛配基；原位杂交；巨细胞病毒感染；神经元；鼠；大脑皮质
安徽医科大学学报990403
摘要：目的 建立一种适用于检测人巨细胞病毒(HCMV)感染新生乳鼠大脑皮质神经元原代培养物中病毒DNA的原位杂交法。方法 制备和培养新生乳鼠大脑皮质神经元并进行病毒感染；在感染后的第3，5天及第1～4周连续取样用地高辛标记的HCMV即刻早期抗原(MIE)和晚期抗原(LA)寡核苷酸特异性探针分别进行核酸原位杂交，检测受染神经元内相应病毒核酸及分布。结果 MIE寡核苷酸探针可在HCMV感染后第4～7天检出神经元核内HCMV DNA；而LA寡核苷酸探针则可稳定地检出感染后第7～28天细胞培养物中的相应病毒核酸；并显示：HCMV DNA杂交阳性信号在感染的早期主要分布在核内，呈灶性；而在感染的晚期，杂交阳性信号均匀分布于受染神经元的核内及胞浆内。结论 地高辛标记的HCMV DNA MIE和LA寡核苷酸探针在病毒感染机制研究以及临床诊断等方面，具有广泛的应用前景。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号：R977； R512.99； R373.9； R392
Application of digoxigenin-labelled probe in the study
of the neurons of newborn mice from the cerebral cortex
with human cytomegalovirus infection
Wang Mingli, Shi Baifen, Li Jingpei et al
(Department of Microbiology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
, 百拇医药
Abstract Objective To develop an appropriate method of in situ hybridization using digoxigenin (Dig)-labelled oligodeoxynucleotide probes for detection of human cytomegalovirus (HCMV) DNA in the primary cultured neurons of newborn mice from the cerebral cortex. Methods The cerebral cortex neurons were prepared and cultured and HCMV infection model was made. The cells were observed and recorded by photography under microscope, and the cell samples were taken for the viral DNA detection and its intracelluar location was analysed with in situ hybridization using Dig-labelled HCMV immediate early antigen (MIE) and late antigen (LA) oligodeoxynucleotide probes at 24，72 h……1,2,3 and 4 weeks of postinfection, respectively. Results The viral DNA was demonstrated within the nuclei of neurons during 4～5 th day of postinfection by in situ hybridization using MIE probe, but the viral DNA was seen in the nuclei and the cellular cytoplasm of the neurons during 7～28 th day using LA probe. Conclusion The established methods shows considerable potential for diagnosis of HCMV infection and for pathogenicity researches.
, 百拇医药
MeSH digoxigenin; in situ hybridization; cytomegalovirus; neurons; mouse
Free word cerebral cortex
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)是引起先天性中枢神经系统(CNS)感染的重要病原体之一。在胎儿、新生儿中，可致先天弱智、小头畸形等。HCMV还是器官移植失败和艾滋病患者并发感染致死的主要病因。我们借助于已建立的HCMV体外感染原代培养新生乳鼠大脑皮质神经元模型，采用地高辛(Digoxigenin, Dig)标记的HCMV DNA探针，建立了一种特异、敏感、简便的原位杂交法，为探讨该病毒感染大脑皮质神经元致病机理中的作用提供有用工具。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 病毒 HCMV AD169株由上海医科大学微生物学教研室提供，用人胚成纤维细胞(HF)培养增殖。使用前，将病毒在HF细胞上多次传代，以增加病毒毒力；按Gibson〔1〕的CPE终点稀释法以在24～48 h内出现病毒致细胞变作用(CPE)达“
～”的病毒悬液在HF细胞上滴定TCID50；以6.0 log TCID50/ml的病毒作为实验用毒种。1.2 细胞 人成纤维细胞株(HF)及原代兔肾细胞均由本室自制。本研究采用的HF株为6～8代。
1.3 主要试剂 所用主要化学及分子生物学试剂分别购自Sigma公司、Promega公司和华美生物工程公司；地高辛DNA标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。
, 百拇医药
1.4 HCMV MIE和LA寡核苷酸探针序列合成与标记 HCMV DNA MIE(即刻早期抗原)和LA(晚期抗原)寡核苷酸探针片段序列位置参考文献〔2〕设计，MIE寡核苷酸探针序列：5′GAGGCTATTGTAGCCTACACTTTGG3′，序列位点为第900～925核苷酸；LA寡核苷酸探针片段序列为5′GTCGCCTGCACTGCCAGGTGCTTCG3′，序列位点第2 301～2 325核苷酸。DNA合成仪固相亚磷酸三酯法合成并纯化(中国科学院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室)。上述两种Digoxigenin标记的探针制备及检测按Boehringer Mannheim公司说明书进行。
1.5 HCMV感染体外培养的新生乳鼠大脑皮质神经元模型的建立 实验用Balb/c新生乳鼠由本校实验动物中心提供。原代培养物的制备基本参照吴希如等〔3〕介绍的方法进行。将细胞接种至盛有已预先覆盖鼠尾胶原薄膜盖玻片的塑料培养皿内，最终细胞浓度1×109.L-1。置37℃，5% CO2饱和湿度的CO2培养箱内培养，48 h后，分别于相应孔内加入细胞分裂抑制剂5-氟-2脱氧尿苷15 mg.L-1和尿苷35 mg.L-1以抑制非神经元的过度增殖。再经48 h后，于每个试验孔内分别加入100 TCID50病毒悬液0.1 ml，同时以相同病毒量感染HF细胞作为阳性对照。
, 百拇医药
观察和鉴定方法：每隔2～3天于倒置显微镜下观察、摄影记录、换液；并在病毒感染后的第24，48，72 h……和第1～4周分别连续取样，用于原位杂交检测等。
1.6 原位杂交 载有单层细胞培养物的盖玻片经4%多聚甲醛固定后，用0.2 mol.L-1 HCl作用20 min，Pronase K(20 mg.L-1)37℃作用10 min；再用含甘氨酸(2 g.L-1)PBS洗5 min×2，RNase A(100 mg.L-1)37℃作用30 min，经上述甘氨酸PBS洗涤后，再以40 g.L-1多聚甲醛后固定。再洗涤后，在细胞单层上滴加适量预热的杂交液，37℃作用30 min，用预热杂交液稀释DNA探针并置100℃变性5 min后速冷；倾去预杂交液，加入DNA探针(1～3 mg.L-1)；细心地盖上硅化盖玻片，边缘用石蜡油封闭后，置37℃杂交过夜。2×SSC、0.1% SDS洗10 min×2，0.1×SSC、0.1% SDS洗15 min×2后，按试剂盒说明书操作，进行免疫显色检测，出现颜色反应后，以TE终止反应。出现蓝紫色颗粒显色点为阳性杂交信号。常规脱水、透明、封固、照相记录。
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每次实验均设如下对照：阴性对照①HSV-1感染的人成纤维细胞(HF)对照；②无标记探针的HCMV感染的新生乳鼠细胞培养物对照；③正常新生乳鼠脑神经细胞培养物对照。阳性对照：HCMV感染HF细胞培养物。
2 结果
2.1 新生乳鼠大脑皮质神经元原代培养物形态观察 在倒置显微镜下，于鼠尾胶原片上培养48 h内的多数细胞呈小圆簇附于薄膜上，并有小突起细胞簇向外伸出。培养96 h以后，扁平多角形细胞开始形成，增多。两周后，形成神经胶质细胞层，具有各种长度和厚度的突起的神经元分散在胶质层上，突出的网络更加密集，与远处细胞相互接触。培养至3～4周时，未见明显细胞退变现象(图1A)。
图1 HCMV感染后2周新生乳鼠脑神经元的光镜观察, 百拇医药
A 正常神经元(↑，×200)； B HCMV感染的神经元(×200)
HCMV感染的神经元在培养第1周时可见到少数胶质细胞出现变圆肿胀，神经元形态明显改变发生在培养的第2周以后，镜下观察时可见神经元胞核肿胀，胞浆颗粒增多，折光性减弱，突起断裂。随着时间的延长，细胞裂解液化(图1B)。
2.2 原位杂交最适条件探索
2.2.1 消化液中蛋白酶K浓度的选择 经选用含10，20，50和100 mg.L-1四种不同浓度蛋白酶K的消化液作用于原代培养的HCMV感染的细胞单层后，进行原位杂交的结果发现，蛋白酶K浓度在10 mg.L-1时无杂交信号出现；而当蛋白酶K浓度大于100 mg.L-1时，细胞结构明显受损，出现破碎脱落现象，不利于结合细胞形态观察。蛋白酶K浓度以取20～50 mg.L-1为宜。
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2.2.2 杂交温度的选择 在25℃、37℃和42℃三种杂交温度下过夜进行的原位杂交结果显示，25℃时出现明显的非特异性反应，对照和试验组均有较多的背景斑点；用37℃和42℃杂交结果较好，对照组没有背景斑点出现。
2.3 原位杂交的特异性 用Dig标记的HCMV MIE和LA寡核苷酸探针分别与HSV-1感染的和用预杂交液代替杂交液的HCMV感染的新生乳鼠大脑皮质神经元进行杂交，结果与正常新生乳鼠大脑皮质神经元一样，无杂交信号出现(图2A)；同样，用上述Dig标记的探针与HCMV感染的新生乳鼠大脑皮质神经元进行杂交，在镜下即可观察到与HCMV感染的HF细胞相一致的结果，即在受染的细胞核内(图2B)及胞浆内(图2C)出现相应病毒核酸存在的蓝紫色杂交阳性信号。
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图2 新生乳鼠大脑皮质神经元原位杂交结果
A 正常细胞对照无杂交信号(×400)；
B HCMV感染神经元核内阳性杂交信号(×1 000)；
C HCMV感染神经元核内及胞浆内阳性杂交信号(×400)
2.4 两种Dig标记HCMV寡核苷酸探针原位杂交检测结果 对42片载有感染HCMV新生乳鼠大脑皮质神经元不同培养时间的盖玻片和同时设置的36片正常新生乳鼠大脑皮质神经元盖玻片进行了原位杂交检测，结果显示：用Dig标记的HCMV MIE和LA寡核苷酸探针与正常新生乳鼠大脑皮质原代培养的神经元原位杂交均为阴性；而受HCMV感染的神经元，MIE寡核苷酸探针在感染后的第4～5天即可在核内检出相应病毒核酸，杂交阳性信号呈灶性分布(见图2B)；随着感染时间的延长，用LA寡核苷酸探针则可在感染后第10～28天神经元的核内和胞浆内稳定地检出该病毒核酸；镜下可见蓝紫色杂交阳性信号已充满整个细胞(见图2C)，表明此时细胞结构已全部被病毒破坏。因此，同一批样本同时分别使用两种探针检测，可避免假阴性，提高准确性。
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3 讨论
HCMV AD169株作为HCMV标准毒株已在体外广泛传代并冷藏多年，已有实验证实，HCMV AD169株在体外除可感染人成纤维细胞株外，还可感染巨噬细胞〔4〕、外周血单核细胞〔5〕、脑毛细血管内皮细胞〔6〕和神经细胞〔7〕；在实验动物体内可致家兔〔8〕和小白鼠〔9〕全身感染。此表明，经过长期体外传代的AD169株宿主范围已变得相当广泛。本研究经体外活细胞病毒感染物观察及Dig标记HCMV特异性寡核苷酸探针进行原位杂交检测证实，HCMV AD169株可感染新生乳鼠脑神经细胞。这更进一步表明，此毒株基因组已发生变异，且变异部位可能发生在编码病毒包膜基因组上，导致病毒包膜上氨基酸的种类及排列顺序发生相应变化，使病毒宿主范围变宽。这些，将有待今后研究证实。
HCMV感染体外人脑神经细胞培养物的研究已有报道，但实验所需的人胚脑组织来源受限，不易得到。我们在新生乳鼠脑组织制备的原代细胞培养物上试用HCMV感染，根据观察鉴定结果证明，HCMV确能感染新生乳鼠脑神经细胞，有明显CPE，且CPE主要特征与在人细胞来源的培养物上一致。由于新生乳鼠价廉，易得，取材方便，且新生乳鼠脑神经细胞可被HCMV感染，这将促进对HCMV致中枢神经系统感染发生机制的更深入的基础研究。促进抗HCMV感染药物和疫苗研制的基础研究。
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本研究采用德国Boehringer Mannheim公司推出的新型Dig DNA标记及检测系统，从实验结果来看，有如下优点：①杂交结果直接与细胞类型、细胞形态相联系，经感染处理后，细胞着色有深有浅，提示同一细胞受感染病变的程度不同；也表明不同细胞有不同的感染状态。②本法操作相对简便，只需少量细胞便可。③用地高辛标记探针，避免了使用同位素，灵敏度与同位素相当，又没有生物素标记探针有内源性生物素干扰的缺点。这使得检测本底更低，特异性更高，定位更精确。
基金项目：安徽省教委自然科学基金资助项目和安徽省科委自然科学基金资助项目(95-医-018)
作者简介：王明丽，43岁，副教授
参考文献
1 Gibson W, Structural and nonstructural proteins of strain colburn cytomegalovirus. Virology, 1981;111:516～537
, 百拇医药
2 Smith KL, Kulski JK, Cobain T et al. Detection of cytomegalovirus in blood donor by the polymerase chain reaction. Transfusion, 1993;33(6):497～503
3 吴希如，张 一，马守兴等.胚鼠大脑皮层神经细胞的体外原代分离单层培养方法.北京医学院学报，1983；15(3)：169～172
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1999-06-15收稿, 百拇医药