三种分离皮肤方法提取表皮下大疱病相关抗原比较
作者：杨 森 张学军 王再兴 王培光 杨春俊 刘江波
单位：杨 森 张学军 王再兴 王培光 杨春俊 刘江波 安徽医科大学第一附属医院皮肤科，合肥 230022
关键词：皮肤疾病；水疱大疱性；抗原
安徽医科大学学报990402
摘要：目的 比较提取表皮下大疱病相关抗原的三种分离皮肤方法。方法 采用盐裂法、EDTA分离法、热分离法提取真、表皮抗原，免疫印迹检测提取物中抗原的活性，结果 三种方法均可用于SABD抗原的提取，但热分离法在所提取抗原的敏感性上明显优于其他两种方法。结论 热分离法对抗原活性影响最小，值得优先选择和运用。
中国图书资料分类法分类号：R382.11；R758.66
, http://www.100md.com Comparison of three techniques of separating skin
for extracting antigens related to SABD
Yang Sen, Zhang Xuejun, Wang Zaixing et al
(Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230022)
Abstract Objective To compare three methods extracting antigens related to SABD from human skin. Methods Three techniques of 1 mol.L-1 NaCl, 0.1 mol.L-1 EDTA and heat-separated skin were used to isolate dermal and epidermal antigens. The activity of antigens from extract was detected by immunoblotting. Results Three techniques might extract SABD antigens, but the sensitivity of antigens from heat-separated skin was higher than the other two. Conclusion Heat seperation technique produces the least influence on antigen activity and is the first choice.
, 百拇医药
MeSH skin diseases, vesiculobullous; antigens
利用两种盐裂皮肤免疫荧光方法(IIF、DIF)确诊的大疱性类天疱疮(BP)、线性IgA大疱病(LAD)、大疱性系统性红斑狼疮(BSLE)和获得性大疱性表皮松解症(EBA)血清，免疫印迹(IB)检测盐裂法、EDTA分离法和热分离法提取的表皮和真皮抗原，比较三种方法提取表皮下自身免疫性大疱病(SABD)相关抗原的敏感性，观察三种方法对SABD抗原活性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 所有病例来自我科收住院的SABD病人，经IIF、DIF确诊，其中BP 10例，EBA 3例， BSLE 3例，LAD 3例。
1.2 方法
, http://www.100md.com 1.2.1 1 mol.L-1 NaCl盐裂皮肤法〔1〕 取尸检皮肤去除皮下脂肪，置于1 mol.L-1 NaCl溶液中，4℃，72 h连续搅拌。分离真、表皮，表皮置盐裂皮肤表皮提取液(31.2 mmol.L-1 Tris-HCl，含2%SDS， 0.1 mol.L-1 DTT，1 mmol.L-1 PMSF，2 mmol.L-1EDTA， pH6.8)中，组织匀浆，4℃超声破碎30 s×3次。真皮置盐裂皮肤真皮提取液(12.5 mmol.L-1 Tris-HCl，含8 mol.L-1尿素，0.1 mol.L-1 DTT， 1 mmol.L-1 PMSF， 2 mmol.L-1，EDTA pH6.8)中，室温下震荡1 h。表皮和真皮处理液离心，10 000 r.min-1， 18℃, 1 h。分别收集上清液，即为表皮抗原提取物与真皮抗原提取物，-50℃保存。
, 百拇医药
1.2.2 0.1 mol.L-1EDTA分离皮肤法〔2〕 取尸检皮肤置0.1 mol.L-1EDTA溶液(0.1 mol.L-1 EDTA， 1 mol.L-1 NaCl， 50 μmol.L-1 PMSF)中，4℃，72 h连续搅拌，分离真、表皮。表皮和真皮分别放于EDTA分离皮肤法的抗原提取液(8 mol.L-1尿素，0.1 mol.L-1EDTA， 50 μmol.L-1PMSF， 0.3 mol.L-12ME)中，4℃过夜，摇动。过滤处理，分别收集滤液，即为表皮抗原和真皮抗原提取物，-50℃保存。
, 百拇医药 1.2.3 热分离皮肤法〔3〕 取正常人皮肤，去除皮下脂肪，削至0.5 mm左右厚度，冷生理盐水反复冲洗，将皮肤切成2 cm×2 cm大小，放入37℃热分离皮肤缓冲液中10 min，后放入56℃热分离皮肤缓冲液中40 s，迅速冷却，用手术刀背轻轻分离表皮和真皮。表皮放入热分离表皮提取液(65 mmol.L-1 Tris-HCl，含2 mmol.L-1PMSF， 10 mmol.L-1 EDTA， 10 mg.L-1pepstatin, 10 mg.L-1 antipain, 10 mg.L-1 leupeptin, 10 mg.L-1 chymostotin, 2% SDS, pH6.8)中，4℃环境组织匀浆，匀浆液置塑料离心管液氮中反复冻融10 min×3次。真皮充分剪碎放入热分离真皮提取液(25 mmol.L-1 Tris-HCl, 含8 mol.L-1尿素，5% 2ME， 10 mmol.L-1 PMSF，10 mmol.L-1 EDTA， 2%SDS， pH6.8)中，37℃震荡1 h。表皮和真皮处理物离心，15 000 r.min-1，8℃，30 min，收集上清液再重复离心一次。分别收集上清液，即为热分离表皮抗原提取物和真皮抗原提取物，-50℃保存。
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1.2.4 免疫印迹法〔4〕 采用7.5%分离胶和4%浓缩胶。人表皮抗原提取物经SDS-PAGE和转移电泳，将抗原转印至硝酸纤维膜(NC)上。NC置于0.1% Tween-20-5%BSA-PBS中封闭5 h，切成3 mm宽，置于反应槽内，加入经血清稀释液(50 mmol.L-1 Tris-ΗCl, pH 7.4，含0.5 mol.L-1 NaCl, 0.5% BSA, 0.3% Tween-20)1∶10稀释的待检血清，室温平缓摇动4 h，倾去反应液，用洗涤液(10 mmol.L-1 Tris-HCl, pH7.4, 含0.5 mol.L-1 NaCl, 0.3% Tween-20)漂洗10 min×4次，加入按1∶400稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(Sigma产品)或兔抗人IgA抗体(Sigma产品)室温平缓摇动1 h，倾去反应液，用洗涤漂洗10 min×4次，甩干后加入新配制的DAB底物液(0.6 g.L-1DAB，0.03%H2O2)，观察出现较明显区带后用双蒸水冲洗终止反应。与标准标准蛋白对照，计算阳性条带分子质量的大小。
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2 结果
从表从表1可以看出，三种分离法可提取真皮290 ku抗原，盐裂法和热分离法可提取230 ku和165 ku的BP抗原，但热分离法还提取200 ku、180 ku、130 ku、115 ku和97 ku抗原，并提取与LAD血清中IgA型抗体结合的真皮和表皮115 ku和97 ku抗原。EDTA法未提出BP抗原和LAD相关抗原，盐裂法也未提出LAD相关抗原。对照血清阴性反应。
表1 三种分离法提取SABD抗原结果比较
例数(n)
盐裂法(例数)
EDTA分离法(例数)
热分离法(例数)
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表皮抗原
真皮抗原
表皮抗原
真皮抗原
表皮抗原
真皮抗原
BP
10
230 ku(6)
230 ku(4)
165 ku(4)
200 ku(1)
180 ku(1)
, http://www.100md.com
165 ku(6)
130 ku(1)
115 ku(1)
97 ku(1)
EBA
3
290 ku(3)
290 ku(2)
290 ku(3)
BSLE
2
290 ku(1)
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290 ku(1)
290 ku(1)
LAD
2
115 ku(2)
115 ku(1)
97 ku(2)
97 ku(1)
3 讨论
分离人皮肤真、表皮技术有多种，在研究分离人皮肤真、表皮技术有多种，在研究SABD相关抗原时，为了制备表皮和真皮抗原，多采用1 mol.L-1 NaCl盐裂法、负压吸疱法、EDTA分离法和热分离法等〔5〕。本文比较1 mol.L-1 NaCl法、EDTA法和热分离法三种方法提取SABD相关抗原的敏感性，除热分离法制备表皮抗原过程按文献方法加以修改，其余方法均按文献进行。
, 百拇医药
0.1 mol.L-1 EDTA分离真表皮所提取的表皮抗原和真皮抗原进行IB检查，BP血清未见与表皮提取物反应，也未见LABD血清与真皮提取物中285 ku抗原反应，Wojnarowska〔6〕实验结果认为285 ku抗原为LAD抗原，但本文EBA血清中IgG型BMZ-Ab均结合真皮提取物中290 ku抗原，表明此为EBA抗原。本文未能重复出Wojnarowska试验结论可能与试验条件有关。
目前，主要应用盐裂法分离真表皮来制备BP抗原和EBA抗原提取物。本文按1 mol.L-1 NaCl分离真表皮提取BP抗原和EBA抗原的方法制备表皮和真皮抗原，IB结果显示BP血清与表皮抗原中230 ku和(或)165 ku抗原反应，EBA血清和BSLE血清与真皮抗原中290 ku抗原反应。本文结果进一步证实，盐裂法适应于BP抗原和EBA抗原提取，但盐裂法所提取的抗原未见与LAD血清反应，可能与LAD患者例数较少有关。
, 百拇医药
热分离真表皮也可用于提取BP抗原〔7〕。本文结果显示，热分离提取的表皮抗原和真皮用于IB时，BP血清中IgG型BMZ-Ab主要结合表皮抗原中230 ku和165 ku抗原，少数也结合200 ku、180 ku、130 ku、115 ku、97 ku等抗原；EBA血清中IgG型BMZ-Ab结合真皮抗原中290 ku抗原；LAD血清中IgA型BMZ-Ab结合表皮抗原和真皮抗原中115 ku和97 ku抗原。与盐裂法和EDTA法相比，热分离法提取的表皮抗原和真皮抗原更适用于BP、EBA和LAD的相关抗原研究和IB法检测SABD特异性自身抗体。
与热分离法相比，盐裂法和EDTA分离真皮和表皮时间较长，需3天左右，对皮肤抗原活性可能产生影响；热分离法消耗时间较短，对皮肤抗原影响较小。在用盐裂分离真、表皮时，加入PMSF等蛋白酶抑制剂可明显减少SABD抗原活性的丢失。尽管对热分离真表皮的位置未做详细超微结构研究，但小鼠动物实验的光镜证实热分离皮肤部位在表皮基底细胞层，可能类似盐裂皮肤的部位—透明板下方。
, http://www.100md.com
热分离的表皮提取液中，除加适量EDTA和PMSF起抑制蛋白分解变性作用外，还有Pepstatin、leupeptin、antipain、chymostotin四种蛋白酶抑制剂。防止组织匀浆过程中蛋白抗原分解。以往提取表皮抗原常用超声波破碎法。本文用液氮反复冻融法同样达到促使细胞破碎和抗原释放的作用，同时也避免了超声处理过程产热对抗原活性的影响。液氮冻融过程最好采取速冻融方法使组织细胞因膨胀而破裂，蛋白抗原释放。
热分离真表皮时，皮肤厚度及温度均至关重要，皮肤太厚，皮肤BMZ在缓冲液中40 s内不能达到有效温度-56℃，真皮与表皮难以分离，因此，除了37℃预温皮肤外，应尽量除去皮下脂肪后，将皮肤削成0.5 mm厚，除去较厚的真皮。另外，取皮位置也对回收抗原量有一定的影响。我们最近研究发现，寻常型天疱疮抗原、BP抗原、EBA抗原在身体不同部位抗原表达率不一样，如BP抗原表达率较高部位是肘窝、上背等，而EBA抗原表达率较高部位为膝、足背、肘等〔8〕。
, 百拇医药
用IB检测SABD时，应选取合适的真、表皮分离方法。我们结果表明，热分离法较另外两种方法相比，对抗原活性影响最小，可更敏感地检测表皮下大疱病，因此值得优先选择和运用。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(编号 39570659)；
安徽省自然科学基金资助课题(编号 97424005)
作者简介：杨 森，女，43岁，主任医师，硕士生导师
参考文献
1 Zhu XJ, Niimi Y, Bystryn JL. Epidermolysis bullousa acquisita; Incidence in patients with basement membrane zone antibodies. Arch Dermatol, 1990;126(5):171～174
, 百拇医药
2 Wojnarowska F, Whitehead P, Leigh IM et al. Identification of the target antigen in chronic bullous diseases of childhood and linear IgA diseases of adults. Br J Dermatol, 1991;124(3):157～162
3 Bernard P, Didierjean L, Denis F et al. Heterogenous bullous pemphigoid antibodies: Detection and characterization by immunoblotting when absent by indirect immunofluorescence. J Invest Dermatol, 1989:94(2):107～113
4 李允鹤主编.寄生虫免疫学及免疫诊断.第1版，南京：江苏科学技术出版社，1991：410～411
, 百拇医药
5 林 麟综述.真表皮分离技术在大疱性皮肤病研究中的应用.国外医学皮肤性病学分册，1993；19(5)：65～68
6 Wojnarowska F, Whitehead P, Leigh IM et al. Identification of the target antigen in chronic bullous diseases of childhood and linear IgA diseases of adults. Br J Dermatol, 1991;124(4):157～162
7 Meyer LJ, Taylor TB, Kadunce DP et al. Bullous pemphigoid antigens: Extraction and degradation of antigens during epdermal preparation. J Invest Dermatol, 1991;96(1):991～993
8 张学军，翁孟武，杨慧兰等.三种大疱病抗原在正常人皮肤不同部位的表达.上海免疫学杂志，1993；13(3)：342～344
1999-06-20收稿, http://www.100md.com
单位：杨 森 张学军 王再兴 王培光 杨春俊 刘江波 安徽医科大学第一附属医院皮肤科，合肥 230022
关键词：皮肤疾病；水疱大疱性；抗原
安徽医科大学学报990402
摘要：目的 比较提取表皮下大疱病相关抗原的三种分离皮肤方法。方法 采用盐裂法、EDTA分离法、热分离法提取真、表皮抗原，免疫印迹检测提取物中抗原的活性，结果 三种方法均可用于SABD抗原的提取，但热分离法在所提取抗原的敏感性上明显优于其他两种方法。结论 热分离法对抗原活性影响最小，值得优先选择和运用。
中国图书资料分类法分类号：R382.11；R758.66
, http://www.100md.com Comparison of three techniques of separating skin
for extracting antigens related to SABD
Yang Sen, Zhang Xuejun, Wang Zaixing et al
(Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230022)
Abstract Objective To compare three methods extracting antigens related to SABD from human skin. Methods Three techniques of 1 mol.L-1 NaCl, 0.1 mol.L-1 EDTA and heat-separated skin were used to isolate dermal and epidermal antigens. The activity of antigens from extract was detected by immunoblotting. Results Three techniques might extract SABD antigens, but the sensitivity of antigens from heat-separated skin was higher than the other two. Conclusion Heat seperation technique produces the least influence on antigen activity and is the first choice.
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MeSH skin diseases, vesiculobullous; antigens
利用两种盐裂皮肤免疫荧光方法(IIF、DIF)确诊的大疱性类天疱疮(BP)、线性IgA大疱病(LAD)、大疱性系统性红斑狼疮(BSLE)和获得性大疱性表皮松解症(EBA)血清，免疫印迹(IB)检测盐裂法、EDTA分离法和热分离法提取的表皮和真皮抗原，比较三种方法提取表皮下自身免疫性大疱病(SABD)相关抗原的敏感性，观察三种方法对SABD抗原活性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 所有病例来自我科收住院的SABD病人，经IIF、DIF确诊，其中BP 10例，EBA 3例， BSLE 3例，LAD 3例。
1.2 方法
, http://www.100md.com 1.2.1 1 mol.L-1 NaCl盐裂皮肤法〔1〕 取尸检皮肤去除皮下脂肪，置于1 mol.L-1 NaCl溶液中，4℃，72 h连续搅拌。分离真、表皮，表皮置盐裂皮肤表皮提取液(31.2 mmol.L-1 Tris-HCl，含2%SDS， 0.1 mol.L-1 DTT，1 mmol.L-1 PMSF，2 mmol.L-1EDTA， pH6.8)中，组织匀浆，4℃超声破碎30 s×3次。真皮置盐裂皮肤真皮提取液(12.5 mmol.L-1 Tris-HCl，含8 mol.L-1尿素，0.1 mol.L-1 DTT， 1 mmol.L-1 PMSF， 2 mmol.L-1，EDTA pH6.8)中，室温下震荡1 h。表皮和真皮处理液离心，10 000 r.min-1， 18℃, 1 h。分别收集上清液，即为表皮抗原提取物与真皮抗原提取物，-50℃保存。
, 百拇医药
1.2.2 0.1 mol.L-1EDTA分离皮肤法〔2〕 取尸检皮肤置0.1 mol.L-1EDTA溶液(0.1 mol.L-1 EDTA， 1 mol.L-1 NaCl， 50 μmol.L-1 PMSF)中，4℃，72 h连续搅拌，分离真、表皮。表皮和真皮分别放于EDTA分离皮肤法的抗原提取液(8 mol.L-1尿素，0.1 mol.L-1EDTA， 50 μmol.L-1PMSF， 0.3 mol.L-12ME)中，4℃过夜，摇动。过滤处理，分别收集滤液，即为表皮抗原和真皮抗原提取物，-50℃保存。
, 百拇医药 1.2.3 热分离皮肤法〔3〕 取正常人皮肤，去除皮下脂肪，削至0.5 mm左右厚度，冷生理盐水反复冲洗，将皮肤切成2 cm×2 cm大小，放入37℃热分离皮肤缓冲液中10 min，后放入56℃热分离皮肤缓冲液中40 s，迅速冷却，用手术刀背轻轻分离表皮和真皮。表皮放入热分离表皮提取液(65 mmol.L-1 Tris-HCl，含2 mmol.L-1PMSF， 10 mmol.L-1 EDTA， 10 mg.L-1pepstatin, 10 mg.L-1 antipain, 10 mg.L-1 leupeptin, 10 mg.L-1 chymostotin, 2% SDS, pH6.8)中，4℃环境组织匀浆，匀浆液置塑料离心管液氮中反复冻融10 min×3次。真皮充分剪碎放入热分离真皮提取液(25 mmol.L-1 Tris-HCl, 含8 mol.L-1尿素，5% 2ME， 10 mmol.L-1 PMSF，10 mmol.L-1 EDTA， 2%SDS， pH6.8)中，37℃震荡1 h。表皮和真皮处理物离心，15 000 r.min-1，8℃，30 min，收集上清液再重复离心一次。分别收集上清液，即为热分离表皮抗原提取物和真皮抗原提取物，-50℃保存。
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1.2.4 免疫印迹法〔4〕 采用7.5%分离胶和4%浓缩胶。人表皮抗原提取物经SDS-PAGE和转移电泳，将抗原转印至硝酸纤维膜(NC)上。NC置于0.1% Tween-20-5%BSA-PBS中封闭5 h，切成3 mm宽，置于反应槽内，加入经血清稀释液(50 mmol.L-1 Tris-ΗCl, pH 7.4，含0.5 mol.L-1 NaCl, 0.5% BSA, 0.3% Tween-20)1∶10稀释的待检血清，室温平缓摇动4 h，倾去反应液，用洗涤液(10 mmol.L-1 Tris-HCl, pH7.4, 含0.5 mol.L-1 NaCl, 0.3% Tween-20)漂洗10 min×4次，加入按1∶400稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(Sigma产品)或兔抗人IgA抗体(Sigma产品)室温平缓摇动1 h，倾去反应液，用洗涤漂洗10 min×4次，甩干后加入新配制的DAB底物液(0.6 g.L-1DAB，0.03%H2O2)，观察出现较明显区带后用双蒸水冲洗终止反应。与标准标准蛋白对照，计算阳性条带分子质量的大小。
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2 结果
从表从表1可以看出，三种分离法可提取真皮290 ku抗原，盐裂法和热分离法可提取230 ku和165 ku的BP抗原，但热分离法还提取200 ku、180 ku、130 ku、115 ku和97 ku抗原，并提取与LAD血清中IgA型抗体结合的真皮和表皮115 ku和97 ku抗原。EDTA法未提出BP抗原和LAD相关抗原，盐裂法也未提出LAD相关抗原。对照血清阴性反应。
表1 三种分离法提取SABD抗原结果比较
例数(n)
盐裂法(例数)
EDTA分离法(例数)
热分离法(例数)
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表皮抗原
真皮抗原
表皮抗原
真皮抗原
表皮抗原
真皮抗原
BP
10
230 ku(6)
230 ku(4)
165 ku(4)
200 ku(1)
180 ku(1)
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165 ku(6)
130 ku(1)
115 ku(1)
97 ku(1)
EBA
3
290 ku(3)
290 ku(2)
290 ku(3)
BSLE
2
290 ku(1)
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290 ku(1)
290 ku(1)
LAD
2
115 ku(2)
115 ku(1)
97 ku(2)
97 ku(1)
3 讨论
分离人皮肤真、表皮技术有多种，在研究分离人皮肤真、表皮技术有多种，在研究SABD相关抗原时，为了制备表皮和真皮抗原，多采用1 mol.L-1 NaCl盐裂法、负压吸疱法、EDTA分离法和热分离法等〔5〕。本文比较1 mol.L-1 NaCl法、EDTA法和热分离法三种方法提取SABD相关抗原的敏感性，除热分离法制备表皮抗原过程按文献方法加以修改，其余方法均按文献进行。
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0.1 mol.L-1 EDTA分离真表皮所提取的表皮抗原和真皮抗原进行IB检查，BP血清未见与表皮提取物反应，也未见LABD血清与真皮提取物中285 ku抗原反应，Wojnarowska〔6〕实验结果认为285 ku抗原为LAD抗原，但本文EBA血清中IgG型BMZ-Ab均结合真皮提取物中290 ku抗原，表明此为EBA抗原。本文未能重复出Wojnarowska试验结论可能与试验条件有关。
目前，主要应用盐裂法分离真表皮来制备BP抗原和EBA抗原提取物。本文按1 mol.L-1 NaCl分离真表皮提取BP抗原和EBA抗原的方法制备表皮和真皮抗原，IB结果显示BP血清与表皮抗原中230 ku和(或)165 ku抗原反应，EBA血清和BSLE血清与真皮抗原中290 ku抗原反应。本文结果进一步证实，盐裂法适应于BP抗原和EBA抗原提取，但盐裂法所提取的抗原未见与LAD血清反应，可能与LAD患者例数较少有关。
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热分离真表皮也可用于提取BP抗原〔7〕。本文结果显示，热分离提取的表皮抗原和真皮用于IB时，BP血清中IgG型BMZ-Ab主要结合表皮抗原中230 ku和165 ku抗原，少数也结合200 ku、180 ku、130 ku、115 ku、97 ku等抗原；EBA血清中IgG型BMZ-Ab结合真皮抗原中290 ku抗原；LAD血清中IgA型BMZ-Ab结合表皮抗原和真皮抗原中115 ku和97 ku抗原。与盐裂法和EDTA法相比，热分离法提取的表皮抗原和真皮抗原更适用于BP、EBA和LAD的相关抗原研究和IB法检测SABD特异性自身抗体。
与热分离法相比，盐裂法和EDTA分离真皮和表皮时间较长，需3天左右，对皮肤抗原活性可能产生影响；热分离法消耗时间较短，对皮肤抗原影响较小。在用盐裂分离真、表皮时，加入PMSF等蛋白酶抑制剂可明显减少SABD抗原活性的丢失。尽管对热分离真表皮的位置未做详细超微结构研究，但小鼠动物实验的光镜证实热分离皮肤部位在表皮基底细胞层，可能类似盐裂皮肤的部位—透明板下方。
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热分离的表皮提取液中，除加适量EDTA和PMSF起抑制蛋白分解变性作用外，还有Pepstatin、leupeptin、antipain、chymostotin四种蛋白酶抑制剂。防止组织匀浆过程中蛋白抗原分解。以往提取表皮抗原常用超声波破碎法。本文用液氮反复冻融法同样达到促使细胞破碎和抗原释放的作用，同时也避免了超声处理过程产热对抗原活性的影响。液氮冻融过程最好采取速冻融方法使组织细胞因膨胀而破裂，蛋白抗原释放。
热分离真表皮时，皮肤厚度及温度均至关重要，皮肤太厚，皮肤BMZ在缓冲液中40 s内不能达到有效温度-56℃，真皮与表皮难以分离，因此，除了37℃预温皮肤外，应尽量除去皮下脂肪后，将皮肤削成0.5 mm厚，除去较厚的真皮。另外，取皮位置也对回收抗原量有一定的影响。我们最近研究发现，寻常型天疱疮抗原、BP抗原、EBA抗原在身体不同部位抗原表达率不一样，如BP抗原表达率较高部位是肘窝、上背等，而EBA抗原表达率较高部位为膝、足背、肘等〔8〕。
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用IB检测SABD时，应选取合适的真、表皮分离方法。我们结果表明，热分离法较另外两种方法相比，对抗原活性影响最小，可更敏感地检测表皮下大疱病，因此值得优先选择和运用。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(编号 39570659)；
安徽省自然科学基金资助课题(编号 97424005)
作者简介：杨 森，女，43岁，主任医师，硕士生导师
参考文献
1 Zhu XJ, Niimi Y, Bystryn JL. Epidermolysis bullousa acquisita; Incidence in patients with basement membrane zone antibodies. Arch Dermatol, 1990;126(5):171～174
, 百拇医药
2 Wojnarowska F, Whitehead P, Leigh IM et al. Identification of the target antigen in chronic bullous diseases of childhood and linear IgA diseases of adults. Br J Dermatol, 1991;124(3):157～162
3 Bernard P, Didierjean L, Denis F et al. Heterogenous bullous pemphigoid antibodies: Detection and characterization by immunoblotting when absent by indirect immunofluorescence. J Invest Dermatol, 1989:94(2):107～113
4 李允鹤主编.寄生虫免疫学及免疫诊断.第1版，南京：江苏科学技术出版社，1991：410～411
, 百拇医药
5 林 麟综述.真表皮分离技术在大疱性皮肤病研究中的应用.国外医学皮肤性病学分册，1993；19(5)：65～68
6 Wojnarowska F, Whitehead P, Leigh IM et al. Identification of the target antigen in chronic bullous diseases of childhood and linear IgA diseases of adults. Br J Dermatol, 1991;124(4):157～162
7 Meyer LJ, Taylor TB, Kadunce DP et al. Bullous pemphigoid antigens: Extraction and degradation of antigens during epdermal preparation. J Invest Dermatol, 1991;96(1):991～993
8 张学军，翁孟武，杨慧兰等.三种大疱病抗原在正常人皮肤不同部位的表达.上海免疫学杂志，1993；13(3)：342～344
1999-06-20收稿, http://www.100md.com