急性白血病P-糖蛋白表达及其临床意义
作者：鲍扬漪 朱晓梅 何皖伟 聂泽丰 高 蓉 时 峰 史杏英 牛 玲
单位：鲍扬漪 朱晓梅 何皖伟 牛 玲 合肥市第一人民医院血液、肿瘤科，合肥 230061；聂泽丰 高 蓉 时 峰 史杏英 淮北矿工总医院血液科，淮北 235000
关键词：白血病；药物疗法；P糖蛋白；抗药性；多药
安徽医科大学学报990622摘要 目的 评价骨髓涂片急性白血病(AL)细胞中P-糖蛋白(Pgp)表达及其临床意义。方法 采用免疫组化S-P法检测51例AL患者骨髓涂片白血病细胞中Pgp表达的阳性率。结果 51例AL Pgp阳性率为27.5%，Pgp阳性的急性非淋巴细胞白血病以M4、M5表达率较高，而8例M3无1例阳性表达。初治组AL Pgp阳性率为19.5%，复发难治组阳性率为60.0%，后者高于前者(P<0.05)。Pgp阳性者完全缓解率(CR率)为25%，而阴性者CR率为78.5%(P<0.05)。结论 Pgp过度表达与AL患者的化疗疗效及预后密切相关。
, 百拇医药
MeSH leukemia/drug therapy; p-glycoprotein; drug resistance, multiple
中国图书资料分类法分类号 R733.7
化疗仍是目前治疗急性白血病(AL)的主要方法。尽管不断有新的化疗药物和改进的化疗方案推出，但白血病细胞所表现的耐药却一直是造成治疗失败最主要的原因。近年来多药耐药基因(MDR1)的发现及其该基因所编码的蛋白(Pgp)抗药机制的阐明，为解除白血病细胞抗药性问题带来希望。我们应用免疫组化S-P法，研究Pgp在AL骨髓涂片白血病细胞中的表达情况，并探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 病例 51例AL患者按FAB分型，部分经免疫分型证实。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)20例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)30例，杂合细胞白血病(HAL)1例。男性26例，女性25例，年龄4～70岁，中位年龄30岁。按治疗情况分为：初治组41例;复发/难治组(标准诱导化疗2个以上疗程未获CR及第1次CR后6个月内复发者为难治性AL)10例。
, 百拇医药
1.2 治疗方案 初治组:ANLL用DA、DHA、MA、MHA(D为柔红霉素，H为高三尖杉酯碱，M为米妥蒽醌，A为阿糖胞苷)行诱导缓解治疗；M3用维甲酸加或不加小剂量化疗。ALL采用VDP或VDCP、MOAP方案化疗。复发/难治组换用未曾用过的上述方案或IA(V为长春新碱、C为环磷酰胺、I为去甲氧柔红霉素)或加大原诱导方案剂量，或加用VP16，中剂量MTX，左旋门冬酰胺酶治疗。疗效评定按文献标准〔1〕。
正常对照9例,其中2例为缺铁性贫血，2例为特发性血小板减少性紫癜，2例风湿病，3例溶血性贫血。
1.3 免疫组化染色 肝素抗凝，用Ficoll分层液，分离单个核细胞，加入20%小牛血清20 μl，推片自然干燥，以95%乙醇固定10 min，清水冲洗干燥后锡纸包裹，置冰箱冷藏室贮存备检。对骨髓增生活跃者也可用骨髓直接涂片，按上述方法固定，保存备检。采用免疫组化S-P法，第一抗体鼠抗Pgp(mouse antiplycoprotin,JSB-1)、Pgp阳性对照片及SP试剂盒均购自福州迈新公司。染色方法按常规免疫组化(S-P)进行,DAB显色,苏木素复染后,光镜观察,以Pgp阳性细胞>5%判定Pgp阳性。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 组间比较用χ2检验。
2 结果
2.1 Pgp表达特点 阳性对照片细胞Pgp阳性率≥90%，9例正常对照片5例呈低度表达，表达率≤5%(1%～5%)。不同AL个体Pgp阳性率及表达类型不同，Pgp阳性细胞0～95%，平均为7.3%±14.2%,14例(27.5%)患者Pgp阳性表达,其中7例≥20%。Pgp阳性细胞可以表现为胞浆内充满许多棕黄色粗颗粒的强反应,很容易计数,也可以表现为胞浆内弥漫性淡棕色细颗粒。
2.2 Pgp表达与FAB亚型关系 30例ANLL,9例Pgp阳性表达,阳性率为30.0%。ALL 20例中5例Pgp阳性表达，阳性率25.0%，ANLL与ALL两者之间差异无显著性(P>0.05)。Pgp表达与FAB各亚型关系见表1。
, 百拇医药
表1 Pgp表达与FAB亚型的关系 Pgp
FAB亚型(例)
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
L1
, 百拇医药
L2
L3
HAL
阳性
0
4
0
3
2
0
0
2
3
, 百拇医药
0
0
阴性
1
10
8
1
1
0
0
7
7
1
1
, 百拇医药
ANLL各亚型间比较P<0.01，ALL各亚型间比较P>0.052.3 初治组与复发/难治组的Pgp表达情况 见表2。
表2 急性白血病各组Pgp表达情况 组别
例数
Pgp阳性率
初治组
41
19.5%(8/41)
复发/难治组
10
60.0%(6/10)*
, 百拇医药
与初治组比较：*P<0.05
2.4 Pgp与疗效关系 51例AL患者中仅26例完成2疗程以上的标准化疗且资料完整。(M3因初治时均用维甲酸加或不加小剂量化疗故不包括在26例以内。)其Pgp与2疗程缓解率关系见表3。
表3 Pgp与疗效关系 Pgp
CR
NR
CR率(%)
P+gp
3
, 百拇医药
9
25.0
P-gp
11
3
78.5*
与P+gp比较：*P<0.053 讨论
MDR1是血液系统恶性肿瘤治疗失败及复发的一个主要原因。大多数研究证明MDR1基因过度表达是AL治疗失败的重要指标，我们的研究也证实了这一点。
本组应用免疫组化S-P法检测AL患者骨髓涂片白血病细胞中Pgp的表达，该方法操作简单，重复性好，不需要特殊设备，尤其适用于基层医院，有一定的临床实用价值。
, 百拇医药
在本组研究中，9例良性血液病骨髓涂片有5例Pgp低度表达(1%～5%)，国内外文献〔2，3〕亦有类似报道，这可能与机体的防御功能有关〔4〕。51例AL Pgp阳性率为27.5%，不同的个体之间表达阳性率有很大异质性，表达类型也有所不同。此结果与Jean等〔5〕所观察的结果一致。
国内外均有报道〔2，6〕，Pgp阳性的ANLL与其FAB亚型有一定的关系，以M3表达率最低，M5表达率较高。本组结果与此类似，8例M3无1例阳性表达，而M4、M5表达率最高。ANLL Pgp阳性率高于ALL，但差异无显著性，与文献〔3〕报道一致。
表2显示，复发/难治组AL Pgp阳性表达率高于初治组，这可能是由于长期应用化学药物诱导而产生获得性耐药。也表明Pgp与AL患者的复发难治有密切关系。本检测结果还提示，初治组也有一定程度(8/14)的Pgp表达，说明在这部分患者未经化疗时即已生产MDR现象。这种现象的存在可能是人体细胞固有的，这种固有的内在性耐药细胞在化疗药物的诱导下发生了强烈的耐药优势而表现为耐药〔7〕，也是导致Pgp阳性者CR率显著低于Pgp阴性者(25.0%与78.6%，P<0.05)的原因。表明Pgp阳性患者宜选用大剂量的化疗或非MDR相关的药物化疗，或考虑行骨髓移植，并试用一些MDR的逆转剂以改善预后。
, http://www.100md.com
综上所述Pgp的过度表达是AL细胞产生耐药的重要机制，P+gp表达者提示疗效差，并与复发难治密切相关，是预后不良的一个重要指标之一。
作者简介：鲍扬漪，女，41岁，副主任医师
参考文献
1 张之南主编. 血液病诊断及疗效标准. 天津:天津科学技术出版社,1991:190～191
2 Giovanni DP, Roberto S, Germano A et al. Clinical relevance of P-glycoprotein expression in de novo acute myeloid leukemia. Blood， 1996；87(75):1997～2004
, http://www.100md.com 3 栾风君，杨纯正，邵晓枫等.100例AL患者MDR检测分析. 中华肿瘤杂志，1994;16(9)：360～363
4 纪小龙，施作霖主编.诊断免疫组织化学. 北京：军事医学科学出版社，1997：252
5 Jean EG, Jean MD, Olivier F et al. Expression of the multidrug resistance-associated P-glycoprotein (P-170)in cases of de novo acute lymphoblastic leukemia: prognostic implications.Blood， 1993；81(9):2394～2398
6 栾风君，汤美华，杨纯正等. 急性髓细胞白血病患者mdr-1基因产物P170与其免疫表型和FAB分型的关系. 中华血液学杂志,1995；15(5)：238～240
7 徐从高.白血病多药耐药现象及其对策.国外医学肿瘤分册，1995；22(5)：299～302
1999-08-10收稿，1999-10-09修回, 百拇医药
单位：鲍扬漪 朱晓梅 何皖伟 牛 玲 合肥市第一人民医院血液、肿瘤科，合肥 230061；聂泽丰 高 蓉 时 峰 史杏英 淮北矿工总医院血液科，淮北 235000
关键词：白血病；药物疗法；P糖蛋白；抗药性；多药
安徽医科大学学报990622摘要 目的 评价骨髓涂片急性白血病(AL)细胞中P-糖蛋白(Pgp)表达及其临床意义。方法 采用免疫组化S-P法检测51例AL患者骨髓涂片白血病细胞中Pgp表达的阳性率。结果 51例AL Pgp阳性率为27.5%，Pgp阳性的急性非淋巴细胞白血病以M4、M5表达率较高，而8例M3无1例阳性表达。初治组AL Pgp阳性率为19.5%，复发难治组阳性率为60.0%，后者高于前者(P<0.05)。Pgp阳性者完全缓解率(CR率)为25%，而阴性者CR率为78.5%(P<0.05)。结论 Pgp过度表达与AL患者的化疗疗效及预后密切相关。
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MeSH leukemia/drug therapy; p-glycoprotein; drug resistance, multiple
中国图书资料分类法分类号 R733.7
化疗仍是目前治疗急性白血病(AL)的主要方法。尽管不断有新的化疗药物和改进的化疗方案推出，但白血病细胞所表现的耐药却一直是造成治疗失败最主要的原因。近年来多药耐药基因(MDR1)的发现及其该基因所编码的蛋白(Pgp)抗药机制的阐明，为解除白血病细胞抗药性问题带来希望。我们应用免疫组化S-P法，研究Pgp在AL骨髓涂片白血病细胞中的表达情况，并探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 病例 51例AL患者按FAB分型，部分经免疫分型证实。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)20例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)30例，杂合细胞白血病(HAL)1例。男性26例，女性25例，年龄4～70岁，中位年龄30岁。按治疗情况分为：初治组41例;复发/难治组(标准诱导化疗2个以上疗程未获CR及第1次CR后6个月内复发者为难治性AL)10例。
, 百拇医药
1.2 治疗方案 初治组:ANLL用DA、DHA、MA、MHA(D为柔红霉素，H为高三尖杉酯碱，M为米妥蒽醌，A为阿糖胞苷)行诱导缓解治疗；M3用维甲酸加或不加小剂量化疗。ALL采用VDP或VDCP、MOAP方案化疗。复发/难治组换用未曾用过的上述方案或IA(V为长春新碱、C为环磷酰胺、I为去甲氧柔红霉素)或加大原诱导方案剂量，或加用VP16，中剂量MTX，左旋门冬酰胺酶治疗。疗效评定按文献标准〔1〕。
正常对照9例,其中2例为缺铁性贫血，2例为特发性血小板减少性紫癜，2例风湿病，3例溶血性贫血。
1.3 免疫组化染色 肝素抗凝，用Ficoll分层液，分离单个核细胞，加入20%小牛血清20 μl，推片自然干燥，以95%乙醇固定10 min，清水冲洗干燥后锡纸包裹，置冰箱冷藏室贮存备检。对骨髓增生活跃者也可用骨髓直接涂片，按上述方法固定，保存备检。采用免疫组化S-P法，第一抗体鼠抗Pgp(mouse antiplycoprotin,JSB-1)、Pgp阳性对照片及SP试剂盒均购自福州迈新公司。染色方法按常规免疫组化(S-P)进行,DAB显色,苏木素复染后,光镜观察,以Pgp阳性细胞>5%判定Pgp阳性。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 组间比较用χ2检验。
2 结果
2.1 Pgp表达特点 阳性对照片细胞Pgp阳性率≥90%，9例正常对照片5例呈低度表达，表达率≤5%(1%～5%)。不同AL个体Pgp阳性率及表达类型不同，Pgp阳性细胞0～95%，平均为7.3%±14.2%,14例(27.5%)患者Pgp阳性表达,其中7例≥20%。Pgp阳性细胞可以表现为胞浆内充满许多棕黄色粗颗粒的强反应,很容易计数,也可以表现为胞浆内弥漫性淡棕色细颗粒。
2.2 Pgp表达与FAB亚型关系 30例ANLL,9例Pgp阳性表达,阳性率为30.0%。ALL 20例中5例Pgp阳性表达，阳性率25.0%，ANLL与ALL两者之间差异无显著性(P>0.05)。Pgp表达与FAB各亚型关系见表1。
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表1 Pgp表达与FAB亚型的关系 Pgp
FAB亚型(例)
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
L1
, 百拇医药
L2
L3
HAL
阳性
0
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0
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阴性
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10
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ANLL各亚型间比较P<0.01，ALL各亚型间比较P>0.052.3 初治组与复发/难治组的Pgp表达情况 见表2。
表2 急性白血病各组Pgp表达情况 组别
例数
Pgp阳性率
初治组
41
19.5%(8/41)
复发/难治组
10
60.0%(6/10)*
, 百拇医药
与初治组比较：*P<0.05
2.4 Pgp与疗效关系 51例AL患者中仅26例完成2疗程以上的标准化疗且资料完整。(M3因初治时均用维甲酸加或不加小剂量化疗故不包括在26例以内。)其Pgp与2疗程缓解率关系见表3。
表3 Pgp与疗效关系 Pgp
CR
NR
CR率(%)
P+gp
3
, 百拇医药
9
25.0
P-gp
11
3
78.5*
与P+gp比较：*P<0.053 讨论
MDR1是血液系统恶性肿瘤治疗失败及复发的一个主要原因。大多数研究证明MDR1基因过度表达是AL治疗失败的重要指标，我们的研究也证实了这一点。
本组应用免疫组化S-P法检测AL患者骨髓涂片白血病细胞中Pgp的表达，该方法操作简单，重复性好，不需要特殊设备，尤其适用于基层医院，有一定的临床实用价值。
, 百拇医药
在本组研究中，9例良性血液病骨髓涂片有5例Pgp低度表达(1%～5%)，国内外文献〔2，3〕亦有类似报道，这可能与机体的防御功能有关〔4〕。51例AL Pgp阳性率为27.5%，不同的个体之间表达阳性率有很大异质性，表达类型也有所不同。此结果与Jean等〔5〕所观察的结果一致。
国内外均有报道〔2，6〕，Pgp阳性的ANLL与其FAB亚型有一定的关系，以M3表达率最低，M5表达率较高。本组结果与此类似，8例M3无1例阳性表达，而M4、M5表达率最高。ANLL Pgp阳性率高于ALL，但差异无显著性，与文献〔3〕报道一致。
表2显示，复发/难治组AL Pgp阳性表达率高于初治组，这可能是由于长期应用化学药物诱导而产生获得性耐药。也表明Pgp与AL患者的复发难治有密切关系。本检测结果还提示，初治组也有一定程度(8/14)的Pgp表达，说明在这部分患者未经化疗时即已生产MDR现象。这种现象的存在可能是人体细胞固有的，这种固有的内在性耐药细胞在化疗药物的诱导下发生了强烈的耐药优势而表现为耐药〔7〕，也是导致Pgp阳性者CR率显著低于Pgp阴性者(25.0%与78.6%，P<0.05)的原因。表明Pgp阳性患者宜选用大剂量的化疗或非MDR相关的药物化疗，或考虑行骨髓移植，并试用一些MDR的逆转剂以改善预后。
, http://www.100md.com
综上所述Pgp的过度表达是AL细胞产生耐药的重要机制，P+gp表达者提示疗效差，并与复发难治密切相关，是预后不良的一个重要指标之一。
作者简介：鲍扬漪，女，41岁，副主任医师
参考文献
1 张之南主编. 血液病诊断及疗效标准. 天津:天津科学技术出版社,1991:190～191
2 Giovanni DP, Roberto S, Germano A et al. Clinical relevance of P-glycoprotein expression in de novo acute myeloid leukemia. Blood， 1996；87(75):1997～2004
, http://www.100md.com 3 栾风君，杨纯正，邵晓枫等.100例AL患者MDR检测分析. 中华肿瘤杂志，1994;16(9)：360～363
4 纪小龙，施作霖主编.诊断免疫组织化学. 北京：军事医学科学出版社，1997：252
5 Jean EG, Jean MD, Olivier F et al. Expression of the multidrug resistance-associated P-glycoprotein (P-170)in cases of de novo acute lymphoblastic leukemia: prognostic implications.Blood， 1993；81(9):2394～2398
6 栾风君，汤美华，杨纯正等. 急性髓细胞白血病患者mdr-1基因产物P170与其免疫表型和FAB分型的关系. 中华血液学杂志,1995；15(5)：238～240
7 徐从高.白血病多药耐药现象及其对策.国外医学肿瘤分册，1995；22(5)：299～302
1999-08-10收稿，1999-10-09修回, 百拇医药