正常汉族女性ACE基因多态性的研究
作者：曹云霞 庄广伦 汪 渊 周 青 刘 虎
单位：曹云霞 安徽医科大学第一附属医院妇产科，合肥 230022；庄广伦 中山医科大学第一附属医院妇产科，广州 510089；汪 渊 周 青 刘 虎 安徽医科大学分子生物学实验室，合肥 230032
关键词：肽基二肽酶A；多态现象(遗传学)；多聚酶链反应；汉族；女(雌)性
安徽医科大学学报990608摘要 目的 建立血管紧张素转换酶(ACE)基因型的分型方法，了解正常汉族女性ACE基因的多态性及频率分布。方法 应用多聚酶链反应(PCR)对30例正常汉族女性ACE基因进行分型并介绍该实验方法和操作。结果 正常汉族女性ACE基因有II(插入型)、DD(缺失型)、DI(杂合子)三种基因型，分别占56.7%、10%、33.3%,I等位基因频率为73.3%,D等位基因频率为26.7%。结论 PCR是检测ACE基因多态性的一种快速、简便的方法。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R392.2；R345
Polymorphism of the angiotensin-converting anzyme
in normal Chinese women
Cao Yunxia，Zhuang Guanglun， Wang Yuan et al
(Dept of Grynecology and Obstetrics,The First Affiliated
Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022)
Abstract Objective To establish a genotyping method for angiotensin-converting enzyme (ACE) gene and detect insertion/deletion (I/D)polymorphism of ACE in normal Chinese women. Methods Polymerase chain reaction (PCR) technique were employed to typing ACE gene of 30 normal women. Results The distribution of the II、DI、DD genotypes were 56.7%、33.3% and 10% respectively. The frequency of the I allele was 73.3%, and D allele 26.6%. Conclusion PCR technique is a rapid and simple method to detect polymorphism of ACE gene.
, 百拇医药
MeSH peptidyl-dipeptidase A; polymorphism/genetics; polymerase chain reaction;han nationality; female
血管紧张素转换酶(ACE)是肾素-血管紧张素系统的关键酶，它使血管紧张素Ⅰ(ATⅠ)转换为血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)而发挥作用。目前研究表明：肾素-血管紧张素系统(RAS)功能亢进，与女性多囊卵巢综合症(Pcos)及与此相关的非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)和心血管疾病密切相关，ACE是这一系统的关键酶，此酶受控于ACE基因，因此，将ACE基因作为候选基因进行研究。ACE基因位于人染色体17q23,其第16内含子中存在一段长度为287bp的插入片段，由于此片断的插入和缺失(I/D),产生Ⅱ(插入型)、DI(杂合子)及DD(缺失型)三种基因型〔1〕。本研究采用PCR方法对30例正常女性ACE基因多态性进行检测，以了解ACE基因型在正常女性中的分布情况。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 主要试剂和仪器 引物(由Life Technologies 公司合成)， TaqDNA，dNTP,MgCl2,PCR缓冲液，蛋白酶K,DNA Marker(购自华美生物工程公司)，Hema 480基因扩增仪(珠海黑马医学仪器有限公司产品)。
1.2 研究对象 30例标本取自安徽医科大学附院健康志愿者，年龄19～38岁，未婚10例，已婚并生育20例，体重指数(BMI=体重/身高2)<25，血压及月经周期正常，无多毛、痤疮，无糖尿病及心血管病家族史，无内分泌疾病，均为汉族。每人取全血5 ml放入肝素钠抗凝管中备用。
1.3 实验方法
1.3.1 模板DNA的制备 将抗凝血4 000 r.min-1离心5 min,吸取白细胞层以低渗溶血法〔2〕去除红细胞,离心得白细胞,将白细胞沉淀溶解在100 μl的DNA缓冲液(KCl,Tris-HCl,MgCl2,NP 40,Tween 20,蛋白酶K)中, 55℃孵育3 h, 95℃灭活10 min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀基因组DNA，干燥后溶于100 μl d H2O中备用。
, 百拇医药
1.3.2 PCR反应 参照Tiret等〔3〕引物设计方法，正义寡核甘酸引物序列：5′CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT 3′，反义寡核甘酸引物序列：5′GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT 3′。采用25 μl反应体系，在100 ng标本DNA模板液中分别加入PCR反应液(10 mmol.L-1 Tris,50 mmol.L-1 KCl, 2 mmol.L-1 MgCl2, 200 mmol.L-1 dNTPs,0.5 μmol.L-1引物及Taq DNA聚合酶)。置Hema480基因扩增仪中，97℃预变性5 min；95℃变性1 min；60℃退火1 min；72℃延伸1 min，共35个循环。
1.3.3 PCR产物的检测 取PCR产物8 μl, 加入含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳(60 mV,30 min),经紫外透射下检测，PCR Marker作为参照，进行多态性分析。
, 百拇医药
2 结果
正常女性ACE基因型共3种，见图1。
*在300 bp处一条暗带可能为非特异性扩增所致
图1 纯合子插入型(II): 在490bp处出现一条带，纯合子缺失型(DD):在190bp处出现一条带，杂合子(DI):在490bp及190bp处分别出现一条带(两条带)
统计结果分析：II型17例，频率为56.7%, DI型10例，频率为33.3%, DD型3例，频率为10%，I等位基因频率为73.3%, D等位基因频率为26.7%。
3 讨论
正常人ACE D、I等位基因频率有明显的种族差异，在意大利、挪威等国家，D型约占54%，I型约占46%〔4〕。亚洲人，I型所占比例相对较高，日本人D型占31%，I型占69%〔5〕。我们研究结果，正常汉族女性ACE基因型中以II型为多(56.7%)，I等位基因频率占73.3%，D等位基因频率占26.7%,与日本人相近。
, http://www.100md.com
1990年Rigat等〔6〕首先观察到了ACE基因多态性与血清血管紧张素转换酶(sACE)间的关系，此后陆续有报道ACE基因多态性与心血管疾病的关系,尤其是D等位基因可能是冠心病、高血压病发病的危险因子〔7〕。在多囊卵巢综合征(Pcos)病人，表现为RAS功能亢进〔8〕，其活性物质(ATⅡ)调节卵巢性激素合成，主要表现为睾酮(T)和孕酮(P)增加，雌二醇(E2)下降，即促进高雄激素血症形成，引起卵泡发育障碍，且研究已表明Pcos标志着非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的一个主要危险因素，将来有更大的危险性发展成心血管疾病。因此，我们建立正常汉族女性ACE基因多态性研究的方法，对进一步研究ACE基因多态性与Pcos病人不排卵及高雄激素血症的关系, 尤其是早期预测及预防由Pcos引起的NIDDM 及心血管疾病都有重大意义。
作者简介：曹云霞，女，36岁，博士生，副主任医师，副教授；
, 百拇医药
庄广伦，男，62岁，博士生导师，教授
参考文献
1 Rigat B, Hubert C, Corvol P et al. PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin-converting enzyme gene. Nucl Acids Res, 1992；20(5):1433
2 王申五主编. 基因诊断技术. 北京: 北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社, 1992:36～37
3 Tiret L, Riget B, Visviks S et al. Evidence, from combined segregation and linkage analysis, that a variant of the angiotensin-Ⅰ-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels. Am J Hum Genet, 1992；51(1):197～200
, 百拇医药
4 Cambien F, Poirier O, Lecerf L et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature, 1992；359(6396):641
5 Furuya K, Yamaguchi E, Itoh A et al. Reevaluation of serum enzyme levels in sarcoidosis by a polymorphism of the angiotensin-Ⅰ-converting enzyme gene (Abstract). Am Rev Respir Dis, 1993；147(5):A787
6 Rigat B, Hubert C, Alhens-Gelas F et al. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin-Ⅰ-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest, 1990；86(4):1343～1347
, http://www.100md.com
7 Mattu PK, Needbam EWA, Galton DJ et al. A DNA variant at the angiotensin-converting enzyme gene locus associates with coronary artery disease in the Caerphilly Heart Study. Circulation， 1995；91(2):270～273
8 Morris RS, Wong IL, Hatch IE et al. Prorenin is elevated in polycystic ovary syndrome and may reflect hyperandrogenism. Fertil Steril, 1995；64(6):1099～1103
1999-06-08收稿，1999-09-14修回, 百拇医药
单位：曹云霞 安徽医科大学第一附属医院妇产科，合肥 230022；庄广伦 中山医科大学第一附属医院妇产科，广州 510089；汪 渊 周 青 刘 虎 安徽医科大学分子生物学实验室，合肥 230032
关键词：肽基二肽酶A；多态现象(遗传学)；多聚酶链反应；汉族；女(雌)性
安徽医科大学学报990608摘要 目的 建立血管紧张素转换酶(ACE)基因型的分型方法，了解正常汉族女性ACE基因的多态性及频率分布。方法 应用多聚酶链反应(PCR)对30例正常汉族女性ACE基因进行分型并介绍该实验方法和操作。结果 正常汉族女性ACE基因有II(插入型)、DD(缺失型)、DI(杂合子)三种基因型，分别占56.7%、10%、33.3%,I等位基因频率为73.3%,D等位基因频率为26.7%。结论 PCR是检测ACE基因多态性的一种快速、简便的方法。
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中国图书资料分类法分类号 R392.2；R345
Polymorphism of the angiotensin-converting anzyme
in normal Chinese women
Cao Yunxia，Zhuang Guanglun， Wang Yuan et al
(Dept of Grynecology and Obstetrics,The First Affiliated
Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022)
Abstract Objective To establish a genotyping method for angiotensin-converting enzyme (ACE) gene and detect insertion/deletion (I/D)polymorphism of ACE in normal Chinese women. Methods Polymerase chain reaction (PCR) technique were employed to typing ACE gene of 30 normal women. Results The distribution of the II、DI、DD genotypes were 56.7%、33.3% and 10% respectively. The frequency of the I allele was 73.3%, and D allele 26.6%. Conclusion PCR technique is a rapid and simple method to detect polymorphism of ACE gene.
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MeSH peptidyl-dipeptidase A; polymorphism/genetics; polymerase chain reaction;han nationality; female
血管紧张素转换酶(ACE)是肾素-血管紧张素系统的关键酶，它使血管紧张素Ⅰ(ATⅠ)转换为血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)而发挥作用。目前研究表明：肾素-血管紧张素系统(RAS)功能亢进，与女性多囊卵巢综合症(Pcos)及与此相关的非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)和心血管疾病密切相关，ACE是这一系统的关键酶，此酶受控于ACE基因，因此，将ACE基因作为候选基因进行研究。ACE基因位于人染色体17q23,其第16内含子中存在一段长度为287bp的插入片段，由于此片断的插入和缺失(I/D),产生Ⅱ(插入型)、DI(杂合子)及DD(缺失型)三种基因型〔1〕。本研究采用PCR方法对30例正常女性ACE基因多态性进行检测，以了解ACE基因型在正常女性中的分布情况。
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1 资料与方法
1.1 主要试剂和仪器 引物(由Life Technologies 公司合成)， TaqDNA，dNTP,MgCl2,PCR缓冲液，蛋白酶K,DNA Marker(购自华美生物工程公司)，Hema 480基因扩增仪(珠海黑马医学仪器有限公司产品)。
1.2 研究对象 30例标本取自安徽医科大学附院健康志愿者，年龄19～38岁，未婚10例，已婚并生育20例，体重指数(BMI=体重/身高2)<25，血压及月经周期正常，无多毛、痤疮，无糖尿病及心血管病家族史，无内分泌疾病，均为汉族。每人取全血5 ml放入肝素钠抗凝管中备用。
1.3 实验方法
1.3.1 模板DNA的制备 将抗凝血4 000 r.min-1离心5 min,吸取白细胞层以低渗溶血法〔2〕去除红细胞,离心得白细胞,将白细胞沉淀溶解在100 μl的DNA缓冲液(KCl,Tris-HCl,MgCl2,NP 40,Tween 20,蛋白酶K)中, 55℃孵育3 h, 95℃灭活10 min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀基因组DNA，干燥后溶于100 μl d H2O中备用。
, 百拇医药
1.3.2 PCR反应 参照Tiret等〔3〕引物设计方法，正义寡核甘酸引物序列：5′CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT 3′，反义寡核甘酸引物序列：5′GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT 3′。采用25 μl反应体系，在100 ng标本DNA模板液中分别加入PCR反应液(10 mmol.L-1 Tris,50 mmol.L-1 KCl, 2 mmol.L-1 MgCl2, 200 mmol.L-1 dNTPs,0.5 μmol.L-1引物及Taq DNA聚合酶)。置Hema480基因扩增仪中，97℃预变性5 min；95℃变性1 min；60℃退火1 min；72℃延伸1 min，共35个循环。
1.3.3 PCR产物的检测 取PCR产物8 μl, 加入含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳(60 mV,30 min),经紫外透射下检测，PCR Marker作为参照，进行多态性分析。
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2 结果
正常女性ACE基因型共3种，见图1。
*在300 bp处一条暗带可能为非特异性扩增所致
图1 纯合子插入型(II): 在490bp处出现一条带，纯合子缺失型(DD):在190bp处出现一条带，杂合子(DI):在490bp及190bp处分别出现一条带(两条带)
统计结果分析：II型17例，频率为56.7%, DI型10例，频率为33.3%, DD型3例，频率为10%，I等位基因频率为73.3%, D等位基因频率为26.7%。
3 讨论
正常人ACE D、I等位基因频率有明显的种族差异，在意大利、挪威等国家，D型约占54%，I型约占46%〔4〕。亚洲人，I型所占比例相对较高，日本人D型占31%，I型占69%〔5〕。我们研究结果，正常汉族女性ACE基因型中以II型为多(56.7%)，I等位基因频率占73.3%，D等位基因频率占26.7%,与日本人相近。
, http://www.100md.com
1990年Rigat等〔6〕首先观察到了ACE基因多态性与血清血管紧张素转换酶(sACE)间的关系，此后陆续有报道ACE基因多态性与心血管疾病的关系,尤其是D等位基因可能是冠心病、高血压病发病的危险因子〔7〕。在多囊卵巢综合征(Pcos)病人，表现为RAS功能亢进〔8〕，其活性物质(ATⅡ)调节卵巢性激素合成，主要表现为睾酮(T)和孕酮(P)增加，雌二醇(E2)下降，即促进高雄激素血症形成，引起卵泡发育障碍，且研究已表明Pcos标志着非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的一个主要危险因素，将来有更大的危险性发展成心血管疾病。因此，我们建立正常汉族女性ACE基因多态性研究的方法，对进一步研究ACE基因多态性与Pcos病人不排卵及高雄激素血症的关系, 尤其是早期预测及预防由Pcos引起的NIDDM 及心血管疾病都有重大意义。
作者简介：曹云霞，女，36岁，博士生，副主任医师，副教授；
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庄广伦，男，62岁，博士生导师，教授
参考文献
1 Rigat B, Hubert C, Corvol P et al. PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin-converting enzyme gene. Nucl Acids Res, 1992；20(5):1433
2 王申五主编. 基因诊断技术. 北京: 北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社, 1992:36～37
3 Tiret L, Riget B, Visviks S et al. Evidence, from combined segregation and linkage analysis, that a variant of the angiotensin-Ⅰ-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels. Am J Hum Genet, 1992；51(1):197～200
, 百拇医药
4 Cambien F, Poirier O, Lecerf L et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature, 1992；359(6396):641
5 Furuya K, Yamaguchi E, Itoh A et al. Reevaluation of serum enzyme levels in sarcoidosis by a polymorphism of the angiotensin-Ⅰ-converting enzyme gene (Abstract). Am Rev Respir Dis, 1993；147(5):A787
6 Rigat B, Hubert C, Alhens-Gelas F et al. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin-Ⅰ-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest, 1990；86(4):1343～1347
, http://www.100md.com
7 Mattu PK, Needbam EWA, Galton DJ et al. A DNA variant at the angiotensin-converting enzyme gene locus associates with coronary artery disease in the Caerphilly Heart Study. Circulation， 1995；91(2):270～273
8 Morris RS, Wong IL, Hatch IE et al. Prorenin is elevated in polycystic ovary syndrome and may reflect hyperandrogenism. Fertil Steril, 1995；64(6):1099～1103
1999-06-08收稿，1999-09-14修回, 百拇医药